小鼠气道杯状细胞钙激活氯离子通道胞外段基因的克隆及表达
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・论著・文章编号:1007-8738(2004)03-0340-04小鼠气道杯状细胞钙激活氯离子通道胞外段基因的克隆及表达宋立强1,李 妍2,戚好文1,王吉村3(第四军医大学:1西京医院呼吸内科;2西京医院心脏内科;3基础部生物化学与分子生物学教研室,陕西西安710032)收稿日期:2003-08-11; 修回日期:2004-01-08基金项目:陕西省科学技术研究发展计划基金(N o.2003K 10G 55);西安市社会发展计划基金资助项目(N o.SF200337)作者简介:宋立强(1970-),男,山西长治人,主治医师,博士生.T el :(029)83375237;Email :s onglq @C loning and expression of the extracellu 2lar dom ain of calcium 2activated chloride ch annel in mouse airw ay goblet cellsSONG Li 2qiang 1,LI Yan 2,QI Hao 2wen 1,W ANG Ji 2cun31Department of Respiratory Medicine ;2Department of Cardiology ,X i 2jing H ospital ;3Department of Biochemistry and M olecular Biology ,Faculty of Preclinical Medicine ,F ourth Military Medical University ,X i ’an 710032,ChinaAbstractAIM :T o clone and expre ss the extracellular domain of murine calcium 2activated chloride channel (mC LCA3)in airway goblet cell of mouse.METH ODS :According to the gene sequence of mC LCA3the PCR primers for N 2terminal ,middle and C 2terminal extracellular domains were de ing recombinant pla s 2mid pcDNA3.1(-)/mC LCA3a s template ,the DNAs coding for the three extracellular domains were amplified.And then the DNAs encoding N 2terminal and C 2terminal extracellular domains were inserted into expre ssion vector pRSET 2A ,while the middle extracellular domain DNA wa s inserted into p GEX 2T1. E.coli.BL21(DE3)were transformed with the three recombinant pla s 2mids ,re spectively ,and were induced with IPTGfor expre ssion.RESU LTS :DNA sequencing showed that the cloned DNAs en 2coding extracellular domains were identical with tho se in Gen 2Bank (GenBank acce ssion No.NM 2017474).The 3domains were expressed in E.coli and most of the expressed products ex 2isted in the form of inclusion body.CON C LU SI ON:The expre s 2sion of three extracellular domains of mC LCA 3lays the founda 2tion for further preparing anti 2mC LCA3antibody and exploring the mechanism of modulation of mC LCA 3.K eyw ords :calcium 2activated chloride channel ;a sthma ;airway ;goblet cell摘要目的:克隆并表达小鼠气道杯状细胞的特定钙激活Cl 2通道(mC LC A3)。
方法:根据G enBank (N o.NM 2017474)的信息,设计针对mC LC A3的3个胞外段基因的引物。
以重组质粒pcD 2NA3.1(-)/mC LC A3为模板,PCR 法扩增3个胞外段的基因。
将N 端和C 端胞外段基因分别亚克隆到原核表达载体pRSET 2A 中,中间胞外段基因则亚克隆入原核表达载体p GEX 2T 1中。
分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,使用IPTG 诱导表达。
结果:酶切鉴定和序列分析表明,克隆的mC LC A3的3个胞外段基因序列与G enBank 中登录的完全一致。
将这些基因亚克隆到相应表达载体,经IPTG 诱导在大肠杆菌中获得表达,并且表达产物主要以包涵体的形式存在。
结论:获得了mC LC A3抗原分子胞外段基因及其原核表达产物,对进一步制备单克隆抗体,探讨mC LC A3的通道调控机制具有重要意义。
关键词:钙激活氯离子通道;哮喘;气道;杯状细胞中图分类号:Q786 文献标识码:A 钙激活Cl 2通道(calcium 2activated chloride channel ,C LC A )是新近发现的一个跨膜阴离子通道家族。
其中小鼠mC LC A3和人hC LC A1是一对异种同源通道蛋白。
最新研究表明,这两种蛋白在气道上皮杯状细胞异常的高表达,分别是哮喘小鼠模型或哮喘患者发病的关键环节123。
Zhou 等4采用mC LC A3的化学通道阻断剂尼氟灭酸(niflumic acid ,NFA )对哮喘小鼠进行干预研究,发现NFA 能显著减轻气道的慢性炎症、杯状细胞化生和黏液高分泌等病理改变。
提示阻断mC LC A3是防治哮喘的有效途径之一。
NFA 是欧洲儿童临床使用的一种镇痛消炎药,副作用大,对mC LC A3的阻断也不够特异。
因此,探讨mC LC A3通道调控机制,寻找特异性抗体阻断方案有着现实意义。
我们拟克隆和表达mC LC A3的胞外段,为针对该段抗体的制备准备免疫原。
mC LC A3是4次跨膜糖蛋白,共有3个胞外段,分别称为氨基端胞外段(N 2terminal extracellular do 2main ,N 2E D )、中间胞外段(middle extracellular domain ,M 2E D )和羧基端胞外段(C 2terminal extracellular domain ,C 2E D )。
虽然小鼠气道中还存在mC LC A1,但其在哮喘病理过程中表达无变化5。
为突出mC LC A3胞外段免疫原性的特异性,利用EXPACY2SWISS M ODE L2 I NG分子模拟服务器,分析这两种蛋白胞外段的差异区域,最终确定欲克隆mC LC A3的N2E D、M2E D和C2 E D氨基酸残基,分别位于E83～E279、N446～I508和S684～Q912。
1 材料和方法1.1 主要材料 大肠杆菌JM109、BL21(DE3)及表达载体pRSET2A和p GEX2T1,均由本校生物化学与分子生物学教研室提供。
含mC LC A3cDNA的重组质粒pcDNA3.1(-)/mC LC A3,由美国Levitt RC教授惠赠。
IPTG系Sigma公司产品。
γ2Taq DNA多聚酶、T4DNA 连接酶及限制性内切酶Nhe I、Hin dⅢ、Bam H I、Eco R I,均购自T akara公司。
1.2 方法1.2.1 引物的设计与合成 根据G enBank(No.NM2 017474)报告小鼠mC LC A3的DNA序列,利用DNA Club生物软件,设计引物,扩增mC LC A3的3个胞外段cDNA。
N2E D的上游引物P1为:5′2ATTTTG ATTC2 CCG AG AG CTGG A23′;下游引物P2为:5′2CCC ACG T2 G CTTCGG AG TTTG C23′,扩增长度为591bp。
M2E D的上游引物P1为:5′2G CT AAAG AG CTTG AG C AG CT23′;下游引物P2为:5′2C ATCC ATTGG TT ATTCTGG AG23′,扩增长度为186bp。
C2E D的上游引物P1为:5′2 GG AGG AG TC ACTTC AG AC AG A23′;下游引物P2为:5′2 TC AG TG C AAACCT AG TG TC A23′,扩增长度为687bp。
3对引物中5′端分别引入Bam H I和Eco R I酶切位点。
以上引物均由赛百胜生物工程公司合成。
1.2.2 重组质粒pcDNA3.1(-)/mC LC A3的鉴定 将赠送质粒溶解于2μL双蒸水,然后转化100μL感受态大肠杆菌JM109,在含氨卞青霉素(50mg/L)的LB培养基平皿上培养。
挑选生长良好的克隆,摇菌,小量提取质粒。
经Nhe I和Hin dⅢ双酶切鉴定,回收大小正确的条带进行测序。
测序反应由上海生工生物工程公司完成。
1.2.3 mC LC A3胞外段基因的扩增 取0.5μL pcD2 NA3.1(-)/mC LC A3作为模板,分别加入1μL胞外段N2E D、M2E D和C2E D的引物,进行PCR扩增。
反应条件均为:94℃变性5min,在1min时加入γ2Taq DNA多聚酶0.5μL;然后按下述参数循环25次: 94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸50s;最后72℃延伸7min。
取PCR产物5μL,在10g/L琼脂糖凝胶进行电泳分析。
测序鉴定。
1.2.4 mC LC A3胞外段重组质粒的构建 分别取N2E D、M2E D和C2E D基因的PCR扩增片段,用Bam H I和Eco R I进行双酶切,并将切出的片段纯化。
将N2E D 和C2E D基因与经同样酶切的表达载体pRSET2A连接,构建重组质粒pRSET2A/N2E D和pRSET2A/C2E D;考虑到M2E D片段的M r过小,为检测与纯化便利,将该基因亚克隆入同样酶切的融合表达载体p GEX2 T1,构建质粒p GEX2T1/M2E D。
