中国畜牧兽医 2024,51(3):1122-1131C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 复方中药提取物对公兔生殖生理的影响王士勇1,苏东雪2,张 靖1,陈丽红1,詹 军1,陈 尧1,文盛鸿1,杨月春1(1.贵州中医药大学,中兽药产业化创新应用研究中心,贵阳550025;2.延边大学农学院,延吉136200)摘 要:ʌ目的ɔ讨论不同剂量复方中药提取物对公兔精液品质㊁生殖激素㊁睾丸形态及精子顶体完整性的影响,为提高公兔的繁殖性能及研制此类功能的中药饲料添加剂提供理论依据㊂ʌ方法ɔ选取24只新西兰公兔,随机分为4组,每组6只,空白对照组公兔不添加复方中药提取物,试验Ⅰ㊁Ⅱ和Ⅲ组公兔分别添加150㊁300㊁600m g /k g 复方中药提取物㊂试验周期为12周,饲喂周期为8周㊂分别于试验第4㊁8㊁12周采集血液样本,于试验第8㊁10㊁12周采集精液样本,进行血清中性激素的测定与精液品质鉴定㊂ʌ结果ɔ与对照组相比,8~12周试验组兔精子密度㊁精子活率㊁A 级精子数量均显著升高(P <0.05),试验Ⅲ组兔精子顶体完整率显著升高(P <0.05);10~12周试验Ⅲ组兔精子畸形率显著降低(P <0.05)㊂试验组兔睾丸组织表面被膜由较厚的不规则致密结缔组织构成,睾丸内大量曲精小管基底膜清晰可见,曲精小管上皮是由生精细胞与支持细胞构成的复层上皮,曲精小管上皮分布大量精原细胞和分化的精母细胞,管腔内可见数量丰富的精子,间质无明显异常㊂4~12周试验Ⅱ㊁Ⅲ组兔血清中促卵泡素(F S H )㊁黄体生成素(L H )㊁睾酮(T )含量均显著高于对照组(P <0.05)㊂ʌ结论ɔ复方中药提取物可明显改善公兔精液品质,提高精子顶体完整率,降低精子畸形率;有效改善睾丸形态,促进生殖器官发育;提高血清中F S H ㊁L H ㊁T 生殖激素含量㊂其中600m g /k g 复方中药提取物对于公兔的生殖生理具有显著影响,在实际生产中具有良好的应用前景㊂关键词:复方中药提取物;公兔;睾丸;精液品质;生殖激素中图分类号:S 814.1文献标识码:AD o i :10.16431/j .c n k i .1671-7236.2024.03.024 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-09-11基金项目:贵州省科技计划项目 梅花鹿配子冷冻保存技术的研究与应用 (黔科合支撑[2022]一般131)联系方式:王士勇,E -m a i l :w a n g s h i y o n g 129@g z y .e d u .c n ;苏东雪,E -m a i l :2268844347@q q.c o m ㊂王士勇和苏东雪对本文具有同等贡献,并列为第一作者㊂通信作者杨月春,E -m a i l :k e t t y yu e @126.c o m E f f e c t o fC o m p o u n dC h i n e s eM e d i c i n eE x t r a c t o nR e pr o d u c t i v e P h y s i o l o g y ofM a l eR a b b i t s WA N GS h i y o n g 1,S U D o n g x u e 2,Z H A N GJ i n g 1,C H E N L i h o n g 1,ZHA NJ u n 1,C H E N Y a o 1,W E NS h e n g h o n g 1,Y A N G Yu e c h u n 1(1.C e n t e r f o r I n n o v a t i o na n dA p p l i c a t i o no f C h i n e s eV e t e r i n a r y D r u g In d u s t r i a l i z a t i o n ,G u i z h o uU n i v e r s i t y o f T r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c i n e ,G u i y a n g 550025,C h i n a ;2.C o l l e g e o f A g r i c u l t u r e ,Y a n b i a nU n i v e r s i t y ,Y a n ji 136200,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h i s s t u d y w a s a i m e d t od i s c u s s t h e e f f e c t s o f d i f f e r e n t d o s e s o f c o m po u n d C h i n e s em e d i c i n ee x t r a c to ns e m e n q u a l i t y ,r e p r o d u c t i v eh o r m o n e ,t e s t i sm o r p h o l o g y a n ds pe r m a c r o s o m e i n t e g r i t y i n m a l er a b b i t s ,a n d p r o v i d eat h e o r e t i c a lb a s i sf o ri m p r o v i ng r e pr o d u c t i v e p e r f o r m a n c e o fm a l e r a b b i t s a n dd e v e l o p i n g t r a d i t i o n a lC h i n e s em e d i c i n e f e e da d d i t i v e sw i t ht h i s k i n do f f u n c t i o n .ʌM e t h o d ɔT w e n t y -f o u rN e wZ e a l a n dm a l e r a b b i t sw e r e r a n d o m l y di v i d e d i n t o4g r o u p s ,w i t h 6r a b b i t s i n e a c h g r o u p .T h em a l e r a b b i t s i n c o n t r o l ,Ⅰ,Ⅱa n dⅢg r o u psw e r e g i v e n 0,150,300a n d600m g /k g c o m p o u n dC h i n e s e m e d i c i n ee x t r a c t ,r e s p e c t i v e l y .T h ee x p e r i m e n t a l p e r i o dw a s 12w e e k s ,a n dt h e f e e d i n gp e r i o d w a s8w e e k s .B l o o ds a m pl e sw e r ec o l l e c t e da t t h e3期王士勇等:复方中药提取物对公兔生殖生理的影响4t h,8t ha n d12t hw e e k,a n d t h e s e m e n s a m p l e sw e r e c o l l e c t e d a t t h e8t h,10t ha n d12t hw e e k f o r t h e d e t e r m i n a t i o no fs e r u m s e xh o r m o n ea n ds e m e n q u a l i t y.ʌR e s u l tɔC o m p a r e d w i t hc o n t r o l g r o u p,t h es p e r m d e n s i t y,s p e r m v i a b i l i t y a n dt h e n u m b e r o f g r a d e A s p e r m o fr a b b i t si n e x p e r i m e n t a l g r o u p a t8-12w e e k s w e r es i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d(P<0.05),a n dt h er a t eo f a c r o s o m e i n t e g r i t y o fr a b b i t si nⅢg r o u p w a ss i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d(P<0.05).T h es p e r m d e f o r m i t y r a t e o f r a b b i t s i nⅢg r o u p w a s s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n t h a t i nc o n t r o l g r o u p a t10-12 w e e k s(P<0.05).T h es u r f a c ec a p s u l eo f t h e t e s t i c u l a r t i s s u eo f r a b b i t s i ne x p e r i m e n t a l g r o u p w a sc o m p o s e d o ft h i c ki r r e g u l a r d e n s e c o n n e c t i v et i s s u e a n d al a r g e n u m b e r o f b a s e m e n t m e m b r a n e s o f s e m i n i f e r o u s t u b u l e sw e r e c l e a r l y v i s i b l e,t h e e p i t h e l i u mo f s e m i n i f e r o u s t u b u l ew a sc o m p o s e do fs p e r m a t o g e n i cc e l l s a nd Se r t o l ic e l l s.T h e r e w e r e al o t o fs p e r m a t o g o n i a a n dd i f fe r e n t i a t e d s p e r m a t o c y t e s i n t h ee p i t h e l i u mof s e m i n i f e r o u s t u b u l e.T h e r ea r ea b u n d a n t s p e r m i nl u m e n a n d n o o b v i o u sa b n o r m a l i t i e si n s t r o m a.A t4-12w e e k s,T h e c o n t e n t s o ff o l l i c l e s t i m u l a t i ngh o r m o n e(F S H),l u t ei n i z i n g h o r m o n e(L H)a n d t e s t o s t e r o n e(T)o f s e r u mi nⅡa n d Ⅲg r o u p s w e r es i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a n t h a ti n c o n t r o l g r o u p(P<0.05).ʌC o n c l u s i o nɔC o m p o u n dC h i n e s em e d i c i n e e x t r a c t c o u l d i m p r o v e t h e q u a l i t y o fm a l e r a b b i t s e m e n,i n c r e a s e t h e r a t e o fs p e r m a c r o s o m e i n t e g r i t y,r e d u c et h es p e r m d e f o r m i t y r a t e,i m p r o v et h e m o r p h o l o g y o f t e s t i s,p r o m o t e t h e d e v e l o p m e n t o f r e p r o d u c t i v e o r g a n s,a n d i n c r e a s e t h e c o n t e n t s o f F S H,L Ha n d Ti ns e r u m.T h e600m g/k g c o m p o u n d C h i n e s e m e d i c i n ee x t r a c th a das i g n i f i c a n te f f e c to n r e p r o d u c t i v e p h y s i o l o g y o f m a l e r a b b i t s,a n d h a d a g o o d a p p l i c a t i o n p r o s p e c ti n p r a c t i c a l p r o d u c t i o n.K e y w o r d s:c o m p o u n d C h i n e s e m e d i c i n e e x t r a c t;m a l e r a b b i t s;t e s t i c u l a r;s e m e n q u a l i t y; r e p r o d u c t i v eh o r m o n e s传统中药添加剂具有纯天然㊁耐药性低㊁毒性小㊁作用大的特点[1],在畜禽生产中已得到广泛应用,主要表现在提高生产性能[2]㊁免疫机能[3]㊁繁殖机能[4-6]及缓解应激[7]等方面㊂随着畜牧业的大力发展,兔产业集约化㊁规模化生产已成为必然趋势㊂大量养殖场为提高畜禽繁殖性能㊁经济效益及缩短繁殖期限滥用激素类药物,由此造成的兽药残留是动物性食品安全重要污染源之一[8-9]㊂畜牧业现亟需寻找激素类药物的替代品以解决兔产业良种供种能力不足的问题[10]㊂中药添加剂是一种天然的替代品[11],但在兔产业中研究较少,目前国内只有李艳玲等[12]㊁丁海荣等[13]提出利用传统饲喂方式添加中草药添加剂改善公兔繁殖性能;国外研究相对较多,但大多都以添加单一中药作为草药补充剂形式进行调节,仍存在较多的局限性[14-18]㊂据此,中兽药产业化创新应用研究中心通过统计调研及系统分析,最终选取巴戟天㊁胡芦巴㊁肉桂㊁菟丝子㊁补骨脂㊁肉苁蓉等20多味中药材进行配伍组方,制成饲料添加剂,该添加剂与传统中药饲料添加剂大有不同,一方面是并非由单一中药进行饲喂,而是以复方的形式,这样可以充分发挥出中药君臣佐使配伍原则的协调性,多靶点进行生理调节,相较于单方作用效果更强㊁时间更长㊁范围更广;另一方面是该复方是以传统医学古籍作为佐证,其作用效果经过几千年的考证已经相对成熟㊂本试验将制备所得复方中药提取物饲喂种公兔,对其精液品质㊁精子顶体完整率及畸形率㊁睾丸组织形态以及血清中生殖激素含量等进行测定,旨在评价用药与否对种公兔繁殖性能的影响㊂1材料与方法1.1材料1.1.1中药复方中药提取物包括巴戟天㊁胡芦巴㊁肉桂㊁菟丝子㊁补骨脂㊁肉苁蓉等,所选中药均购自湖北九灵草生物科技有限公司,将各类中药烘干后按照预先制定的配方比例进行配制,利用水煎煮法获得该复方中药提取物㊂1.1.2 主要试剂与仪器 4%多聚甲醛(B i o s h a r p生物科技有限公司);瑞氏-姬姆萨染液㊁磷酸盐缓冲液(飞净生物科技有限公司);睾酮(T)定量检测试剂盒㊁兔促卵泡素(F S H)定量检测试剂盒㊁兔黄体生成素(L H)定量检测试剂盒(泉州市睿3211中国畜牧兽医51卷信生物科技有限公司)㊂G J-7000F动物精子质量分析仪(徐州国健电子设备科技有限公司);G H P-9050隔水式恒温培养箱(宁国沙鹰科学仪器有限公司);HH-W600电热恒温水槽(上海助蓝仪器科技有限公司);DW-B6L57-85超低温冰箱(青岛海尔股份有限公司);R e a d M a x1900光吸收全波长酶标仪(上海闪谱生物科技有限公司);T S-D I10-L/h超纯水机(陶氏水处理设备工程有限公司);C T15R T台式高速冷冻离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司)㊂1.2试验动物及分组于贵州中医药大学实验动物研究所(实验动物生产许可证号:S C X K(黔)2021―0003),选取25周龄体重相近(2.75k gʃ0.5k g)㊁繁殖性能相似的24只公兔,随机分为4组,每组6只㊂对照组不添加中药,试验Ⅰ㊁Ⅱ和Ⅲ组分别添加150㊁300㊁600m g/k g 中药提取物㊂试验周期为12周,饲喂周期为8周,非饲喂期饲喂正常全价饲料㊂1.3饲养管理试验于贵州中医药实验动物研究所(实验动物使用许可证号:S Y X K(黔)2021―0005)进行,所选公兔单栏饲喂,每只公兔每天饲喂8~10g/次饲料,饲喂时间分别为07:30㊁13:00和18:00;兔舍温度控制在15~25ħ,湿度为60%~70%㊂所有公兔除饲料中中药添加剂量不同外,其余各饲喂料均一致,每天打扫兔房并进行粪便清理㊂基础饲粮组成及营养水平见表1㊂表1基础饲粮组成及营养水平T a b l e1T h e c o m p o s i t i o na n dn u t r i e n t l e v e l s o f t h e b a s a l d i e t%组成I n g r e d i e n t s含量C o n t e n t s营养成分N u t r i e n t c o m p o n e n t s含量C o n t e n t s 玉米C o r n g r a i n20.41消化能D E/(M J/k g)10.68麸皮W h e a t b r a n15.31干物质D M84.10豆粕S o y b e a nm e a l7.14粗蛋白质C P17.85菜籽粕R a p e s e e dm e a l5.10粗脂肪C F3.94苜蓿草粉A l f a l f am e a l24.50粗纤维C E16.33蘑菇菌棒M u s h r o o mb r a n①12.24赖氨酸L y s0.84稻壳粉R i c eh u l l s p o w d e r5.10蛋氨酸M e t0.48豆杆S o y b e a n s t a l k s5.10胱氨酸C y s-C y s0.21预混料P r e m i x②5.10精氨酸A r g0.71总计T o t a l100.00钙C a0.91磷P0.45①蘑菇菌棒是经过发酵处理的生产食用菌基础培养基废料㊂②预混料为每千克饲粮提供:维生素A260000I U;维生素D3 70000I U;维生素E170m g;维生素K317m g;维生素B130m g;维生素B290m g;泛酸80m g;烟酸700m g;叶酸10m g;硒10m g;铜270m g;锌270m g;铁200m g;锰200m g;碘12m g①M u s h r o o mb r a n i s t h e c u l t u r em e d i u m w a s t e o fm u s h r o o ma f t e r f e r m e n t a t i o n.②T h e p r e f i x p r o v i d e d t h e f o l l o w i n g f o r p e r k g o f d i e t:V A260000I U;V D370000I U;V E170m g;V K317m g;V B130m g;V B290m g;P a n t o t h e n i c a c i d80m g;N i c o t i n i c a c i d 700m g;F o l i c a c i d10m g;S e10m g;C u270m g;Z n270m g;F e200m g;M n200m g;I12m g1.4测定指标及方法1.4.1精液采集分别于试验第8㊁10㊁12周采集精液,采精前需将37ħ加热干燥好的采精器用50m L注射器冲上气体,松紧度适当,检查软孔牢固情况后放入装有保温袋的保温箱内;从37ħ水浴锅中取同等数量的集精杯,注入0.5m L精液稀释液(生理盐水+5%葡萄糖液)后放入另一个装有保温袋的保温箱内;将集精杯安装在采精器的集精口上㊂在预定的公兔群中按顺序开始操作:选1只发情的母兔作为台兔,采精员一手抓住兔耳朵和颈部皮肤放入公兔笼中,一手拿住采精器与集精杯;在兔笼内让公兔爬跨,待公兔爬跨后将其推下,反复2~3次,以提高公兔性欲;当公兔的阴茎反复抽动时,采精员调整假阴道的高度和角度,使公兔的阴茎顺利进入假阴道内;待公兔爬跨射精后应及时将拿采精器的手往上推抬,使精液流入集精杯内,以防止精液外泄;采精成功后,将集精杯从采精器上拿下,放入保温箱内,做好相关的采精记录㊂1.4.2精液品质鉴定将精子计数板在使用前进行预热至38ħ,预热完成后用移液枪各吸取42113期王士勇等:复方中药提取物对公兔生殖生理的影响10μL第8㊁10㊁12周采集的原精,放入盛有190μL 稀释液的E P管中实施稀释操作,通过移液器将稀释后的精子滴加到精子计数板中,置于动物精子质量分析仪下测定并计算各精液品质指标,如精子密度㊁精子活力等㊂每只公兔重复检测3次,取平均值㊂1.4.3顶体完整率及畸形率鉴定将取样涂片标号,轻轻摇匀待测精液,在精液的中层取一小滴样品滴在载玻片的一端(距载玻片的右端1c m处),将精液样品以拉出形式制成抹片,自然干燥5~ 10m i n;用滴管吸取4%甲醛固定液缓慢地滴在抹片上,固定10m i n,用镊子夹住涂片的一端,倒去抹片上的固定液,用蒸馏水冲洗㊁晾干;分别加瑞氏-姬姆萨染液2滴㊁磷酸盐液4滴,混匀后染色10~ 15m i n,倒去涂片上的染液用清水冲洗,晾干后即可进行观察㊂将样品抹片置于400倍显微镜下观察精子顶体完整率,在5个不同视野计数200个精子,计算出其中所含的顶体完整精子数及畸形精子数,估算出精子顶体完整率及畸形率㊂试验重复3次,取平均值㊂1.4.4睾丸组织病理学观察于试验第8周每组随机选取2只兔子,剖杀分离睾丸,用生理盐水轻缓冲洗,洗净后迅速置于4%多聚甲醛溶液中常温固定后进行H E染色,并进行病理学观察㊂1.4.5血清中激素含量测定分别于试验第4㊁8㊁12周用肝素钠真空管经兔耳采集血样5m L,在室温下3500r/m i n离心15m i n,取上清液置于离心管中,―80ħ保存备用㊂F S H㊁L H㊁T含量参考各生殖激素定量检测试剂盒说明书通过E L I S A法进行测定㊂1.5数据统计分析试验数据通过E x c e l进行整理,其中激素数据运用E L I S A C a l cv0.2回归/拟合计算程序求得,运用S P S S22.0软件中单因素方差分析对数据进行差异性分析,结果以平均值ʃ标准差表示,P<0.05为差异显著㊂2结果2.1复方中药提取物对公兔精液品质的影响2.1.1精子密度及精子活率由表2可知,8~ 12周试验组公兔精子密度和精子活率均显著高于对照组(P<0.05),试验Ⅰ㊁Ⅱ组公兔精子密度无显著差异(P>0.05),试验Ⅱ㊁Ⅲ组公兔精子活率无显著差异(P>0.05)㊂表2各组公兔精子密度和精子活率T a b l e2S p e r md e n s i t y a n d s p e r mv i a b i l i t y o fm a l e r a b b i t s i n e a c h g r o u p项目I t e m s时间T i m e/周组别G r o u p s对照组C o n t r o lⅠⅡⅢ精子密度83.04ʃ0.35c4.27ʃ0.19b4.40ʃ0.09b5.31ʃ0.14a S p e r md e n s i t y103.45ʃ0.33c4.32ʃ0.20b4.64ʃ0.14b5.53ʃ0.19a123.49ʃ0.31c4.23ʃ0.10b4.30ʃ0.42b5.64ʃ0.21a 精子活率878.14ʃ1.80c84.77ʃ1.35b90.49ʃ1.23a88.46ʃ2.70a b S p e r mv i a b i l i t y1072.72ʃ0.84c84.35ʃ1.43b88.54ʃ1.15a90.81ʃ1.08a1275.18ʃ1.58b86.79ʃ0.05a88.54ʃ0.92a88.84ʃ0.34a 同行数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05),肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)㊂下同I n t h e s a m e r o w,v a l u e sw i t hd i f f e r e n t l e t t e r s u p e r s c r i p t sm e a ns i g n i f i c a n td i f f e r e n c e(P<0.05);W h i l ew i t ht h es a m eo rn o l e t t e r s u p e r s c r i p t sm e a nn o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e(P>0.05).T h e s a m e a sb e l o w2.1.2精子活力由表3可知,8~12周试验组公兔A级精子活力均显著高于对照组(P<0.05);第10周试验Ⅰ组㊁第12周试验Ⅲ组公兔B级精子活力均显著低于对照组(P<0.05);第10周试验Ⅰ㊁Ⅱ组公兔C级精子活力均显著高于对照组(P< 0.05);第8㊁12周试验组及第10周试验Ⅲ组公兔D 级精子活力均显著低于对照组(P<0.05)㊂5211中国畜牧兽医51卷表3各组公兔精子活力T a b l e3S p e r m m o t i l i t y o fm a l e r a b b i t s i n e a c h g r o u p%时间T i m e/周精子等级S p e r m g r a d e s组别G r o u p s对照组C o n t r o lⅠⅡⅢ8A24.48ʃ0.88d31.69ʃ0.28c36.67ʃ1.59b45.23ʃ0.87a B28.49ʃ1.57a b21.60ʃ1.38b29.10ʃ2.80a22.85ʃ4.23a bC26.08ʃ1.59a b31.47ʃ2.53a24.70ʃ1.41a b20.37ʃ2.27bD20.94ʃ0.38a15.22ʃ1.35b9.51ʃ1.23c11.53ʃ2.70b c 10A26.69ʃ0.85c32.30ʃ0.36b34.22ʃ0.47b44.89ʃ1.24a B22.34ʃ0.78a16.11ʃ0.99b24.33ʃ2.73a23.48ʃ2.61aC23.18ʃ1.28c35.93ʃ0.33a30.06ʃ1.90b22.44ʃ2.36cD27.11ʃ0.83a15.65ʃ1.43a13.26ʃ1.88a b9.19ʃ1.08b 12A25.04ʃ0.79c35.89ʃ0.35b38.40ʃ1.89b44.55ʃ1.78a B21.64ʃ0.34a25.16ʃ1.67a25.12ʃ0.71a17.06ʃ0.43bC25.74ʃ2.0725.03ʃ2.1027.23ʃ1.6822.93ʃ0.77D23.71ʃ2.00a13.22ʃ0.05b9.79ʃ0.04b11.16ʃ0.34b2.1.3精子运动性能由表4可知,8~10周试验Ⅱ㊁Ⅲ组公兔精子运动性能(除平均移动角度外)均显著高于对照组(P<0.05);第10周试验组公兔平均移动角度显著低于对照组(P<0.05);第12周试验Ⅱ㊁Ⅲ组公兔前向运动精子及平均鞭打频率均显著高于对照组(P<0.05)㊂表4各组公兔精子运动性能T a b l e4T h e s p e r m m o t i l i t y o f s p e r mi nm a l e r a b b i t s o f e a c h g r o u p项目I t e m s时间T i m e/周组别G r o u p s对照组C o n t r o lⅠⅡⅢ前向运动精子(A+B)852.97ʃ1.93b53.30ʃ1.35b65.78ʃ1.95a68.09ʃ4.51a F o r w a r dm o t i o n1049.25ʃ0.65c48.42ʃ1.36c58.56ʃ2.31b68.37ʃ2.48a s p e r m(A+B)/%1247.13ʃ0.96b61.05ʃ2.01a63.52ʃ1.18a61.61ʃ1.35a 平均路径速度89.04ʃ0.42b11.13ʃ0.97b18.34ʃ0.34a16.63ʃ1.38a A v e r a g e p a t h1010.60ʃ0.62c13.17ʃ0.75b15.82ʃ0.18a16.26ʃ0.50a s p e e d/(μm/s)1210.41ʃ0.3214.32ʃ2.0014.75ʃ1.6015.11ʃ0.04平均曲线速度816.74ʃ0.52b19.13ʃ1.69b31.15ʃ1.59a28.91ʃ2.23a A v e r a g e c u r v e1018.73ʃ0.76c23.05ʃ1.09b26.92ʃ0.41a27.66ʃ1.71a v e l o c i t y/(μm/s)1218.62ʃ0.39b24.56ʃ2.21a b25.91ʃ2.52a24.31ʃ1.18a b 平均直线速度85.84ʃ0.50b8.06ʃ0.76b13.67ʃ0.35a12.05ʃ1.07a A v e r a g e l i n e a r106.94ʃ0.51c9.19ʃ0.62b11.31ʃ0.35a11.03ʃ8.90a b v e l o c i t y/(μm/s)127.09ʃ0.3111.03ʃ2.019.55ʃ1.3010.68ʃ0.78平均移动角度877.14ʃ4.2978.54ʃ2.3071.47ʃ2.6676.04ʃ3.49 A v e r a g e a n g l e o f1082.38ʃ1.47a74.22ʃ2.00b70.48ʃ2.10b70.73ʃ3.76b m o v e m e n t/ʎ1283.53ʃ0.31a75.24ʃ2.93a b71.44ʃ4.60b69.22ʃ0.81b 平均侧摆幅度81.87ʃ0.02b2.08ʃ0.14b2.93ʃ0.11a2.90ʃ0.20a A v e r a g e y a w102.11ʃ0.07c2.49ʃ0.08b2.73ʃ0.05a b2.89ʃ0.27a a m p l i t u d e/μm122.14ʃ0.03b2.39ʃ0.06b2.80ʃ0.21a2.25ʃ0.18b 平均鞭打频率87.59ʃ0.18c9.26ʃ0.53b11.12ʃ0.04a10.09ʃ0.71a b A v e r a g ew h i p p i n g108.53ʃ0.24b10.18ʃ0.46a10.56ʃ0.34a10.76ʃ0.69a f r e q u e n c y/H z128.67ʃ0.24b10.20ʃ0.62a b10.71ʃ0.93a10.98ʃ0.33a 62113期王士勇等:复方中药提取物对公兔生殖生理的影响2.2复方中药提取物对公兔精子顶体完整率和畸形率的影响由表5可知,8~12周试验Ⅲ组公兔精子顶体完整率显著高于对照组及试验Ⅰ㊁Ⅱ组(P<0.05);第10周试验Ⅲ组公兔精子畸形率显著低于对照组及试验Ⅰ㊁Ⅱ组(P<0.05);第12周试验组公兔精子畸形率显著低于对照组(P<0.05)㊂表5各组公兔精子顶体完整率及畸形率T a b l e5T h e r a t e o f a c r o s o m e i n t e g r i t y a n dd e f o r m i t y r a t e o f s p e r mi nm a l e r a b b i t s o f e a c h g r o u p%项目I t e m s时间T i m e/周组别G r o u p s对照组C o n t r o lⅠⅡⅢ顶体完整率851.63ʃ1.28b51.80ʃ1.33b52.17ʃ1.13b64.75ʃ2.25a R a t e o f a c r o s o m e i n t e g r i t y1052.50ʃ1.26b52.63ʃ1.67b53.13ʃ1.27b63.13ʃ1.38a1251.75ʃ1.34b54.00ʃ0.55b56.25ʃ0.87b64.00ʃ0.71a 畸形率88.75ʃ0.868.33ʃ0.688.30ʃ0.708.25ʃ0.50 D e f o r m i t y r a t e107.88ʃ0.76a8.13ʃ0.86a8.50ʃ0.65a7.00ʃ0.41b128.25ʃ0.27a6.75ʃ0.27b6.25ʃ0.29b5.75ʃ0.35b2.3复方中药提取物对公兔睾丸组织形态的影响试验组公兔睾丸组织表面被膜由较厚的不规则致密结缔组织构成,睾丸内大量曲精小管基底膜清晰可见,曲精小管上皮是由生精细胞与支持细胞构成的复层上皮,曲精小管上皮分布大量精原细胞和分化的精母细胞,管腔内可见数量丰富的精子,间质无明显异常;对照组公兔睾丸组织中局部可见少量曲精小管生精上皮变薄,精母细胞数量减少(图1)㊂A~D分别代表对照组及试验Ⅰ㊁Ⅱ㊁Ⅲ组A-Dr e p r e s e n t c o n t r o l,Ⅰ,Ⅱa n dⅢg r o u p s,r e s p e c t i v e l y图1各组公兔睾丸病理学观察(H E,20ˑ)F i g.1P a t h o l o g i c a l o b s e r v a t i o no f t e s t i s i nm a l e r a b b i t s o f e a c h g r o u p(H E,20ˑ)2.4复方中药提取物对公兔血清中性激素含量的影响由表6可知,4~12周试验Ⅱ㊁Ⅲ组公兔血清中F S H及L H含量均显著高于对照组(P<0.05),试验组公兔血清中T含量显著高于对照组(P<0.05)㊂7211中国畜牧兽医51卷表6各组公兔血清中F S H㊁L H㊁T含量测定T a b l e6T h e c o n t e n t s o f F S H,L Ha n dT i n s e r u mo fm a l e r a b b i t s i n e a c h g r o u p项目I t e m s时间T i m e/周组别G r o u p s对照组C o n t r o lⅠⅡⅢ促卵泡素41.69ʃ0.74c2.51ʃ0.51c3.72ʃ0.50b4.79ʃ0.57a F S H/(m I U/m L)81.70ʃ0.47b1.29ʃ0.28b2.50ʃ0.38a2.96ʃ0.27a120.58ʃ0.10c1.65ʃ0.49b1.82ʃ0.28b2.70ʃ0.28a 黄体生成素41.37ʃ0.75c1.74ʃ0.51c3.55ʃ0.29b4.80ʃ0.49a L H/(m I U/m L)81.20ʃ0.43c1.38ʃ0.17c3.29ʃ0.36b4.59ʃ0.30a120.69ʃ0.36c1.12ʃ0.21b1.17ʃ0.16b1.69ʃ0.20a 睾酮41.16ʃ0.32d2.41ʃ0.63c5.84ʃ0.88b7.46ʃ0.62a T/(n g/m L)81.77ʃ0.40d5.94ʃ0.55c8.03ʃ0.65b17.31ʃ0.85a122.33ʃ0.60d3.62ʃ0.46c4.58ʃ0.64b14.74ʃ0.89a3讨论3.1复方中药提取物对公兔精液品质的影响研究发现,精子密度㊁精子活率㊁精子活力是反映精液品质的重要指标[19]㊂J i m o h等[15]研究结果显示,中药饮食组雄兔的精子浓度㊁渐进运动性㊁曲线速度㊁平均路径速度和鞭打率均显著高于对照组,说明中药补充剂可促进雄兔精子产生㊁睾丸精子储备㊁睾丸激素及精子动力学㊂另外,中药来源的天然性使其内部含有的微量元素及矿物质相比通过化学方法提取的微量元素及矿物质更容易吸收,而哺乳动物的精浆中含有钙㊁镁㊁锌㊁硒等十几种微量元素,这些微量元素对精子的构成㊁成熟㊁获能㊁受精等有重要的作用[20]㊂在许多临床及动物试验中,雄性精子密度㊁精子活率等与雄性精浆中的矿物质含量(Z n㊁C u㊁S e)有着直接或间接的关联,其中矿物质元素Z n直接参与精子生成㊁成熟与获取能量过程,从而影响精活率[21]㊂本试验结果表明,饲粮中添加复方中药提取物可明显提高公兔精液品质,与对照组相比,试验Ⅱ㊁Ⅲ组在8~12周精子密度㊁精子活率㊁A级精子活力均有显著提高,其中试验Ⅲ组效果最为明显㊂推测试验Ⅲ组在满足精子的构成㊁成熟㊁获能㊁受精所需微量元素的基础上,加以调节机体机能对公兔生精功能起到了双相促进作用㊂配方中菟丝子㊁肉苁蓉㊁巴戟等具有促进机体的益气养血㊁补肾固精㊁抗氧化能力㊁新陈代谢的作用,且富含矿物质元素Z n㊁C u㊁S e㊁F e㊁M n㊁S e和维生素等[22]㊂Z n在生殖细胞发育和精子发生㊁精子细胞发育和成熟㊁射精㊁液化㊁精子和前列腺小体的结合㊁获能和受精的初始阶段起关键作用[23];S e对哺乳动物的正常精子发生至关重要[24]㊂可能是中药调节使机体内环境达到最优状态,为后续的生精提供了基础保障,同时促进了精子的产生及成熟[25]㊂本试验所用菟丝子㊁肉苁蓉㊁巴戟等复方中药提取物对公兔精液品质具有显著影响可能与中药中含有的相关活性物质有关,同时其中的微量元素和抗氧化可能具有同等协同作用,从而提高了公兔的繁殖性能㊂3.2复方中药提取物对公兔精子顶体完整率及畸形率的影响精子顶体完整性是哺乳动物精子㊁卵子组合过程中的一个关键因素㊂完整性是指精子膜完整的精子百分比,也是评估精子是否能够成功受精的一个重要参数㊂精子形态㊁顶体完整率㊁顶体反应率是评价精子功能的3项重要指标[26-27]㊂精子畸形率与机体内矿物质和维生素含量具有一定的联系㊂M n可干扰家兔精子的成熟,缺M n可导致精子数量减少,也可引起精子畸形[28]㊂试验Ⅲ组精子顶体完整率在8~12周均显著高于试验Ⅰ㊁Ⅱ组及对照组,试验组精子畸形率在第12周显著低于对照组㊂试验Ⅲ组复方中药提取物浓度较高,而提取物中大量蕴含中药自身Z n㊁C u㊁F e㊁M n等微量元素,微量元素对精子顶体完整性具有保护作用,精子保存时的膜损伤通常与活性氧(R O S)产生的脂质氧化有关㊂R O S 在精子生理学中发挥多种作用,从精子发生到运动的过程中微量元素参与了R O S水平的调节,且是参与抗氧化防御系统的重要酶的辅助因子[29]㊂微量元素是促进精子发生和类固醇激素合成的必需营养素,微量元素缺乏是导致畸形精子数量增加㊁精子活力降低的主要原因之一[30]㊂推测该复方中药提取物对公兔精子顶体完整率及畸形率的影响中巴戟天㊁胡芦巴㊁肉桂㊁菟丝子㊁补骨脂㊁肉苁蓉等中药中82113期王士勇等:复方中药提取物对公兔生殖生理的影响蕴含的天然矿物质元素起到至关重要的作用㊂韩洪军等[31]研究发现,菟丝子能够提高热应激下小鼠精子顶体完整率,同时在一定浓度范围内菟丝子浓度越大,其对热应激小鼠的生殖功能的调节越大;给药组精子畸形率明显低于对照组,与本试验结果相同㊂丁海荣等[13]研究表明,在饲粮中添加以淫羊藿㊁菟丝子㊁熟地黄等为主要成分的复方中药制剂可有效改善精子畸形率㊂本试验所选用复方中药提取物中也含有上述成分,因此该复方中药提取物对公兔精子顶体完整率和畸形率具有一定的调节作用㊂3.3复方中药提取物对公兔睾丸组织的影响本研究中,试验组公兔睾丸内大量曲精小管基底膜清晰可见,曲精小管上皮是由生精细胞与支持细胞构成的复层上皮,曲精小管上皮分布大量精原细胞和分化的精母细胞,管腔内可见数量丰富的精子,间质无明显异常㊂A b d u l a m e e r等[16]探究中药添加剂对雄兔生育能力影响发现,与对照组相比,试验组雄兔的生精小管初级和次级精细胞活性显著增强,血管生成增加,精子浓度㊁总精子活力均显著增加㊂说明中草药在治疗生殖障碍方面具有显著效果㊂韩洪军[32]在研究菟丝子对隐睾小鼠精子发生的影响时发现,菟丝子组60日龄小鼠的睾丸组织结构良好,各级生精小管上皮的生精细胞排列紧密,睾丸间质结构完整,内腔有较多精子㊂穆海龙[33]研究发现,杜仲叶乙醇提取物可增加小鼠睾丸指数,给药组能够显著增加小鼠附睾和睾丸曲细精管中的精子数量㊂本试验所用复方中药提取物中也含有上述成分,因此该复方中药提取物对公兔生殖器官具有一定的调节作用㊂3.4复方中药提取物对公兔生殖激素的影响激素能够调控动物生殖功能㊂血清中生殖激素含量是显示下丘脑-垂体-性腺轴功能的重要指标[34]㊂本研究中,与对照组相比,4~12周试验Ⅱ㊁Ⅲ组公兔血清中性激素含量均有显著提高,其中试验Ⅲ组效果最为明显㊂该中药复方中菟丝子占比较多,而菟丝子黄酮是其促进下丘脑-垂体促性腺功能的重要因素,且可提高垂体对促性腺激素释放激素的反应性[35]㊂试验组公兔在第12周时血清中F S H 及L H含量相比4~8周时明显减少,可能是4~8周公兔促激素水平较高,触发了机体保护作用,并进行了负反馈调节,进而使血浆中F S H及L H含量减少㊂4~12周试验组公兔睾酮水平均显著高于对照组,而睾酮含量的高低对动物精液质量具有重要影响㊂结合8~12周试验组公兔精子密度㊁精子活率及A级精子活力均显著高于对照组,可以证明该复方中药提取物通过影响机体激素水平进而影响繁殖性能㊂A t t i a等[17]研究表明,试验组雄兔的睾酮和生育能力高于对照组,精子浓度㊁总精子输出量㊁精子活率㊁精子活力及生育率均显著高于对照组,与本试验结果相同㊂研究发现,在公马㊁山羊基础饲粮中添加中药添加剂后,试验组F S H㊁L H及T含量均显著高于对照组[23,36]㊂因此,饲喂中药添加剂可显著提高动物性激素含量,改善繁殖性能㊂4结论本试验选用巴戟天㊁胡芦巴㊁肉桂㊁菟丝子㊁补骨脂㊁肉苁蓉等组成的复方中药提取物能通过提高公兔血清中性激素水平,改善睾丸组织及生精细胞的发育,从而提高精子顶体完整率,降低精子畸形率,提高精液品质,改善公兔繁殖性能,其中添加600m g/k g复方中药提取物效果最佳㊂参考文献(R e f e r 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