不同补肾法诱导的骨髓间充质干细胞_省略_脑梗死大鼠神经功能恢复的促进作用
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不同补肾法诱导的骨髓间充质干细胞对脑梗死大鼠神经功能恢复的促进作用颜春鲁,刘永琦,苏韫,张毅,聂蕾,薛娜,杨玥甘肃中医学院,甘肃 兰州 730000摘要：目的 探讨不同补肾法诱导的骨髓间充质干细胞(BMSCs)对脑梗死大鼠神经功能恢复的影响。
方法 用线栓法制备大鼠大脑中动脉梗死(MCAO)模型,随机分为假手术组、模型组、单纯BMSCs移植组及左归丸、右归丸、地黄饮子、维甲酸诱导BMSCs移植组。
移植后3、7、14 d进行大鼠神经功能综合测评,于移植后7、14 d处死大鼠,采用TTC染色法测定脑梗死面积,并采用免疫组化方法检测脑组织神经突触素(syn)的表达。
结果 与模型组比较,各移植组7、14 d的神经功能评分均显著增高(P＜0.05),脑梗死面积均显著缩小(P＜0.05),syn阳性细胞数均明显增加(P＜0.05)。
结论 不同补肾法诱导BMSCs能够促进脑梗死大鼠神经功能的恢复,且补阴和阴阳双补方药诱导BMSCs 组的作用优于补阳类方药。
关键词：补肾法；骨髓间充质干细胞；脑梗死；神经功能；大鼠DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.03.015中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304(2013)03-0036-04Neural Functional Recovery of Cerebral Infarction Rats Promoted by BMSCs Induced by Different Kidney-nourishing Methods YAN Chun-lu, LIU Yong-qi, SU Yun, ZHANG Yi, NIE Lei, XUE Na, YANG Yue (Gansu College of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China)Abstract：Objective To explore neural functional recovery of cerebral infarction rats promoted by bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) induced by kidney-nourishing methods. Methods Middle cerebral artery occlusion (MCAO) model was made and rats were randomly divided into psudo-operation group, model group, BMSCs transplantation group and Zuoguiwan-, Youguiwan-, Dihuangyinzi-, retinoic acid-induced BMSCs transplantation group. On the 3rd, 7th, 14th day after transplantation, neural function of the rats was comprehensively tested. On the 7th, 14th day after transplantation, the rats were executed. TTC dying method was used to determine the cerebral infarction area, and immunohistochemical method was used to test brain tissue synaptophysin expression. Results Compared with the indexes of model group, on 7th, 14th day, neurofunction score of each transplantation group was significantly increased (P＜0.05), cerebral infarction area of each transplantation group was significantly reduced (P＜0.05), and synaptophysin positive cells of each transplantation group were significantly increased (P＜0.05). Conclusion BMSCs induced by different kidney-nourishing method can promote neural function recovery of cerebral infarction rats. The effects of yin-nourishing and yinyang-nourishing prescriptions are better than yang-nourishing prescription.Key words：kidney-nourishing methods；BMSCs；cerebral infarction；neural function；rats目前,治疗脑梗死的方法主要有内科药物、外科手术及血管内治疗等,但均不能获得满意的疗效。
因此,考虑通过干细胞移植的方法重建神经通路,恢复或改善神经功能障碍成为近年来医学领域备受关注的研究热点。
骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是骨髓中除造血干细胞以外的另一类干细胞,不但取材容易,还具有很好的增殖能力,并且具有向脂肪、成骨、软骨、肌肉、神经等各胚层组织细胞分化的能力。
本实验采用线栓法制备大鼠大脑中动脉梗死(MCAO)模型,不同补肾法诱导BMSCs移植治疗脑梗死,探讨其基金项目：国家自然科学基金(81060351/H2810)；甘肃省教育厅科研基金(0906-03) 促进脑梗死后神经功能恢复的作用,为中西医结合治疗脑梗死提供实验依据。
1 实验材料1.1 动物提取BMSCs的动物：SPF级Wistar大鼠15只,雌雄不限,体质量(120±10)g；制备含药血清动物：SPF级Wistar大鼠40只,雌雄不限,体质量(250±20)g；造模动物：SPF级Wistar 大鼠60只,雌雄各半,体质量(300±30)g。
以上动物皆由甘肃中医学院实验动物中心提供,动物合格证号：SCXK(甘)2004- 0006。
1.2 药物、试剂与仪器L-DMEM培养基(Gibco Invitrogen Corporation,批号1240031),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司,批号090123),0.25%胰酶(Sigma),L-谷氨酰胺(上海新兴医药保健品科技开发中心,批号991085),全反式维甲酸RA(Sigma),CD45荧光标记抗体(Gibco),CD90荧光标记抗体(Gibco),2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC,WOLSEN公司,批号0765),小鼠抗大鼠神经突触素(syn)单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司,批号200906)。
二氧化碳培养箱(SANYO Electric Co.Ltd,型号MOA-18ALC),超净工作台(苏州净化仪器厂,型号SW-CJ-2FD),流式细胞仪(美国贝克曼公司)。
2 实验方法2.1 骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定采用全骨髓贴壁筛选法分离培养、纯化BMSCs,经流式细胞仪检测BMSCs表面标志CD90及造血干细胞表面标志CD45的表达率。
2.2 中药药物血清制备40只Wistar大鼠,随机分为空白组、左归丸组(补益肾阴法代表方药)、地黄饮子组(阴阳双补法代表方药)和右归丸组(补益肾阳法代表方药)。
晚禁食,第2日,空白组给予生理盐水,其余组给予药液(剂量按1 g/100 g大鼠体质量),2次/d,连续3 d。
于第3日给药后2 h从股动脉取血,3 000 r/min离心10 min,分离血清,56 ℃灭活30 min,0.22 µm滤器过滤除菌,分装,-20 ℃保存备用。
2.3 药物血清孵育将已纯化的BMSCs(F3代)接种至培养瓶中,待细胞70%～80%融合后,弃完全培养液,随机分组,分别用含10%左归丸、右归丸、地黄饮子药物血清和维甲酸的L-DMEM培养液孵育,连续培养3 d。
将诱导的BMSCs用0.25%胰酶消化,待细胞变形、间隙增大,加入含10%胎牛血清的L-DMEM中止消化,磷酸盐缓冲液轻洗,吹打成1×106个/mL细胞悬液,备用。
2.4 造模健康Wistar大鼠60只参照文献[1]方法建立Wistar大鼠MCAO模型。
10%水合氯醛腹腔麻醉(0.3 mL/100 g)后,将大鼠于颈部正中切开皮肤,结扎颈外动脉远端后,于其近端插入直径0.25 mm尼龙线,将尼龙线缓慢向颅内推进,进线约18 mm 左右,略感阻力,即到大脑中动脉起始部,阻断右侧大脑中动脉2 h后,将尼龙线拔至颈外动脉残端,剪断尼龙线,缝合皮肤切口。
另选8只大鼠作为假手术组对照,仅分离左侧血管和神经,结扎颈外动脉远端,不插入尼龙线,即缝合皮肤切口。
MCAO后24 h进行大鼠神经功能评分,参考Longa及Bederson[2]评定神经功能缺损程度的5级4分法标准进行评分。
0分：无神经系统症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：爬行时转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自行行走,意识丧失。
评分为1～3分者提示模型成功,可按预定方案给予相应的干预措施。
2.5 药物血清孵育骨髓间充质干细胞的移植实验大鼠随机分为假手术组、模型组、单纯BMSCs移植组及左归丸、右归丸、地黄饮子、维甲酸诱导BMSCs移植组,各组大鼠于造模24 h后,取F3代经不同补肾类中药和维甲酸孵育的各组BMSCs,用胰酶消化,加入含10%胎牛血清L-DMEM中止消化,用等渗PBS液吹打成细胞悬液,1 500 r/min离心5 min,弃上清液,再加入等渗PBS液,吹打成细胞悬液,让细胞充分、均匀悬浮于培养液中,进行细胞计数,将细胞浓度调至约2×106个/L。
再取细胞悬液约1 mL于模型大鼠尾静脉注射。
2.6 移植后大鼠神经功能综合测评神经功能测评方法按文献[3-5]从自发运动、轻瘫实验、角膜反射、耳道反射、痛觉、霍纳征6个方面进行,总分为18分,症状越重,得分越少。
神经功能测评时间在术后3、7、14 d 进行。
