实验七、荧光显微镜及激光扫描共聚焦显微镜使用资料教程

Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜操作手册目录:1 系统得组成系统组成及光路示意图实物照片说明2 系统得使用2、1 开机顺序2、2 软件得快速使用说明2、3 显微镜得触摸屏控制2、4 关机顺序3 系统得维护1 系统得组成激光扫描共聚焦显微镜系统主要由:电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成。

系统组成及光路示意图:电脑工作站激光器电动荧光显微镜扫描检测单元实物照片说明:电动荧光显微镜扫描检测单元CO2 培养系统控制器激光器电脑工作站2 系统得使用2、1 开机顺序(1)打开稳压电源(绿色按钮)等待2 分钟(电压稳定)后,再开其它开关(2)主开关[ MAIN SWITCH ]“ON”电脑系统[ SYSTEMS/PC ]“ON”扫描硬件系统[ PONENTS ]“ON”(3)打开[ 电动显微镜开关]打开[ 荧光灯开关](注:具有5 档光强调节旋钮)(4)Ar 离子激光器主开关“ON”顺时针旋转钥匙至“—”预热等待约15分钟,将激光器[ 扳钮] 由“Standby”扳至“Laser run”状态,即可正常使用(5)打开[ 电脑开关],进入操作系统注:键盘上也具有[ 电脑开关]2、2 软件得快速使用说明(1)电脑开机进入操作系统界面后,双击桌面共聚焦软件ZEN 图标(2)进入ZEN 界面,弹出对话框:“Start System”——初始化整个系统,用于激光扫描取图、分析等。

“Image Processing”——不启动共聚焦扫描硬件,用于已存图像数据得处理、分析。

(3)软件界面:1 功能界面切换:扫描取图(Acquisition)、图像处理(Processing)、维护(Maintain) (注:Maintain仅供Zeiss专业工程师使用)2 动作按钮;3 工具组(多维扫描控制);4 工具详细界面;5 状态栏;6 视窗切换按钮;7 图像切换按钮;8 图像浏览/预扫描窗口;9 文档浏览/处理区域;10 视窗中图像处理模块动作按钮:Single ——扫描单张图片、并在图像预览窗口显示。

Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜操作手册目录：1 系统的组成系统组成及光路示意图实物照片说明2 系统的使用2.1 开机顺序2.2 软件的快速使用说明2.3 显微镜的触摸屏控制2.4 关机顺序3 系统的维护1 系统的组成激光扫描共聚焦显微镜系统主要由：电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成。

系统组成及光路示意图：电脑工作站激光器电动荧光显微镜扫描检测单元实物照片说明：电动荧光显微镜扫描检测单元CO2 培养系统控制器激光器电脑工作站2 系统的使用2.1 开机顺序（1）打开稳压电源（绿色按钮）等待2 分钟（电压稳定）后，再开其它开关（2）主开关[ MAIN SWITCH ]“ON”电脑系统[ SYSTEMS/PC ]“ON”扫描硬件系统[ COMPONENTS ]“ON”（3）打开[ 电动显微镜开关]打开[ 荧光灯开关]（注：具有5 档光强调节旋钮）（4）Ar 离子激光器主开关“ON”顺时针旋转钥匙至“—”预热等待约15分钟，将激光器[ 扳钮] 由“Standby”扳至“Laser run”状态，即可正常使用（5）打开[ 电脑开关]，进入操作系统注：键盘上也具有[ 电脑开关]2.2 软件的快速使用说明（1）电脑开机进入操作系统界面后，双击桌面共聚焦软件ZEN 图标（2）进入ZEN 界面，弹出对话框：“Start System”——初始化整个系统，用于激光扫描取图、分析等。

“Image Processing”——不启动共聚焦扫描硬件，用于已存图像数据的处理、分析。

（3）软件界面：1 功能界面切换：扫描取图（Acquisition）、图像处理（Processing）、维护（Maintain）（注：Maintain仅供Zeiss专业工程师使用）2 动作按钮；3 工具组（多维扫描控制）；4 工具详细界面；5 状态栏；6 视窗切换按钮；7 图像切换按钮；8 图像浏览/预扫描窗口；9 文档浏览/处理区域；10 视窗中图像处理模块动作按钮：Single ——扫描单张图片、并在图像预览窗口显示。

激光扫描共聚焦荧光显微镜的成像原理和基本结构显微镜操作规程（激光扫描共聚焦荧光显微镜）是一种利用计算机、激光和图像处理技术获得生物样品三维数据、先进的分子细胞生物学的分析仪器。

紧要用于察看活细胞结构及特定分子、离子的生物学变化，定量分析，以及实时定量测定等。

成像原理接受点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。

分光器将荧光直接送到探测器。

光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。

两者的几何尺寸一致，约100—200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。

这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。

以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，终在屏幕上聚合成清楚的整个焦平面的共聚焦图像。

每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横切面总是有确定厚度的，又称为光学薄片。

由于焦点处的光强宏大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深貌似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待察看样品聚焦光斑处二维的光学切片。

把X—Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。

即检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔。

激光共聚焦的工作原理简单表达就是它接受激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机掌控来进行数字化图像采集和处理的系统。

基本结构（激光扫描共聚焦显微镜系统）紧要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。

激光共聚焦操作步骤激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM），是一种光学显微镜，利用激光和扫描镜技术，能够对样品进行高分辨、高对比度的三维成像。

下面将介绍激光共聚焦显微镜的操作步骤。

1.准备工作：a.打开显微镜电源，确保仪器处于正常工作状态。

b.打开激光源电源，等待激光系统启动。

c.准备样品，将样品放置在载玻片上，并使用封口膜或密封胶固定。

2.调节孔径光阑：a.打开镜头盖，取下玻璃保护盖。

b.观察显微镜视野，调节孔径光阑的大小，以获得最佳的入射光。

c.用合适的滤光片选择适当激光激发波长。

3.调节激光功率：a.打开激光源的控制面板。

b.选择合适的激光功率，通常初次使用时可选择较低功率。

c.通过目镜观察激光处于合适的位置和方向，避免直接观察激光。

4.调节焦距：a.打开目镜盖，观察样品上的图像。

b.调节目镜的焦距，获得清晰的图像。

c.使用恰当的倍率进行观察，确保所需的细节可见。

5.调节光路：a.打开激光共聚焦显微镜软件，进行光路调节。

b.调节反射镜和聚焦镜，确保激光能够准确地聚焦在样品上。

c.通过调节扫描镜，使激光能够扫描整个样品。

6.设置扫描参数：a.在软件中选择扫描参数，如扫描速度、像素大小等。

b.减至最小的扫描区域，以便首先观察最感兴趣的区域。

c.如有需要，可以进行连续扫描或者多通道扫描的设置。

7.开始扫描：a.点击软件界面上的“开始”按钮，开始扫描。

b.观察扫描时光点在样品上的移动情况，确保图像的获取和处理是正确的。

c.根据需要调整扫描参数，以获得更好的图像质量。

8.界定感兴趣区域（ROI）：a.选择感兴趣的图像区域，用鼠标进行界定。

b.设置参数，如增益、对比度、亮度等，以便获得更好的视觉效果。

c.按下截图按钮，将感兴趣的图像保存下来。

9.分析和处理图像：a.关闭扫描功能，进入图像处理模式。

b.使用软件提供的功能分析和处理图像，如三维重建、图像拼接等。

激光扫描共聚焦显微镜操作流程详解激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope)激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope)，英⽂简写LSCM，俗称confocal。

LSCM是⼀种⾼科技显微镜，属于最先进的细胞⽣物学分析仪器。

我们学院使⽤的是瑞⼠徕卡公司(Leica)的TCS SP5型号的LSCM。

使⽤流程1、登陆ftp://10.31.60.139 或5号楼606室公⽤电脑下载《激光共聚焦预约使⽤审核表》，打印并填写。

2、联系卢剑清（⼿机：135********）审核并签名。

3、持已签名的《激光共聚焦预约使⽤审核表》⾄5号楼610室预约使⽤时间，及领取钥匙，联系⼈：窦凯飞（⼿机：152********）。

4、在熟练使⽤者的指导下，进⾏实验。

5、实验结束，及时归还钥匙。

仪器构造和原理LSCM的基本结构主要包括荧光显微镜系统及样品台、激光发射器、扫描器、检测器、图像存储处理和输出设备、计算机控制系统。

激光光源：激光扫描束经照明针孔形成点光源, 普通显微镜采⽤的⾃然光或灯光是⼀种场光源, 标本上每⼀点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的⼲扰。

⽽LSCM 以激光为光源, 激光具有单⾊性强﹑⽅向性好﹑⾼亮度﹑相⼲性好等优点, 可以避免普通显微镜的缺点。

⼀般常⽤的⽓体激光器如氩(Ar) ﹑氪(Kr) ﹑氦(He)﹑氖(Ne)。

illuminating pinhole（照明针孔）：使激光经过照明针孔后形成点光源，点光源具有光源⽅向性强、发散⼩、亮度⾼、⾼度的空间和时间相⼲性以及平⾯偏振激发等独特的优点。

且与detector pinhole(探测器针孔)及焦平⾯形成共聚焦装置。

分光镜(BeamSplitter)：点光源发出的光经分光镜反射后, 通过物镜在样品聚焦。

对标本内焦平⾯上的每⼀点进⾏扫描,Focal plane（焦平⾯）：激光点光源照射物体在焦平⾯处聚焦，激发荧光标记的样本发射荧光，形成焦点光斑。

荧光显微镜操作手册说明书荧光显微镜是一种重要的显微镜，常用于生物医学研究、细胞生物学、遗传工程和药物研发等领域。

本操作手册将详细介绍荧光显微镜的使用方法和注意事项，以帮助用户正确、高效地操作荧光显微镜。

在开始操作之前，请确保仔细阅读本手册，并按照指示进行操作。

材料准备在使用荧光显微镜之前，需要准备以下材料：1. 标本或样品：根据实验的需要，准备好荧光标记的细胞、组织或其他待观察的物质。

2. 封片：将标本放置在封片上，以便于放置到显微镜观察。

3. 荧光染料：根据实验需求，选择适当的荧光染料，并按照说明书的要求进行染色。

操作步骤以下是荧光显微镜的基本操作步骤：1. 准备显微镜：a. 检查显微镜是否处于正常工作状态，确保电源连接正常。

b. 调整光源的亮度，以便于观察样品。

c. 确认滤光片的波长与荧光染料的激发波长相匹配。

2. 样品安装：a. 将封片放置在显微镜的物镜台上，并通过样品夹固定。

b. 调节物镜的焦距，以获得清晰的视野。

3. 荧光设置：a. 根据荧光染料的激发波长，选择合适的滤光片，并将其安装在显微镜上。

b. 调节荧光染料的激发光源，确保样品被充分激发。

4. 观察：a. 使用目镜对准感兴趣的区域，并调节放大倍数，以获得所需的放大效果。

b. 使用荧光滤光片，观察样品的荧光发射情况。

c. 调节显微镜的对焦，以获得清晰的图像。

注意事项为了保证操作的准确性和安全性，请遵守以下注意事项：1. 操作前请佩戴个人防护装备，如实验手套和护目镜。

2. 避免直接暴露在荧光光源下，以免眼睛受伤。

3. 调节荧光染料激发光源的强度时，逐渐增加光线强度，以避免损坏样品。

4. 操作完成后，请关闭显微镜和荧光光源，并将其清洁干净。

维护保养及时进行维护保养可以延长荧光显微镜的使用寿命和保证其正常工作。

以下是一些建议的维护保养步骤：1. 定期清洁显微镜的透镜和物镜，避免灰尘和污垢的影响。

2. 注意橡胶密封件的保养，防止老化和松动。

荧光显微镜使用方法
荧光显微镜是一种常用的显微镜，用于观察样品中的荧光发射。

下面是荧光显微镜的使用方法：
1. 准备样品：将待观察的样品制备好，例如细胞、组织切片等。

2. 准备溶液：根据样品的要求，准备好适当的荧光染料或荧光探针溶液。

3. 调整显微镜：将荧光显微镜调整到合适的工作状态。

首先打开显微镜的光源，调节亮度和对比度，确保适当的照明条件。

然后根据荧光染料的激发波长，选择合适的滤光片安装在光源和物镜之间。

4. 定位样品：将样品放置在显微镜的样品台上，并使用样品台上的移动装置将样品调整到适当的位置。

5. 调节对焦：使用显微镜的焦距调节旋钮或移动装置，将样品调焦到清晰的图像。

可以使用目镜调焦，然后再使用物镜调焦，以获得更高的放大倍数。

6. 切换到荧光模式：调整显微镜的光源切换到荧光模式。

根据需要，在荧光探针激发波长的范围内选择合适的激发滤光片和荧光滤光片，并将它们安装在光源和物镜之间。

7. 观察和记录图像：通过目镜观察到样品中的荧光发射，并使用显微镜配备的相机或摄像设备拍摄或记录图像。

8. 清洁和存储：使用完毕后，关闭显微镜的光源，将样品从样品台上取下，并清洁显微镜的镜头和样品台。

然后，将显微镜保存在干燥、清洁的地方，以防止灰尘和污染。

以上是荧光显微镜的基本使用方法，根据不同的实验要求和样品特性，可能还需要进行其他调整和操作。

激光扫描共聚焦显微镜（A1R-si）操作指南目录第一章：Ti-E 显微镜操作2-7 显微镜光路调节和照明注意事项 6Ti-E 物镜，DIC 插片，DIC 棱镜对照表7第二章：共聚焦开关机8-10 第三章：共聚焦图像拍摄1-38NIS-Elements C 软件开启和操作界面简介1-15NIS-Elements C 的实时图像获得基本操作16-23图像拍摄24-27探测模式（标准探测器）设置28-38 第四章: 图像的保存和查看39-42 第五章：图像分析43-46 附件一、多维拍摄功能和操作方式介绍47-51附件二：图像格式批量转换操作52-53第一章Ti-E 显微镜操作指南（一）认识显微镜各个部件（1）滤光片：包括D---毛玻璃；NCB---色温（8）滤色块转盘（包括DIC 检偏器）；平衡片；ND---减光片；“G IF”---绿色滤（9）手动荧光光闸；光片和用于PFS 的红外滤光片；（10）电动焦距调节旋钮；（2）视场光阑；（11）ND 减光片；（3）聚光器升降旋钮；（12）遥控器；（4）起偏器（DIC 用）；（13）透射光电源；（5）聚光器对中旋钮；（14）汞灯荧光光源；（6）孔径光阑；（15）PFS 控制器（7）聚光器模块（包括明视场，DIC）；（16）HUB 控制器遥控器示意图(根据具体配置有些图标可能不显示)1）物镜切换按钮；2）滤光块，DIC 检偏器切换按钮；3）DIC 检偏器快速切换按钮；4）光路端口切换按钮；5）PFS 开关控制按钮；6）聚光器转盘切换按钮；7）透射光源控制按钮*。

*请注意：CNTL 按钮灯亮，则可以通过遥控器或电脑控制软件来调节透射光源强度，此时显微镜底座左侧光源开关和调节旋钮锁定；CNTL 功能关闭，可以通过显微镜底座开关和旋钮来控制透射光源。

前面板示意图1）状态显示屏；2）PFS 开关按钮和PFS 聚焦状态指示灯（需要选购PFS 部件）；3）光路端口切换按钮；4）中间变倍旋纽；侧面板示意图1）调焦旋钮2）粗微调切换按钮3）物镜切换按钮；4）滤光块，DIC 检偏器切换按钮5）透射光光源开关（当遥控器透射光源控制按钮打开时，此按钮无效）；6）透射光量度调节旋钮（当遥控器透射光源控制按钮打开时，此旋按钮无效）；7）物镜复位；8）物镜向下移动2 毫米；注意：在使用显微镜之前，要把主机底座右后端的黑色HUB 控制器（显微镜示意图15 位置）右侧的电源开关打开。

Zeiss 激光扫描共聚焦显微镜操作手册目录：1 系统的组成系统组成及光路示意图实物照片说明2 系统的使用2.1 开机顺序2.2 软件的快速使用说明2.3 显微镜的触摸屏控制2.4 关机顺序3 系统的维护1 系统的组成激光扫描共聚焦显微镜系统主要由：电动荧光显微镜、扫描检测单元、激光器、电脑工作站及各相关附件组成。

系统组成及光路示意图：电脑工作站激光器电动荧光显微镜扫描检测单元实物照片说明：电动荧光显微镜扫描检测单元CO2 培养系统控制器激光器电脑工作站2 系统的使用2.1 开机顺序（1）打开稳压电源（绿色按钮）等待2 分钟（电压稳定）后，再开其它开关（2）主开关[ MAIN SWITCH ]“ON”电脑系统[ SYSTEMS/PC ]“ON”扫描硬件系统[ COMPONENTS ]“ON”（3）打开[ 电动显微镜开关]打开[ 荧光灯开关]（注：具有5 档光强调节旋钮）（4）Ar 离子激光器主开关“ON”顺时针旋转钥匙至“—”预热等待约15分钟，将激光器[ 扳钮] 由“Standby”扳至“Laser run”状态，即可正常使用（5）打开[ 电脑开关]，进入操作系统注：键盘上也具有[ 电脑开关]2.2 软件的快速使用说明（1）电脑开机进入操作系统界面后，双击桌面共聚焦软件ZEN 图标（2）进入ZEN 界面，弹出对话框：“Start System”——初始化整个系统，用于激光扫描取图、分析等。

“Image Processing”——不启动共聚焦扫描硬件，用于已存图像数据的处理、分析。

（3）软件界面：1 功能界面切换：扫描取图（Acquisition）、图像处理（Processing）、维护（Maintain）（注：Maintain仅供Zeiss专业工程师使用）2 动作按钮；3 工具组（多维扫描控制）；4 工具详细界面；5 状态栏；6 视窗切换按钮；7 图像切换按钮；8 图像浏览/预扫描窗口；9 文档浏览/处理区域；10 视窗中图像处理模块动作按钮：Single ——扫描单张图片、并在图像预览窗口显示。

荧光显微镜的使用流程讲解一、准备工作1.确保荧光显微镜的正常运行状态，检查是否已安装好所需荧光滤光片和目标物镜。

2.打开显微镜电源，待灯泡亮起后，调节亮度到合适的水平。

3.确保使用的载玻片或培养皿已清洁干净，无污垢和杂质。

二、样品处理1.取出要观察的样品，并根据实验要求进行处理，如染色、固定等。

注意，使用荧光染料时应避免暴露在光线下和其他自然光源。

2.在滴液架上滴上适量的液体样品，覆盖胶片或盖玻片。

三、调节显微镜1.将样品载玻片放在显微镜的载物台上，将载物台垫片固定好。

2.调节照明光源，将光线调至适合观察的强度，并使用亮度调节旋钮获得清晰的视野。

3.转动物镜转盘，选择合适的目标物镜。

一般来说，低倍（如4倍或10倍）用于整体观察，高倍（如40倍或100倍）用于观察细胞结构等。

四、对焦和观察1.初步对焦：通过调节焦距手轮，将物镜移到与载玻片非常接近的位置，并微调焦距观察样品的大致轮廓。

2.高倍对焦：使用粗调焦距手轮将物镜缓慢下移，直到目标物体的轮廓清晰可见。

然后使用细调焦距手轮进行最后的微调，以获得清晰的焦点。

3.观察：使用目镜观察并调整试镜筒高度，使样品的细节清晰可见。

如果需要，可以调节对比度、色彩和亮度来优化观察效果。

五、荧光成像1.切换到荧光模式：根据所用荧光染料选择合适的荧光滤光片，并将其插入滤光片插槽中。

2.调整曝光时间：通过设置合适的曝光时间，确保获得适当的荧光强度，并避免过曝或欠曝。

3.观察和记录：通过目镜观察荧光信号，并使用相机或图像捕捉软件记录所得图像。

六、保存和分析1.将观察到的荧光图像保存到电脑或存储介质中，便于后续处理和分析。

2.如果需要，可以使用图像处理软件对图像进行调整、增强和分析，以获得更详细的信息。

七、结束操作1.关闭显微镜电源，待灯泡冷却后再关闭仪器。

2.清洁和保养：将使用过的载玻片和盖玻片进行清洁，并检查显微镜是否有任何损坏或污垢，及时进行维护和保养。

以上就是荧光显微镜的使用流程讲解。