薏苡丙酮酸脱羧酶1(PDC1)基因片段cDNA克隆与分析

专利名称：一种从秋茄中克隆扩增出来的丙酮酸脱羧酶基因及其应用
专利类型：发明专利
发明人：尚琛晶,邓建文,周乔,王友绍,郝凌云
申请号：CN202010675629.1
申请日：20200714
公开号：CN112063638B
公开日：
20220318
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开一种从秋茄中克隆扩增出来的丙酮酸脱羧酶基因及其应用，其中，所述丙酮酸脱羧酶基因全长为2040bp，其核苷酸序列为SEQNO.1。

本发明从秋茄中克隆扩增出来了丙酮酸脱羧酶基因，并且探索了秋茄在水淹胁迫下丙酮酸脱羧酶基因的表达量变化，这为研究植物非生物胁迫响应打下基础，从而为通过提高秋茄的水淹胁迫耐受性，进而提高农作物或其他红树植物的非生物胁迫抗性并最终实现农作物产量的提高或为红树林的保护提供基因来源与技术支持。

申请人：深圳大学
地址：518060 广东省深圳市南山区南海大道3688号
国籍：CN
代理机构：深圳市君胜知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：徐凯凯
更多信息请下载全文后查看。

水稻羧酸酯酶基因OsCDAP的克隆及表达分析李臻;潘教文;王庆国;刘炜【期刊名称】《山东农业科学》【年(卷),期】2018(050)011【摘要】羧酸酯酶是一大类水解酶家族,催化短链脂肪酸酯键水解,在植物中参与除草剂代谢、信号分子激活、植物胁迫响应等过程.前期通过感染黑条矮缩病水稻数字表达谱鉴定到一个在病毒侵染后表达明显上调的羧酸酯酶基因.本研究以水稻中花11为材料克隆了该基因,将其命名为OsCDAP.生物信息学分析显示,该基因属于羧酸酯酶家族,与烟草中羧酸酯酶Nthsr203 J的相似性最高,可达95％.组织表达模式分析显示,该基因在水稻茎中表达量最高,且为赤霉素诱导表达,并受赤霉素合成抑制剂PAC的抑制.该研究为进一步解析羧酸酯酶基因功能奠定了基础.【总页数】6页(P10-15)【作者】李臻;潘教文;王庆国;刘炜【作者单位】山东省农业科学院生物技术研究中心/山东省作物遗传改良与生理生态重点实验室,山东济南 250100;山东省农业科学院生物技术研究中心/山东省作物遗传改良与生理生态重点实验室,山东济南 250100;山东省农业科学院生物技术研究中心/山东省作物遗传改良与生理生态重点实验室,山东济南 250100;山东省农业科学院生物技术研究中心/山东省作物遗传改良与生理生态重点实验室,山东济南250100;山东师范大学生命科学学院,山东济南 250014【正文语种】中文【中图分类】S511;Q785【相关文献】1.嗜卷书虱羧酸酯酶CarE基因克隆及表达分析 [J], 唐培安;李非凡;王进军;沈飞;宋伟2.褐飞虱羧酸酯酶基因cDNA片段的克隆及表达分析 [J], 杨之帆;何光存3.水稻OsFAH基因启动子的克隆及表达分析 [J], 胡超;陈彦成;任春梅;张学文;黄丽华4.水稻去泛素化酶OsUCH-L5基因的克隆及表达分析 [J], 陈立杰;方远鹏;杜巧丽;陈俊;蒋君梅;陈美晴;李向阳;谢鑫5.野桑蚕羧酸酯酶基因(BmmCarE-2)的克隆及表达分析 [J], 王东;李兵;王燕红;刘衬丽;赵华强;许雅香;沈卫德因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

地黄酪氨酸脱羧酶基因的克隆与表达分析酪氨酸脱羧酶TyDC是植物次生代谢的催化酶，在苯乙醇苷类成分的生物合成中发挥重要作用。

根据地黄转录组数据，克隆了地黄酪氨酸脱羧酶基因RgTyDC的全长cDNA序列（GenBank登录号KU640395），并进行生物信息学分析，采用实时荧光定量PCR（qRTPCR）检测其在地黄不同组织及4种诱导子处理后毛状根中的表达量。

结果表明，RgTyDC ORF为1 619 bp，编码509个氨基酸，相对分子质量为56.6 kDa，等电点pI 6.25。

RgTyDC与芝麻酪氨酸脱羧酶SiTyDC和猴面花酪氨酸脱羧酶EgTyDC的同源性最高，均为88%。

RgTyDC基因在叶片（尤其是衰老的叶片）中表达量较强，在块根中表达量较低。

SA和MeJA处理后显著上调表达。

这为进一步研究RgTyDC在地黄苯乙醇苷类成分生物合成中的分子功能奠定基础。

标签：地黄；酪氨酸脱氢酶；克隆；诱导子；表达地黄Rehmannia glutinosa L.为玄参科多年生草本植物，以块根入药，是我国著名的“四大怀药”之一，为常用大宗药材，具有重要的药用价值和经济价值。

其道地产区在河南古怀庆府（现焦作的温县、武陟、沁阳、博爱等地），山东、山西、黑龙江、甘肃等地也都有较大的种植面积。

目前在河南省焦作市（道地产区）种植面积已逾1.5万hm2，产值在数十亿元[1]。

研究表明，地黄含有丰富的苯乙醇苷类成分[23]。

苯乙醇苷类（phenylethanoid glycosides，PhGs）成分是一类由苯乙醇苷元与糖基结合而成的苷类化合物，又由于多数化合物糖上连有咖啡酰基或阿魏酰基，又称其为苯丙素类化合物（phenylpropanoid glycosides，PPGs）[4]。

玄参科、列当科、马鞭草科、唇形科、木犀科、车前科等多种双子叶植物中均有分布，具有抗菌、抗炎、抗氧化、免疫调节、保肝、抗肿瘤等多种药理性[5]。

目前关于植物苯乙醇苷类成分生物合成的分子机制研究报道较少。

丙酮酸羧化酶基因
丙酮酸羧化酶基因（PYC2）在细胞代谢中扮演着重要角色。

PYC2通过将细胞溶质丙酮酸驱向代谢途径的克雷伯循环，在控制丙酮酸积累方面发挥关键作用。

增加表达代谢优化PYC2基因的基因拷贝可有效触发丙酮酸流向线粒体代谢途径，并将糖酵解与TCA循环联系起来，以增强内部细胞能量代谢。

然而，在特定情况下，如肝细胞癌和胰岛β细胞中，p53可以抑制丙酮酸羧化酶（PC）的活性，从而抑制丙酮酸进入线粒体进行代谢。

这种抑制作用可能会导致三羧酸循环和氧化磷酸化受损。

丙酮酸羧化酶缺乏症是一种罕见的遗传病，由丙酮酸羧化酶基因变异导致。

这种病症主要表现为体内无法正常代谢丙酮酸，导致血液中丙酮酸浓度过高，进而引发一系列症状，包括恶心、呕吐、疲劳、头痛等。

该病的发病率较低，但对患者的生活质量和健康状况造成了严重影响。

丙酮酸羧化酶缺乏症是一种常染色体隐性遗传病，需要双亲均为携带者才有可能传递给下一代。

以上内容仅供参考，如需更详细的信息，建议咨询遗传学或医学领域的专家。

doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2019.04.004研究报告收稿日期：2019-04-23基金项目：国家自然科学基金（31570492）；黑龙江省教育厅重点项目（HDJCCX-2016Z05）作者简介：刘磊（1996-），男，硕士，（E-mail ）liuleiheida@ 通信作者：葛菁萍，（E-mail ）gejingping@Cre-loxP 重组酶技术敲除酿酒酵母丙酮酸脱羧酶编码基因pdc1和pdc5刘磊a ，b ，王长丽a ，b ，葛菁萍a ，b黑龙江大学 a.农业微生物技术教育部工程研究中心，黑龙江哈尔滨150500；b.生命科学学院微生物省高校重点实验室，黑龙江哈尔滨150080［摘要］目的：分别构建含有酿酒酵母丙酮酸脱羧酶基因pdc1和pdc5同源序列loxP-kanMX-loxP 的质粒，敲除丙酮酸脱羧酶基因。

方法：以两端含40bp pdc1或pdc5的同源序列为引物，以pUG6质粒DNA 为模板，通过PCR 扩增loxP-kanMX-loxP 基因敲除片段，将其分别插入pMD18-T 、pEASY-T3，构建表达载体pTWCL-PDC1与pTWCL-PDC5并测序，构建后的质粒利用醋酸锂转化法转化酿酒酵母H5，经筛选鉴定后进行摇瓶发酵试验。

结果：分别含有1693、1672bp 目的片段pdc1-loxP-kanMX 、pdc5-loxP-kanMX 的质粒pTWCL-PDC1与pTWCL-PDC5构建成功，发酵试验显示重组酿酒酵母H5-01与H5-02较原始菌株的乙醇产量分别下降了14.53%与17.54%，证明pdc1或pdc5基因被敲除。

结论：利用Cre-loxP 重组酶技术分别敲除了酿酒酵母pdc1和pdc5基因，为后续在酿酒酵母中连续敲除pdc1和pdc5奠定了良好的技术基础。

［关键词］酿酒酵母；丙酮酸脱羧酶；醋酸锂转化法；2，3-丁二醇［中图分类号］Q78［文献标识码］A［文章编号］1009-0002（2019）04-0479-07Cre-loxP Recombinase Technology Knocks out Saccharomy⁃ces cerevisiae Pyruvate Decarboxylase Encoding Genes pdc1and pdc5LIU Lei a,b ,WANG Chang-Li a,b ,GE Jing-Ping a,b *a.Engineering Research Center of Agricultural Microbiology Technology,Ministry of Education,Harbin 150500;b.Key Laboratory of Microbiology,College of Heilongjiang Province,School of Life Sciences,Harbin 150080;Hei⁃longjiang University,China*Corresponding author,E-mail:gejingping@［Abstract ］Objective:To construct plasmid containing homologous loxP-kanMX-loxP fragment of Saccharomyces cerevisiae pyruvate decarboxylase gene pdc1or pdc5to knock out pyruvate decarboxylase gene.Methods:The loxP-kanMX-loxP gene knockout fragments were amplified by PCR using homologous sequences containing 40bp pdc1or pdc5at both ends as primers from pUG6plasmid DNA template,and were inserted into pMD18-T and pEASY-T3to construct expression vectors pTWCL-PDC1and pTWCL-PDC5respectively and sequenced.The con⁃structed plasmid was transformed into S.cerevisiae H5by a lithium acetate conversion method,and subjected to a shake flask fermentation test after screening and identification.Results:The plasmids pTWCL-PDC1and pTWCL-PDC5containing the1693,1672bp fragment pdc1-loxP-kanMX and pdc5-loxP-kanMX respectively were success⁃fully constructed,and the fermentation experiments showed that the ethanol production of recombinant strains S.cere⁃visiae H5-01and H5-02decreased by14.53%and17.54%compared with the original strain respectively,demon⁃strating pdc1or pdc5gene knockout.Conclusion:pdc1and pdc5in S.cerevisiae were successfully knocked out by using the Cre-loxP recombinant enzyme technology,which laid a good technical foundation for the subsequent con⁃tinuous knocking out of pdc1and pdc5in S.cerevisiae.［Key words］Saccharomyces cerevisiae;pyruvate decarboxylases;lithium acetate transformation;2,3-butanediol2，3-丁二醇（2，3-butanediol；2，3-BD）及其衍生物是重要的平台化合物，在化工、燃料、食品等领域具有很高的应用价值[1-2]。

组胺（Histamine ，HA ）是由组氨酸脱羧酶（Histi－dine decarboxylase ，HDC ）催化L-组氨酸脱羧生成的一种重要生理活性介质。

适量的生物胺在人和动物活性细胞中发挥着重要的生理作用，但在人体内积累量较高时，会产生毒性作用［1］。

食品中组胺最大允许水平为50～100mg ／kg ［2］。

由于发酵食品中的组胺多由微生物通过分泌脱羧酶而生成，因此，控制原料中的微生物生长和抑制发酵剂中生物胺的形成对发酵食品的安全性至关重要。

目前，乳酸菌为发酵食品加工中常用的微生物发酵剂［3］，主要有：乳杆菌属、乳球菌属、肠球菌属、明串珠菌属等。

国外研究者正在对产组胺的微生物发酵剂进行分子生物学方面的研究，从而控制组胺的形成，但尚无突破性进展。

Lactobacillus sakei 、Te -tragenococcus muriaticus 、Lactobacillus buchneri 等的HDC 基因测序已完成，并公布于GenBank 上。

国内对食品中生物胺的控制主要是通过对生产工艺的优化来减少生物胺的形成。

本文通过对GenBank 中乳酸菌的HDC 基因序列进行比对，设计特异性引物，对提取的植物乳杆菌DNA 进行PCR 扩增，克隆HDC 基因的核苷酸序列，并与其他乳酸菌HDC 基因的核苷酸序列进行同源性分析，从而为产组胺乳酸菌的检测提供理论依据，也为进一步构建HDC 基因缺失工程菌奠定基础。

1.材料与方法1.1菌株及质粒植物乳杆菌（Lactobacillus plantrum ）Uvs44由黑龙江八一农垦大学食品微生物实验室前期诱变获得，用于低生物胺香肠的发酵；E .coli TG1由黑龙江八一农垦大学基因工程实验室保存；pMD18-T 载体购自TaKaRa 公司。

1.2主要试剂rTaqDNA 聚合酶、限制性内切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ、dNTPs 、DNA marker DL2000及DNA 片段回基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目（11531258）．作者单位：1黑龙江八一农垦大学食品学院（黑龙江大庆163319）；2九三集团天津大都科技有限公司（天津300040）．通讯作者：王长远，E-mail ：byndwcy＠163．com中国图书分类号Q 78文献标识码A 文章编号1004-5503（2010）11-1204-03【基础研究】植物乳杆菌组氨酸脱羧酶基因的克隆及序列分析于长青1王长远1满永刚2王颖1【摘要】目的克隆植物乳杆菌组氨酸脱羧酶（Histidine decarboxylase ，HDC ）基因，并进行序列分析。

利用可重复使用的URA3标记基因建立热带假丝酵母基因敲除系统项峥;陈献忠;张利华;沈微;樊游;陆茂林【摘要】Candida tropicalis, a diploid asporogenic yeast, is frequently utilized in industrial applications and research studies. However, the low efficiency of genetic transformation limits the strain improvement by metabolic engineering. A reliable transformation and efficient deletion of target gene are prerequisite for molecular improve-ment ofC. tropicalis. In this study, an efficient approach for genetic transformation ofC. tropicalis was devel-oped based on the URA3 gene as a reusable selection marker and both ofPDC allele genes encoding pyruvate decar-boxylase were successfully deleted by this approach. Firstly, an auxotrophic mutant strain ofC. tropicalis XZX which is defective in orotidine-5′-phosphate decarboxylase (URA3) was isolated by chemical mutagenesis combined with nystatin enrichment selection and 5-fluoro-orotic acid (5-FOA) resistance selection using C. tropicalisATCC 20336 as the parent strain. Then, the firstPDC deletion cassettePDC1-hisG-URA3-hisG-PDC1(PHUHP) which contains a 1.6 kb URA3 marker gene, two copies of 1.1 kbSalmonellahisG fragments and homologous arms of target gene was con-structed and transformed intoC. tropicalis XZX cells. Transformants with a single copy ofPDC deleted were isolated and identified by PCR and DNA sequencing, which was designated asC.tropicalis XZX02.TheC.tropicalis XZX02 cells were spread on the minimal mediumcontaining 5-FOA to generate mutant C. tropicalis XZX03 in whichURA3 marker gene was excised from PHUHP fragment integrated into thePDC gene site. The secondPDC gene dele-tion cassettePDCm-URA3-PDCm(MUM) was constructed and transformed intoC. tropicalis XZX03 to generate C.tropicalis XZX04 in which both ofPDC allele genes were deleted. All strains were confirmed by PCR and DNA sequencing. This efficient genetic transformation approach laid a foundation for further metabolic engineering ofC. tropicalis.%热带假丝酵母(Candida tropicalis)在发酵工业中具有重要的应用潜力，但二倍体遗传结构和较低的遗传转化效率限制了其代谢工程育种技术的应用。

移动单孢菌丙酮酸脱羧酶基因的克隆及表达任杰;郭丽清;贾娴;蒋雅红;游松【期刊名称】《沈阳药科大学学报》【年(卷),期】2006(23)11【摘要】目的克隆与表达移动单孢菌(Zymomonas mobilis)丙酮酸脱羧酶(Pyruvate decarboxylase,PDC)基因。

方法利用聚合酶链反应(PCR)技术从移动单孢的基因组DNA中扩增出PDCzm基因,构建其高效表达质粒,利用Ion和ompT 蛋白酶缺陷株Escherichia coli BL21(DE3)进行表达。

结果扩增出DNA碱基对数目约1.7 kb的PDCzm基因,成功构建其表达质粒pZM 22 b,对转化菌株的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)分析结果显示:该基因获得高效表达,表达蛋白占细胞总蛋白的37.9%。

结论成功构建高效表达PDCzm基因的工程菌株,为实现利用PDCzm进行的生物转化奠定了基础。

【总页数】4页(P735-738)【关键词】丙酮酸脱羧酶;移动单孢菌;聚合酶链反应;克隆;高效表达【作者】任杰;郭丽清;贾娴;蒋雅红;游松【作者单位】沈阳药科大学制药工程学院【正文语种】中文【中图分类】R914.5【相关文献】1.伊钮小单孢菌2-脱氧蟹肌醇氨基转移酶基因sisM的克隆与表达 [J], 曾志红;洪文荣;罗敏玉;戈梅;陈代杰2.运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 [J], 陆坚;韦宇拓;黄鲲;汪嵘;黄日波3.运动发酵单孢菌ZM4 adh Ⅱ基因的克隆及在大肠杆菌TOP10中的表达 [J], 谭力;陈介南;张伟涛;王义强;何钢4.运动发酵单孢菌ZM4-pdc基因的克隆及在大肠杆菌TOP10中的表达与活性分析 [J], 谭力;张伟涛;陈介南;王义强;韩笑5.酿酒酵母丙酮酸脱羧酶基因的克隆及表达 [J], 蒋雅红;游松;任杰;谢兰漪因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

丙酮酸脱羧酶催化合成L-苯基乙酰基甲醇的研究
姚尧;李继珩
【期刊名称】《中国药科大学学报》
【年(卷),期】1999(30)2
【摘要】用酵母的丙酮酸脱羧酶粗提物催化苯甲醛合成Ｌ－苯基乙酰基甲醇（Ｌ－ＰＡＣ），后者为合成Ｌ－麻黄素的前体。

酶转化反应的最佳温度为１０℃，ｐＨ６．８，时间为５～６ｈ，酶用量７ｕ／ｍｌ，乙醇２．０ｍｏｌ／Ｌ，苯甲醛１５０～１８０ｍｍｏｌ／Ｌ，丙酮酸１５０～２００ｍｍｏｌ／Ｌ，转化液中Ｌ－ＰＡＣ浓度可达１４０ｍｍｏｌ／Ｌ。

【总页数】4页(P115-118)
【关键词】丙酮酸脱羧酶;苯基乙酰基甲醇;催化;合成
【作者】姚尧;李继珩
【作者单位】中国药科大学生物制药学教研室
【正文语种】中文
【中图分类】TQ223.121
【相关文献】
1.左旋麻黄素半生物合成的研究固定化酵母细胞生物合成L-PAC(L-苯基乙酰基甲醇) [J], 胥秀英;郑一敏;温寿祯;曾素芳
2.裂殖酵母生物合成L-苯基乙酰基甲醇的研究 [J], 宁华中;许激扬;许娟;戴冕
3.左旋麻黄素半生物合成研究Ⅲ.L-苯基乙酰基甲醇的提取技术 [J], 郑一敏;马开森;
胥秀英;宋丹;涂永勤
4.左旋麻黄素半生物合成研究(Ⅰ)L-苯基乙酰基甲醇生物合成条件研究 [J], 胥秀英;郑一敏;温寿祯;曾素芳
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。