第32卷 第3期V o l .32 No .3草 地 学 报A C T A A G R E S T I A S I N I C A2024年 3月M a r . 2024d o i :10.11733/j.i s s n .1007-0435.2024.03.030引用格式:意如乐,格根图,王志军,等.响应面法优化火绒草中总黄酮与总酚酸的提取工艺研究[J ].草地学报,2024,32(3):935-944Y IR u -l e ,G EG e n -t u ,WA N GZ h i -j u n ,e t a l .S t u d y o n t h eE x t r a c t i o nP r o c e s s o fT o t a l F l a v o n o i d s a n dT o t a l P h e n o l i c A c i d s i n L e o n t o p o d i u m l e o n t o po d i o i d e s (W i l d .)B e a u v [J ].A c t aA g r e s t i aS i n i c a ,2024,32(3):935-944响应面法优化火绒草中总黄酮与总酚酸的提取工艺研究意如乐1,格根图1*,王志军1,胡日查2,百 岁2,塞西雅拉图3(1.内蒙古农业大学草原与资源环境学院,农业农村部饲草栽培㊁加工与高效利用重点实验室,内蒙古呼和浩特010019;2.克什克腾旗林业和草原局,内蒙古赤峰025300;3.克什克腾旗绿色驿站环境保护监测站,内蒙古赤峰025300)收稿日期:2023-09-19;修回日期:2023-11-26基金项目:财政部和农业农村部:国家牧草产业技术体系(C A R S -34)资助作者简介:意如乐(1999-),女,蒙古族,内蒙古赤峰人,硕士研究生,主要从事牧草加工与利用方向研究,E -m a i l :yi r u l e 1207@126.c o m ;*通信作者A u t h o r f o r c o r r e s p o n d e n c e ,E -m a i l :g e ge n t u @163.c o m 摘要:为探究野生火绒草(L e o n t o p o d i u m l e o n t o p o d i o i d e s (W i l d .)B e a u v )总黄酮与总酚酸最佳提取工艺及抗氧化活性,本试验采用快速溶剂萃取法探索萃取温度㊁循环次数㊁加热时间及萃取压力对火绒草总黄酮㊁总酚酸提取含量的影响,通过单因素试验和响应面设计法确定了活性物质的最佳提取工艺㊂结果表明:当使用70%乙醇提取火绒草中总黄酮时最佳提取工艺为:萃取温度93ħ,循环次数3次,加热时间20m i n ,萃取压力102b a r,提取含量为(45.45ʃ0.36)m g㊃g -1;总酚酸最佳提取工艺为:萃取温度90ħ,循环次数3次,加热时间19m i n ,萃取压力97b a r ,提取含量为(23.52ʃ0.34)m g ㊃g -1㊂火绒草总黄酮提取液对D P P H 自由基和A B T S 自由基的I C 50为0.012m g ㊃m L -1和0.356m g ㊃m L -1,具有一定的还原力㊂本研究可为火绒草活性物质的提取工艺及加工利用提供可靠的理论依据和详实的科学参考㊂关键词:火绒草;总黄酮;总酚酸;快速溶剂萃取;响应面法优化;抗氧化活性中图分类号:P 746.2+2 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2024)03-0935-10S t u d y on t h eE x t r a c t i o nP r o c e s s o fT o t a l F l a v o n o i d s a n dT o t a l P h e n o l i cA c i d s i n L e o n t o p o d i u m l e o n t o po d i o i d e s (W i l d .)B e a u v Y IR u -l e 1,G EG e n -t u 1*,WA N GZ h i -ju n 1,HU R i -c h a 2,B A I S u i 2,S A IX iY aL a -t u 3(1.K e y L a b o r a t o r y o fF o r a g eC u l t i v a t i o n ,P r o c e s s i n g a n dH i g hE f f i c i e n tU t i l i z a t i o no fM i n i s t r y o fA g r i c u l t u r e ,C o l l e ge of G r a s s l a n dR e s o u r c e s a n dE n v i r o n m e n t ,I n n e rM o ng o l i aA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,H oh h o t ,I n n e rM o n g o li a 010019,C h i n a ;2.F o r e s t r y a n dG r a s s l a n dB u r e a uo fK e s h i k e t e n g B a n n e r ,C h i f e n g ,I n n e rM o n g o l i a 025300,C h i n a ;3.G r e e nS t a t i o n E n v i r o n m e n t a l P r o t e c t i o n M o n i t o r i n g S t a t i o no fK e s h i k e t e n g B a n n e r ,C h i f e n g ,I n n e rM o n g o l i a 025300,C h i n a )A b s t r a c t :I no r d e r t o e x p l o r e t h e o p t i m a l e x t r a c t i o n p r o c e s s a n d a n t i o x i d a n t a c t i v i t y of t o t a l f l a v o n o i d s a n d t o t a l p h e n o l i ca c i d si n w i l d L e o n t o p o d i u ml e o n t o po d i o i d e s ,t h ee f f e c t so fe x t r a c t i o nt e m p e r a t u r e ,c y c l e t i m e s ,h e a t i n g ti m e a n d e x t r a c t i o n p r e s s u r e o n t h e e x t r a c t i o nc o n t e n t o f t o t a l f l a v o n o i d s a n d t o t a l p h e n o l i c a c i d s i n L e o n t o p o d i u ml e o n t o po d i o i d e s w e r ee x p l o r e db y r a p i ds o l v e n t e x t r a c t i o n ,a n d t h eo p t i m a l e x t r a c -t i o n p r o c e s s o f a c t i v e s u b s t a n c e sw a s d e t e r m i n e db y t h e s i n g l e -f a c t o r e x p e r i m e n t a n d t h e r e s p o n s e s u r f a c e d e s i g n .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e o pt i m a l e x t r a c t i o n p r o c e s s f o r t h e e x t r a c t i o no f t o t a l f l a v o n o i d s i n L e -o n t o p o d i u ml e o n t o po d i o i d e s u s i n g 70%e t h a n o lw a s 93ħe x t r a c t i o n t e m p e r a t u r e ,3t i m e s ,20m i n e x t r a c t i o n t i m e ,a n d 102b a r e x t r a c t i o n p r e s s u r e .E x t r a c t i o nc o n t e n tw a s (45.45ʃ0.36)m g ㊃g -1.T h eb e s t e x t r a c -t i o n p r o c e s s o f t o t a l p h e n o l i c a c i dw a s 90ħe x t r a c t i o nt e m pe r a t u r e ,3t i m e s ,19m i ne x t r a c t i o n ,a n d97b a r e x t r a c t i o n p r e s s u r e .E x t r a c t i o n c o n t e n tw a s (23.52ʃ0.34)m g ㊃g -1.T h e I C 50o f L e o n t o p o d i u m l e o n t o po -d i o i d e s t o t a l f l a v o n o i d e x t r a c t a g a i n s tD P P Hr a d i c a l s a n dA B T S r a d i c a l sw e r e 0.012m g㊃m L -1a n d 0.356草地学报第32卷m g㊃m L-1,r e s p e c t i v e l y.I t h a da c e r t a i nr e d u c i n gp o w e r.T h i s s t u d yp r o v i d e da r e l i a b l e t h e o r e t i c a l b a s i s a n dd e t a i l e d s c i e n t i f i c r e f e r e n c e f o r t h e e x t r a c t i o n p r o c e s s a n d p r o c e s s i n g a n du t i l i z a t i o no f t h e a c t i v e s u b-s t a n c e o f L e o n t o p o d i u ml e o n t o p o d i o i d e s.K e y w o r d s:L e o n t o p o d i u m l e o n t o p o d i o i d e s(W i l d.)B e a u v;T o t a l f l a v o n o i d s;T o t a l p h e n o l i c a c i d s;A c c e l e r a t e d s o l v e n t e x t r a c t i o n;R e s p o n s e s u r f a c em e t h o do p t i m i z a t i o n;A n t i o x i d a n t a c t i v i t y火绒草(L e o n t o p o d i u m l e o n t o p o d i o i d e s (W i l d.)B e a u v.)是菊科火绒草属(L e o n t o p o d i u m)多年生草本植物[1],广泛分布于世界各地,常见于欧洲和亚洲的寒带㊁温带和亚热带地区[2]㊂在我国约有41种火绒草属植物,主要分布于我国的东北㊁西北㊁华北和西南地区,其中有20多种在民间作为药用植物[3]㊂近年来有关火绒草化学成分及其药理活性研究较多,从火绒草属中发现了多种具有药理活性的化合物㊂如黄酮类㊁苯丙素类㊁葡萄糖二酸类等化合物[4-5]㊂现已将火绒草提取物用于治疗腹部疾病㊁心脏病㊁腹泻㊁痢疾㊁肺炎㊁扁桃体炎和各种癌症等多种人类和牲畜疾病,其中具有主要药理活性的成分是黄酮类及酚酸类物质[6-7],绿原酸和阿魏酸等成分具有明显抗氧化作用[8]㊂目前,人们通常使用热回流提取法㊁超声波辅助提取法㊁二氧化碳超临界流体萃取法等方法来萃取火绒草中的活性物质[9-10],但上述方法存在效率低㊁时间长㊁不环保等问题㊂本试验中使用的快速溶剂萃取法是一种新型提取技术,在高温高压条件下使用有机溶剂萃取固体或半固体样品的一种全自动萃取技术,具有成本低㊁萃取率高㊁萃取时间短㊁萃取纯度高㊁绿色环保等优点[11-12]㊂近年来,随着活性物质提取工艺的发展,该技术已逐渐应用到提取多酚㊁多糖类化合物当中[13]㊂孙海燕等[14]采用快速溶剂萃取法及正交试验对樱桃(P r u n u s p s e u d o c e r a s u s L i n d l.)核中类黄酮提取工艺进行优化;王国明等[15]研究发现使用快速溶剂萃取法萃取人参(P a n a x g i n s e n g C.A.M e y.)多糖得率高于传统的水提法㊂本研究以野生火绒草为原料,采用快速溶剂萃取法探究萃取时间㊁循环次数㊁加热时间及萃取压力等参数对总黄酮与总酚酸影响,通过响应面法对提取工艺进行优化,为火绒草开发利用提供详实的资料㊂1材料与方法1.1试验材料供试火绒草样品于2022年8月取自内蒙古自治区赤峰市克什克腾旗,经鉴定为菊科火绒草属长叶火绒草(L e o n t o p o d i u m j u n p e i a n u m K i t a m.),将样品阴干,用粉粹机磨成粉,过60目筛后备用㊂1.2供试品溶液制备精密称取火绒草3g,置于40m L萃取池中,加入一定量的石英砂,以70%乙醇作为提取溶剂,按一定条件进行萃取,过滤,用70%乙醇定容至50 m L,即得供试品溶剂,冷藏保存,备用㊂1.3总黄酮含量检测方法参照Z h i等[16-18]方法,稍作修改㊂取200μL不同浓度的芦丁对照品与40μL质量分数为5%的N a N O2溶液反应6m i n后加入40μL质量分数10%的A l(N O3)3溶液,放置6m i n,再加入400μL1m o l㊃L-1的N a O H和400μL的蒸馏水,摇匀,放置15m i n后,在510n m处测定吸光度㊂以质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,构建标准曲线方程㊂得线性回归方程: y=5.9056x-0.0025R2=0.9994取200μL供试溶剂,按标准曲线方法检测供试溶剂总黄酮吸光度,参照公式计算出总黄酮含量㊂M=(CˑVˑn)/m式中M为黄酮含量,单位:m g㊃g-1;C为浓度,单位:m g㊃m L-1;V为体积,单位:m L;n为倍数;m为质量,单位:g㊂1.4总酚酸含量检测方法参照N a i d u等[19-20]方法,稍作修改㊂取200μL 不同浓度没食子酸标品与0.5m L F o l i n-C i o c a l t e u 试剂充分混匀,5m i n后加入1.5m L质量分数为20%的N a C O3溶液,蒸馏水定容至10m L,置于75ħ水浴中避光反应10m i n,在765n m处测定吸光度值㊂以质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,构建标准曲线方程㊂得线性回归方程:y=49.229x+0.0075R2=0.9991取200μL供试溶剂,按标准曲线方法检测供试溶剂总酚酸吸光度,参照公式计算出总酚酸含量㊂M=(CˑVˑn)/m式中M为黄酮含量,单位:m g㊃g-1;C为浓度,单位:m g㊃m L-1;V为体积,单位:m L;n为倍数;m为质量,单位:g㊂639第3期意如乐等:响应面法优化火绒草中总黄酮与总酚酸的提取工艺研究1.5 抗氧化活性测定1.5.1 D P P H 自由基清除试验 参照W a n g 等[21]方法,取1.5m L 不同浓度的火绒草提取液(0.02,0.04,0.06,0.08,0.1m g ㊃mL -1)与0.75m L 的0.1m o l ㊃m L -1D P P H 溶液充分混匀,避光反应30m i n 后以无水乙醇作为空白在517n m 处测定吸光度,得A 1㊂取1.5m L 不同浓度的火绒草提取液与0.75m L 无水乙醇混匀,避光反应30m i n 后在517n m 处测定吸光度,得A 2㊂取1.5m L 无水乙醇与0.75m L 的0.1m o l ㊃m L -1D P P H 溶液混匀,避光反应30m i n 后在517n m 处测定吸光度,得A 0㊂以抗坏血酸作为阳性对照㊂根据吸光值计算D P P H清除率,并计算火绒草对D P P H 自由基的半数清除率I C 50㊂D P P H 自由基清除率%=[1-(A 1-A 2)/A 0]ˑ100%1.5.2 A B T S 自由基清除试验 参照L i a n g 等[22]方法,取3.9m L 的A B T S 反应液分别加入100μL 不同浓度的火绒草提取液(0.02,0.04,0.06,0.08,0.1m g ㊃m L -1)A 2或100μL 无水乙醇溶液A 1,避光反应30m i n 后,在734n m 处测定吸光值㊂以抗坏血酸作为阳性对照㊂根据吸光值计算A B T S 清除率,并计算火绒草对A B T S 自由基的I C 50㊂A B T S 自由基清除率%=[(A 1-A 2)/A 1)]ˑ100%1.5.3 总还原力测定试验 参照刘秀敏等[23]方法,稍作修改㊂取1m L 不同浓度的供试溶剂分别加入0.2m L 浓度为0.2m o l㊃L -1的磷酸盐缓冲溶液(p H6.6)和0.5m L 质量分数为5%的氢化钾,摇匀后置于50ħ水浴中反应20m i n ㊂反应结束后迅速冷却,加入1m L 质量分数为10%三氯乙酸后在5000r ㊃m i n -1下离心10m i n ,取1.5m L 上清液加入0.2m L 质量分数为1%的F e C l 3和3m L 蒸馏水静置10m i n 后在700n m 处测定吸光度,以抗坏血酸作为阳性对照㊂吸光值越大表示样品还原力越强㊂1.6 火绒草总黄酮、总酚酸提取的单因素试验采用快速溶剂萃取仪提取火绒草中总黄酮与总酚酸,主要考察萃取温度(45ħ,60ħ,75ħ,90ħ和105ħ)㊁循环次数(1,2,3,4和5次)㊁提取时间(5,10,15,20和25m i n )和萃取压力(80,90,100,110和120b a r )等4个因素对火绒草总黄酮和总酚酸提取率的影响㊂以萃取温度45ħ㊁循环一次㊁提取5m i n 和80b a r 设置为单因素基础条件,当研究某一因素时确定其他因素保持不变㊂所得提取液按照标准曲线方法测定吸光度,计算总黄酮与总酚酸含量㊂1.7 响应面试验优化火绒草总黄酮和总酚酸提取工艺基于B o x -B e n h n k e n 试验设计,综合单因素试验结果,固定萃取投料量3g ,以总黄酮和总酚酸含量为响应值,选择萃取温度(A )循环次数(B )提取时间(C )和萃取压力(D )为自变量,设计四因素三水平响应面优化试验,确定最佳提取工艺条件,验证最佳提取方法㊂方案如表1所示㊂表1 响应面试验因素与水平T a b l e 1 F a c t o r s a n d l e v e l s o f r e s po n s e s u r f a c e t e s t 水平L e v e l因素f a c t o rA 萃取温度E x t r a c t i o n t e m pe r a t u r e /ħB 循环次数C yc l e s C 时间T i m e /m i nD 萃取压力E x t r a c t i o n p r e s s u r e /b a r-1752159009032010011054251101.8 数据统计分析利用E x c e l 2016整理试验数据作表,利用O r i gi n2021软件作图,利用S P S S24软件进行方差分析,所有试验均重复3次利,用D e s i gi n -E x -pe r t 11软件进行响应面试验分析㊂P <0.05表示具有显著性差异,P <0.01表示具有极显著性差异㊂2 结果与分析2.1 提取火绒草总黄酮的单因素试验由图1可知,在萃取温度为45ħ~90ħ时,随着温度的增加提取含量随之上升,萃取温度为90ħ时提取含量最高;继续提高温度,总黄酮提取含量有所下降;在循环1~3次时,随着次数的增加提取含739草 地 学 报第32卷量有所上升,循环次数为3时提取含量最高,继续增加次数,总黄酮提取含量并没有得到增加,分析是火绒草在提取溶剂中的溶解度达到了饱和,不在溶出;在提取时间5~20m i n 时,随着时间的增加提取含量上升,15m i n 时提取含量达到最高值;在25m i n 后总黄酮提取含量有所下降;在萃取压力80~100b a r 时,随着压力的增加提取含量有所上升,在100b a r 时提取含量达到最高值,在120b a r 时总黄酮提取含量虽有上升趋势,但是没有超过最高值,在高温高压条件下黄酮类的结构可能发生变化,因此将75ħ~105ħ㊁2~4次㊁15~25m i n ㊁90~110b a r 设定为各因素考察范围㊂图1 火绒草总黄酮的单因素试验结果F i g .1 R e s u l t s o f a s i n g l e -f a c t o r t e s t o f t o t a l f l a v o n o i d s i n L e o n t o p o d i u m l e o n t o po d i o i d e s 2.2 提取火绒草总酚酸的单因素试验由图2可知,在90ħ时,提取含量达到最高,为20.63m g ㊃g -1;但温度达到105ħ时总酚酸提取含量有所下降;在循环1~3次时,随着次数的增加提取含量上升,但循环次数超过3时提取含量迅速下降;在提取5~15m i n 时,提取含量并没有明显上升,20m i n 后提取含量迅速上升,到达最高点;在萃取压力为80~100b a r 时,随着压力的增加提取含量有所上升,在100b a r 时提取含量达到最高值,之后下降㊂因此将75ħ~105ħ㊁2~4次㊁15~25m i n ㊁90~110b a r 设定为提取考察范围㊂839第3期意如乐等:响应面法优化火绒草中总黄酮与总酚酸的提取工艺研究图2 火绒草总酚酸的单因素试验结果F i g .2 R e s u l t s o f a s i n g l e f a c t o r t e s t o f t o t a l p h e n o l i c a c i d s i n L e o n t o p o d i u m l e o n t o po d i o i d e s 2.3 响应面试验优化分析2.3.1 响应面多元回归方程建立 以火绒草总黄酮与总酚酸的含量为响应值,采用四因素三水平的响应面试验设计得到最佳提取工艺参数,试验结果见表2,方差分析结果见表格3㊂对表2中响应面的结果进行了多元回归方程拟合,并获得以火绒草总黄酮含量和总酚酸含量为响应值的多元回归方程:Y 1=-337.35+1.32A+20.76B+4.49C+4.87D-0.07A B+0.001A C-0.002A D-0.0024B C-0.066B D-0.0067C D -0.0049A 2-1.37B 2-0.098C 2-0.021D 2,Y 2=-173.6+1.9442A+9.2442B +1.3468C +1.6664D-0.047A B -0.002A C -0.005A D+0.0395B C-0.005B D-0.003C D-0.007A 2-0.885B 2-0.026C 2-0.006D2㊂由表3可知,该模型极显著(P <0.01),失拟项不显著,R 2,R 2A d j,R 2P r e d 及变异系数均在可接受范围内,说明模型具有较高的拟合度和可信度,可较好的分析与预测火绒草的提取工艺条件;其中A ,B ,C 和BD 对总黄酮提取含量有显著影响(P <0.05),D ,A B ,A 2,B 2,C2和D 2对总黄酮提取含量有极显著影响(P <0.01);而A ,D ,A B ,A D ,及二次项A 2,B 2,C2和D 2对总酚酸含量均有极显著影响㊂各因素对总黄酮提取含量的影响从高到低为:压力>温度>循环次数>提取时间;各因素对总酚酸提取含量的影响从高到低为:压力>温度>提取时间>循环次数㊂939草 地 学 报第32卷表2 火绒草总黄酮、总酚酸提取工艺条件响应面优化方案及结果T a b l e 2 O p t i m i z a t i o n s c h e m e a n d r e s u l t s o f r e s p o n s e s u r f a c e o f t o t a l f l a v o n o i d s a n d t o t a l ph e n o l i c a c i de x t r a c t i o n p r o c e s s o f L e o n t o p o d i u m l e o n t o po d i o i d e s 试验号T e s t n u m b e rA :温度E x t r a c t i o nt e m pe r a t u r e /ħB :循环次数C y c l e s C :时间T i m e /m i n D :压力E x t r a c t i o n p r e s s u r e/b a rY 1总黄酮含量T o t a l f l a v o n o i d c o n t e n t /m g㊃g -1Y 2总酚酸含量T o t a l ph e n o l i c a c i d c o n t e n t /m g㊃g -11-1-1042.6320.1921-10044.5321.983-110043.6621.844110041.6420.79500-1-139.7322.546001-139.4822.79700-1143.1922.268001141.621.979-100-140.5720.3510100-142.6122.7511-100142.7321.1312100143.3520.46130-1-1042.2422.011401-1041.8121.57150-11041.8421.5616011040.9421.9117-10-1041.6721.231810-1042.8521.8419-101041.0421.0720101042.5721.14210-10-141.3222.4622010-142.0322.29230-10143.4721.9124010141.5521.5525000045.4423.4126000045.2223.1327000045.8723.7528000045.2623.67290046.0123.47表3 响应面回归模型方差分析T a b l e 3 R e s p o n s eR e g r e s s i o nm o d e l v a r i a n c e a n a l ys i s 方差来源S o u r c e平方和S u mo f s q u a r e s 自由度D F均方M e a ns qu a r e F 值P 值Y 1Y 2Y 1Y 2Y 1Y 2Y 1Y 2Y 1Y 2模型M o d e l81.325.4214145.811.8220.2723.05<0.0001<0.0001A -温度T e m p e r a t u r e 2.30.8269112.30.82698.0210.50.01330.0059B -循环次数C y c l e s 1.610.0021111.610.00215.630.02710.03250.8716C -时间T i m e 1.350.085111.350.0854.71.080.04790.3165D -压力P r e s s u r e 8.591.27118.591.2729.9616.09<0.00010.0013A B3.842.02113.842.0213.4125.60.00260.0002A C 0.03060.0729110.03060.07290.10690.92550.74860.3523A D 0.50412.36110.50412.361.7629.910.2059<0.0001B C 0.05520.156110.05520.1560.19271.980.66730.1811B D 1.730.009111.730.0096.040.11460.02770.74C D 0.44890.0729110.44890.07291.570.92550.23120.3523A 27.7415.51117.7415.5127.02196.920.0001<0.0001B 212.115.081112.115.0842.2664.51<0.0001<0.0001C 239.052.791139.052.79136.335.48<0.0001<0.0001D 229.152.221129.152.22101.7428.19<0.00010.0001残缺R e s i d u a l 4.011.114140.28650.0788失拟项L a c ko f f i t 3.490.866410100.34930.08662.691.470.1760.3798纯误差P u r e e r r o r 0.51860.2363440.12960.0591总误差C o r t o t a l85.3226.522828R 20.9530.9584R 2A d j 0.9060.9169R 2P r e d 0.7550.7979变异系数C V1.261.2849第3期意如乐等:响应面法优化火绒草中总黄酮与总酚酸的提取工艺研究2.3.2 响应面交互作用分析 如图3a ~3b 所示,循环次数不变时,总黄酮提取含量随着萃取温度的增加先呈上升后下降的趋势;当萃取温度不变时,总黄酮提取含量随着循环次数的增加同样先呈上升后下降的趋势㊂萃取温度与循环次数的等高线图呈椭圆状,说明两项之间的交互影响较强;从等高线图和三维图的倾斜度可知,萃取温度对总黄酮提取含量的影响大于循环次数㊂从图3c ~3d 可知,循环次数不变时,总黄酮提取含量随着萃取压力的增大先呈略上升后下降的趋势;当萃取压力不变时,总黄酮提取含量随着循环次数的增加先呈升高后略微下降的趋势㊂从等高线图和三维图的倾斜度可知,萃取压力对总黄酮提取含量的影响略大于循环次数㊂如图4a ~4b 所示,萃取温度不变时,总酚酸提取含量随着循环次数的增加呈上升后迅速下降趋势;当循环次数不变时,总酚酸提取含量随着萃取温度的增加先呈上升后略微下降趋势㊂从等高线图和三维图的倾斜度可知,萃取温度对总酚酸提取含量的影响大于循环次数㊂从图4c ~4d 可知,萃取温度不变时,总酚酸提取含量随着萃取压力的增大先呈略上升后下降的趋势;当萃取压力不变时,响应面值随着萃取温度的增加先呈升高后下降趋势㊂从等高线图和三维图的倾斜度可知,萃取压力对总酚酸提取含量的影响大于萃取温度㊂综上可知,结合模型结果和等高线得到提取总黄酮最佳工艺为:萃取温度92.62ħ,循环次数2.82次,提取时间19.66m i n ,萃取压力102.15b a r,总黄酮提取含量为45.92m g㊃g -1㊂根据实际情况,修改为萃取温度93ħ,循环次数3次,提取时间20m i n,萃取压力102b a r㊂总酚酸最佳提取工艺为:萃取温度93.117ħ,循环次数2.914次,提取时间19.72m i n,萃取压力95.963b a r ,总酚酸提取含量为23.582m g ㊃g -1㊂根据实际情况,修改为萃取温度93ħ,循环次数3次,提取时间20m i n ,萃取压力96b a r㊂在所得最佳提取工艺条件下进行3次平行验证试验,总黄酮提取含量为(45.45ʃ0.36)m g ㊃g -1,总酚酸提取含量为(23.52ʃ0.34)m g ㊃g -1,与模型得到的预测值相近,表明该模型优化参数稳定,且具有较高的可靠性㊂图3 各因素交互作用对总黄酮提取含量影响F i g.3 F a c t o r i n t e r a c t i v e e f f e c t s o n t h e c o n t e n t o f t o t a l f l a v o n o i de x t r a c t i o n 2.4 抗氧化活性研究2.4.1 火绒草总黄酮对D P P H 自由基的消除影响以抗坏血酸作为阳性对照,火绒草总黄酮对D P -P H 自由基的消除作用如图5所示,随着质量浓度的增加D P P H 自由基消除率持续上升,火绒草总黄酮质量浓度与D P P H 自由基清除率呈正相关作用,149草 地 学 报第32卷其I C 50为0.012m g ㊃m L -1㊂当火绒草质量浓度达到0.08m g㊃m L -1时消除率可达到80%以上㊂虽然低于抗坏血酸,但是对于D P P H 自由基,火绒草总黄酮表现出较好的消除作用㊂图4 各因素交互作用对总酚酸提取含量影响F i g .4 T h e e f f e c t s o f f a c t o r i n t e r a c t i o no n t h e e x t r a c t i o n c o n t e n t o f t o t a l ph e n o l i c a c i de x t r a c t i on 图5 火绒草对D P P H 的消除作用F i g .5 T h e e l i m i n a t i o ne f f e c t o f L e o n t o po d i u m l e o n t o po d i o i d e s o nD P P H 2.4.2 火绒草总黄酮对A B T S 自由基的消除影响以抗坏血酸作为阳性对照,火绒草总黄酮对A B T S 自由基的消除作用如图6所示,随着质量浓度的增加A B T S 自由基消除率呈缓慢上升的趋势,火绒草总黄酮质量浓度与A B T S 自由基清除率呈正相关作用,其I C 50为0.356m g ㊃m L -1㊂与相同浓度的抗坏血酸相比,火绒草总黄酮对A B T S 的清除率低于抗坏血酸㊂但也能表现出一定的消除能力㊂图6 火绒草对A B T S 的消除作用F i g.6 T h e e l i m i n a t i o ne f f e c t o f L e o n t o p o d i u m l e o n t o po d i o i d e s o nA B T S 2.4.3 火绒草总黄酮的总还原力 以抗坏血酸作为阳性对照,火绒草总黄酮的还原力如图7所示,随着质量浓度的增加吸光度呈上升的趋势,说明火绒249第3期意如乐等:响应面法优化火绒草中总黄酮与总酚酸的提取工艺研究草总黄酮质量浓度与总还原力呈正相关㊂虽然总还原力低于抗坏血酸,但还是能表现出具有一定的还原能力㊂图7 火绒草总还原力F i g .7 T o t a l r e d u c i n gp o w e r o f L e o n t o po d i u m l e o n t o po d i o i d e s 3 讨论本试验采用快速溶剂萃取法得出了火绒草中总黄酮与总酚酸的最佳提取工艺条件㊂快速溶剂萃取法是一种新兴的高压自动萃取技术[24],通过改变萃取温度㊁提取时间㊁循环次数以及萃取压力等因素来提高活性物质的提取率㊂C h u a n g 等[25]研究表明,与索式提取和热回流提取相比,快速溶剂萃取法是一种简单㊁有效㊁省时又先进的一项技术㊂王铎[26]分别采用超声提取㊁回流提取㊁温浸提取以及快速溶剂萃取四种方法对甘草(G l y c yr r h i z au r a l e n s i s F i s c h .)中的总黄酮进行了提取,结果表明快速溶剂萃取法对甘草中总黄酮的提取为最佳,平均总黄酮含量达到10.63m g ㊃g -1;C h a m a l i 等[27]探索出快速溶剂萃取法萃取桉树(E u c a l y pt u s s p p .)总酚酸的最佳提取方法为:提取温度179ħ㊁提取时间36m i n㊂而有关火绒草活性物质提取㊁纯化工艺方面的研究较少,本研究对火绒草总黄酮与总酚酸提取工艺优化进行了初步探索,为后续火绒草活性物质开发利用提供有效的技术支撑㊂本研究中火绒草总黄酮提取含量受萃取温度㊁萃取次数㊁加热时间和萃取压力的影响,其中提取时间的影响最小㊂唐巧玉等[28]研究使用快速溶剂萃取法提取水芹(O e n a n t h e ja v a n i c a (B l u m e )D C .)中总黄酮时得出提取时间对总黄酮提取含量的的影响较小㊂而吴桐[29]在研究中指出影响芦丁㊁金丝桃苷提取效果的因素顺序为提取温度>循环次数>提取压力>提取时间,这与本试验的结果有相同之处㊂原因可能是快速溶剂萃取法本身是一种快速提取的方法,大大节约了萃取时间,从而导致提取时间对提取率没有较大影响㊂刘叶等[30]采用单因素试验研究了快速溶剂萃取仪提取葡萄(V i t i s v i n i f e r a L .)籽中多酚物质的工艺并进行了正交试验优化,在文中指出影响提取含量的主要影响因素为提取时间其次是提取温度,提取压力的影响效果最小,与本试验结果存在差异,可能是因为本试验中萃取压力设置的水平之间差异较大,从而导致萃取压力对总酚酸提取含量影响较大㊂W a n g 等[31]在研究中提出随着温度㊁循环次数㊁提取时间和萃取压力的增加总酚酸含量有所上升,到达一定程度后又开始下降,在本试验结果中也存在这种现象,而这种现象可用快速溶剂萃取仪的基本原理来解释:高压的应用使萃取溶剂高于其沸点,并迫使溶剂扩散进入样品基质,而更高的温度使得溶剂具有更好的溶解能力和更低的粘度,并减弱样品与溶剂之间的相互作用,从而增加了传质,提高了萃取率[32-33]㊂本研究通过测定火绒草总黄酮提取液对D P -P H ㊁A B T S 自由基的消除率及总还原力来检测火绒草活性物质的抗氧化活性㊂D P P H 自由基在可见光范围内有特征吸收[34],A B T S 自由基会被抗氧化物抑制[35],因此都是测定抗氧化活性的重要指标㊂总还原力是测定潜在抗氧化活性的重要指标,其机理是通过样品将F e 3+还原成F e2+,中断自由基的链式反应[36]㊂展锐等[37]通过测定火绒草提取物的总还原力㊁羟自由基清除能力等比较了火绒草醇提物和水提物的抗氧化活性,结果表明,火绒草提物都具有较强的抗氧化活性,且醇提物的作用比水提物更有佳㊂吴楠贞等[3]研究发现火绒草醇提物有较强的抗氧化活性,这与本研究结果相似㊂综上所述,火绒草提取物可作为一种天然的抗氧化剂,有清除体内的自由基和抗脂质氧化等功能㊂4 结论本试验以火绒草为原料使用快速溶剂萃取法萃取火绒草中总黄酮与总酚酸,结果表明,总黄酮最佳提取方法为:萃取温度93ħ,循环次数3次,提取时间20m i n ,萃取压力102b a r;总酚酸最佳提取方法为:萃取温度93ħ,循环次数3次,提取时间20m i n ,萃取压力96b a r㊂验证试验结果表明,总黄酮提取含量为(45.45ʃ0.36)m g ㊃g -1,总酚酸提取含量为(23.52ʃ0.34)m g ㊃g -1,与模型拟合度高,可用于优化提取工艺㊂349草地学报第32卷本试验对火绒草总黄酮提取液进行了抗氧化活性研究,研究发现,火绒草总黄酮提取液对D P P H 自由基的I C50为0.012m g㊃m L-1;对A B T S自由基的I C50为0.356m g㊃m L-1;具有一定还原力,说明火绒草具有较好的抗氧化活性㊂参考文献[1]马晓玲,陈秋,夏提古丽,等.火绒草化学成分的分离与鉴定[J].沈阳药科大学学报,2018,35(9):729-732[2]李礼,张国刚,左甜甜,等.中药火绒草化学成分的研究(Ⅱ)[J].中南药学,2008(4):422-423[3]吴楠贞,展锐,苟萍.火绒草抗氧化活性成分及其结构分析[J].天然产物研究与开发,2013,25(3):296-301[4]肖阳央,苟萍,谢海辉.火绒草的苯丙素类成分[J].热带亚热带植物学报,2017,25(2):195-201[5]黄利权,伍义行.火绒草及火绒草属植物研究进展[J].中兽医医药杂志,2004(3):24-26[6] H O R N I C KA,S C HW A I G E R S,R O L L I N G E R JM,e t a l.E x t r a c t sa n dc o n s t i t u e n t s o f L e o n t o p o d i u m a l p i n u m e n h a n c e c h o l i n e r g i ct r a n s m i s s i o n:B r a i nA C h i n c r e a s i n g a n dm e m o r y i m p r o v i n gp r o p e r-t i e s[J].B i o c h e m i c a l P h a r m a c o l o g y,2008,76(2):236-248 [7]杨正明,地久此呷,兰建龙,等.基于U P L 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