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副猪嗜血杆菌黏附基因的表达和免疫原性鉴定耿屹;曹荣峰;高晓宇;李守军;张桂红【摘要】为获得副猪嗜血杆菌(HPS)黏附素基因的表达产物并对其进行免疫原性鉴定.本研究采用PCR技术扩增了HPS黏附素基因序列,将扩增产物与表达载体pET-32a(+)连接,得到表达重组质粒.通过EcoRV和HindⅢ双酶切鉴定和测序确认正确后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达.经SDS-PAGE电泳分析,获得了59.5ku的表达产物,与预期大小的黏附素蛋白分子量一致.经western blot检测,表达产物与HPS阳性血清反应,证明表达产物具有一定的免疫活性.提示本研究所表达的蛋白将有助于HPS的血清学诊断和疫苗的研发.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2010(032)005【总页数】3页(P398-400)【关键词】副猪嗜血杆菌;黏附素基因;表达;免疫原性鉴定【作者】耿屹;曹荣峰;高晓宇;李守军;张桂红【作者单位】山西农业大学动物科技学院,山西,太谷,030801;青岛农业大学动物科技学院,山东,青岛,266109;华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642;华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642;华南农业大学兽医学院,广东,广州,510642【正文语种】中文【中图分类】S852.61副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)是猪上呼吸道的一种常在的条件性致病菌，可引起猪的纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的革拉瑟氏病(GIasser's disease)[1-2]。
HPS是一种NAD依赖型、不运动的革兰氏阴性细小杆菌，属于巴斯德菌科(Pastteurellaceae)嗜血杆菌属(Haemophilus)。
该菌多与其他病原，如猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒等混合感染，严重危害仔猪和青年猪的健康[3]。
近年来由于该病的频繁发生，给养猪业造成严重的损失，因此倍受人们的关注。
副猪嗜血杆菌oppA基因的克隆、表达及间接ELISA检测方法的建立车勇良;陈如敬;江斌;王隆柏;魏宏;吴学敏;庄向生;周伦江【摘要】采用PCR方法扩增副猪嗜血杆菌(Hps)的寡肽结合蛋白(OppA)基因,序列测定结果表明,扩增片段全长1654 bp.将扩增片段插入表达载体pGEX-6P-1中,转化BL21进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明,重组融合蛋白大小约为87 ku,以纯化的重组蛋白OppA作为抗原,建立Hps抗体的间接ELISA检测方法.通过试验确定最佳的反应条件为:抗原包被浓度为1.0 μg·孔-1,于37℃包被1h,待检血清的稀释度为1∶50,阳性判断标准(D450nm)大于0.643.特异性和重复性试验结果表明,建立的间接ELISA方法具有良好的特异性和稳定性,可用于Hps抗体的检测.【期刊名称】《福建农林大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2015(044)003【总页数】7页(P282-288)【关键词】副猪嗜血杆菌;寡肽结合蛋白基因;克隆;表达;间接ELISA【作者】车勇良;陈如敬;江斌;王隆柏;魏宏;吴学敏;庄向生;周伦江【作者单位】福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建福州350013【正文语种】中文【中图分类】S852.61副猪嗜血杆菌病又称革拉泽氏病［1］，是由副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，Hps）引起的一种条件性细菌病，主要表现为仔猪的纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎等［2－3］.副猪嗜血杆菌病多为继发［4］，通常是由猪圆环病毒病、猪呼吸与繁殖障碍综合征、猪瘟和猪伪狂犬病引起仔猪免疫力下降而导致的，其发病率为10% －15%，死亡率可达50%以上，给我国甚至全世界的养猪业造成了巨大的经济损失.通过琼脂扩散试验，可将Hps分为15个血清型［2］，但还有20% －30%的菌株不能通过此方法定型，我国目前流行的主要血清型为血清4、5和13型.细菌寡肽透过酶（oligopeptide permease，Opp）输送系统的主要功能是从环境中摄取和运送寡肽营养物质进入细菌内［5］.Opp存在于革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌中，opp基因是由oppA、oppB、oppC、oppD和oppF 5个基因构成的基因簇，其编码产物形成跨膜通道，主要功能是输送由3－5个氨基酸组成的小肽，属于ABC输送器家族［5］.而寡肽结合蛋白（OppA）是一种底物结合蛋白，位于革兰氏阴性菌的细胞质中［5］，主要功能是捕获寡肽或作为细胞膜表面受体，是非常保守的一种蛋白质，可以作为该细菌的一种诊断抗原. 目前已有多种方法用于Hps病原和抗体的检测，其中用于病原检测的有PCR方法［6］、Southern杂交技术［7］、补体结合试验［8］和环介导等温扩增方法（LAMP）［9］;用于抗体检测的有间接血凝试验［10］和间接ELISA方法［11］.间接血凝试验的稳定性较差，而间接ELISA方法的稳定性较好.因此，本试验通过扩增出Hps oppA基因序列，转化原核表达载体pGEX-6P-1进行原核表达，纯化表达蛋白，包被酶标板，建立Hps抗体检测试剂，旨在为副猪嗜血杆菌病的预防和控制提供依据.Hps由本实验室分离保存;胰酶大豆琼脂培养基（TSA）、胰酶大豆肉汤培养基（TSB）、胰蛋白胨和酵母提取物均购自BD Difco公司;小牛血清从杭州四季青公司购得;NAD和辣根过氧化物酶标记的兔抗猪二抗购自Roche公司;pMD18-T simple载体、Taq酶和限制性内切酶等分子生物学试剂购自TaKaRa公司.1.2.1 Hps DNA的提取将冻存的细菌划线接种于含5%小牛血清和0.005%NAD的TSA琼脂平板中，于37℃培养过夜.挑取单个菌落接种于含5%小牛血清和0.005%NAD的TSB液体培养液中，于37℃振摇培养过夜.离心沉淀后加入PBS重悬，按照CTAB/NaCl方法［12］提取细菌基因组DNA，自然干燥后溶于TE中置－20℃保存备用.1.2.2 oppA基因的PCR扩增根据SH0165株的oppA基因，用生物软件Primier 5.0设计1对特异性引物，扩增Hps oppA的全基因.上游引物OP1的序列:5'－CAGGATCCATGCAAACAACCTTTACC－3'（下划线部分为Bam HⅠ酶切位点）;下游引物OP2的序列:5'－CGCTCGAGTTACTGCTTAATGATATA －3'（下划线部分为XhoⅠ酶切位点）.以Hps DNA为模板，采用特异性引物OP1/OP2进行PCR扩增.反应条件为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min、50℃复性1 min、72℃延伸1 min，共35个循环;72℃延伸10 min.4℃保存.于80 V、1%琼脂糖凝胶电泳40 min，采用凝胶成像系统观察结果.1.2.3 oppA基因的克隆与测序将回收的PCR产物和T载体于16℃连接1 h，转化感受态DH5α，并接种于含有氨苄青霉素的LB琼脂平板中，于37℃培养箱倒置培养12－19 h.挑取菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，并放置在摇床于37℃振摇12 h左右，用质粒提取试剂盒提取质粒.将PCR鉴定为阳性的质粒命名为pMD18-T-OppA，阳性质粒的序列送TaKaRa公司测序.1.2.4 重组表达载体的构建及阳性重组菌的筛选、鉴定将阳性质粒pMD18-T-OPPA和pGEX-6P-1载体均用Bam HⅠ和XhoⅠ进行双酶切，回收目的片段和载体的酶切产物，按常规方法建立10μL的连接体系，于16℃连接过夜以构建重组表达质粒pGEX-OPPA.取连接产物按常规方法转化感受态细菌BL21（DE3），于37℃培养过夜.挑取单菌落在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中进行培养，并用质粒试剂盒提取质粒，采用PCR方法筛选阳性质粒.1.2.5 重组菌的诱导表达及SDS-PAGE分析阳性重组菌在2 mL LB培养基（含60μg·mL－1氨苄青霉素）中于37 ℃、250 r·min－1摇床振摇培养至 D600nm 约为 0.6，分别加入终浓度为 1、2 和4 mmol·L－1的IPTG后继续在相同条件下分别诱导3和6 h，同时设不加IPTG的培养管作为阴性对照，设PGEX空载体培养管作为平行对照.1.2.6 包涵体的提取及纯化收获的阳性重组菌菌液经离心后用PBS重悬菌体，超声波破碎后，于12000 r·min－1、4 ℃离心10 min，弃掉上清，沉淀用洗涤液（含10 mmol·L－1 Tris-HCl、1 mmol·L－1 EDTA 和2 mol·L－1尿素）洗涤20 次，然后用溶解变性液（含10 mmol·L－1 Tris-HCl、1 mmol·L－1 EDTA 和8 mol·L－1尿素）溶解包涵体，以10倍于原体积的PBS稀释溶解后的包涵体进行透析复性，用蛋白纯化柱纯化蛋白.1.2.7 抗原最适包被浓度和HRP-羊抗猪二抗浓度的确定按照方阵滴定法优化ELISA反应条件.原核表达蛋白抗原分别以 2.0、1.5、1.0 和0.5 μg·孔－1包被于酶标板中，HRP 标记二抗按1∶20000、1∶30000和1∶40000稀释，并设阴性血清作对照，组成方阵，按间接ELISA方法操作.比较阴、阳性血清的D450nm和P/N（P为阳性血清的D450nm，N为阴性血清的D450nm），确定抗原的最佳包被浓度，相对应的HRP标记的二抗稀释度为最佳二抗稀释度.1.2.8 待检血清稀释度的确定以最佳浓度的抗原包被酶标板，洗涤后，用封闭液封闭.接着将待检血清作1∶25，1∶50，1∶100 3个稀释度，同样的稀释度共设两孔，按间接ELISA方法操作，在酶标仪上读出D450nm.通过比较阴、阳性血清的P/N来确定最佳的待检血清稀释度.1.2.9 阴、阳性临界值的确定用已建立的间接ELISA方法检测临床采集的30份无Hps病原感染的阴性猪血清，计算阴性血清的平均D450nm（）和标准方差（SD）+2SD为阴、阳性临界值，凡超过临界值的判为阳性，否则判为阴性.1.2.10 间接ELISA特异性试验应用建立的间接ELISA方法检测猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌、猪大肠杆菌、猪圆环病毒2型和猪蓝耳病病毒的阳性血清，并设Hps阴、阳性血清作为对照，以检测其特异性. 1.2.11 间接ELISA方法重复性的测定取阴、阳性标准血清，采用建立的间接ELISA方法进行4次重复性试验，每次6孔.应用Excel软件对试验数据进行多因素方差分析，根据P的大小确定差异显著性，进而证明建立的间接ELISA方法的稳定性.1.2.12 临床血清样品的检测检测2010－2012年本研究室收集的来自福州、泉州和厦门等8个地区猪场共194份血清，了解福建省Hps的流行情况.PCR扩增结果（图1）显示，扩增出的目的基因片段大小为1654 bp，与预期目的片段大小相符.挑取测序结果与预期一致的阳性质粒，与pGEX-6P-1同时双酶切并进行连接，转化DH5α，凃于LB琼脂平板，待生长后挑取单个菌落接种于LB液体培养基中，提取质粒，进行PCR鉴定.鉴定结果（图2）表明，阳性重组质粒能扩增出与预期一致的条带.SDS-PAGE分析结果（图3）显示，重组菌经2 mmol·L－1 IPTG诱导6 h后，出现一条大小为87 ku的条带，与预期大小一致.按照方阵滴定法优化ELISA反应条件并进行间接ELISA操作.结果（表1）显示，随着抗原浓度的降低，阴、阳性血清的D450nm相应地下降.当抗原浓度为1.0μg·孔－1，二抗稀释度达1∶30000时，其P/N最高，为3.028.因此，选择抗原最适的包被浓度为1.0μg·孔－1，HRP标记的二抗稀释度为1∶30000.表2表明，血清稀释度为1∶50时，其P/N最高，故确定血清最佳稀释度为1∶50.表3表明，30份阴性血清 D450nm的平均值为 0.514，标准方差为0.06473，临界值为0.643.因此，当D450nm大于0.643时，可以判定Hps抗体为阳性，反之，即为阴性.表4显示:包被抗原与抗猪传染性胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌2型、猪多杀性巴氏杆菌、猪大肠杆菌、猪圆环病毒2型和猪蓝耳病病毒的标准阳性血清不反应，呈阴性反应;抗原与抗Hps的标准阳性血清呈阳性反应，与抗Hps标准阴性血清不反应.表明本试验建立的间接ELISA方法特异性好.方差分析结果显示:阳性血清的P大于0.05，差异不显著（表5）;阴性血清的P也大于0.05，差异也不显著（表6）.表明建立的间接ELISA方法具有良好的稳定性. 检测2010－2012年本研究室收集的来自福州、泉州和厦门等8个地区猪场共194份血清，了解福建省Hps的流行情况;同时应用海博莱Hps血清抗体检测试剂盒和建立的间接ELISA方法对收集的194份血清进行Hps抗体检测.海博莱检测试剂盒的阳性检出率为36.78%，而建立的间接ELISA方法的阳性检出率为51.32%，两者的阳性检出率的符合率为71.67%，符合率较低（表7）.近年来，猪场呼吸道疾病日益严重，而Hps作为一种条件性致病菌引起的危害也日趋严重.由于培养条件苛刻，Hps的分离率较低;很多用于病原菌检测的方法必须以分离的病原菌DNA为模板，这样就导致了很多副猪嗜血杆菌病不能被确诊.因此，急需一种诊断方法用来确诊该病，而用于抗体检测的血清学方法有利于该病的大规模普查和快速诊断.间接ELISA方法是血清学检测方法中一种较为简便、敏感、特异的方法，比间接血凝试验更准确和敏感［13－14］.选择一种合适的包被抗原是建立间接ELISA检测方法的关键.国内石碧等［15］和王艳等［16］分别选用荚膜多糖和全菌体作为包被抗原建立了检测Hps抗体的间接ELISA方法，取得了较好的试验效果;陈善真等［17］使用原核表达载体pET32a（+）表达了外膜蛋白P5，并用该蛋白包被酶标板建立了间接ELISA方法，该方法特异性好、重复性好，检出率与Hps的临床分离率接近，可用于Hps的临床检测、流行病学调查和免疫监控;贾爱卿等［18］和李鹏等［19］也使用原核表达载体表达了外膜蛋白P2，并把该蛋白作为包被抗原建立了检测Hps抗体的间接ELISA方法，该方法的敏感性和特异性也较好.而Opp属于ABC输送系统家族成员，ABC输送系统是细菌中最大的旁系同源蛋白家族之一，占细菌基因组的5%，控制着必需营养物质进出细菌［20］，并且具有其他多种生物功能［21－22］. OppA作为Opp的成员之一，是非常保守的.因此，本试验选用原核表达载体pGEX-6P-1表达OppA，并把该蛋白作为包被抗原，通过优化确定包被抗原浓度，酶标二抗浓度，待检血清稀释度和阴、阳性临界值，建立了Hps抗体检测的间接ELISA方法，并对该方法的特异性、重复性进行了测定，通过对血清样品的检测证实该间接ELISA方法具有简便、敏感、特异性和稳定性好的特点，可用于Hps抗体的检测.【相关文献】［1］GLASSER K.Untersuchungen uber die schweineseuchemit besonderer berucksichtigung ihrer aetiologic und pathologie［J］.Deutsche Tierarztliche Wochenschrift，1910，18:729 －733.［2］KIELSTEIN P，RAPP-GABRIELSON V J.Designation of15 srovars of Haemophilu parasuis on the basis of immunodiffusion using heat-stable antigen extracts［J］.Clin Microbiol，1992，30:826 －865.［3］AMANO H，SHIBATA M，KAJIO N，et al.Pathologic observations of pigsintranasally inoculated with serovar 1，4 and 5 of Haemophilus parasuis using immunoperoxidasemethod［J］.JVetMed Sci，1994，56:639 －644.［4］CAIX，CHEN H，BLACKALL P J，et al.Serological characterization of Haemophilus parasuis isolates from China［J］.Vet Microbiol，2005，111（3 －4）:231 －236.［5］DETMERSF JM，LANFERMEIJER F C，POOLMAN B.Peptides and ATP binding cassette peptide transporters［J］.Res Microbiol，2001，152（3）:245 －258.［6］ANGENA O，OLIVEIRA S，AHRENSP.Development of an improved species specific PCR test for detection of Haemophilus parasuis［J］.VetMicrobiol，2007，119（2/4）:266 －276.［7］LANCASHIRE JF，TURNIC，BLACKHALLP J.Rapid and efficient screening ofa representational difference analysis library using reverse southernhybridisation:identification ofgenetic differences between Haemophilus parasuis isolates ［J］.JMicrobiol Methods，2007，68（2）:326 －330.［8］NIELSIN R.Pathogenicity and immunity studies of Haemophilus parasuis serovars ［J］.Acta Vet Scand，1993，34（2）:193 －198.［9］车勇良，陈如敬，王隆柏，等.副猪嗜血杆菌可视化LAMP检测方法的建立与应用［J］.西北农林科技大学学报:自然科学版，2012，41（12）:61 －66.［10］魏子贡，蔡旭旺，金梅林.副猪嗜血杆菌抗体间接血凝检测方法的建立及应用［J］.中国兽医科学，2006，36（9）:713－718.［11］MINIATSO P，SMART N L，EWERT E.Vaccination of gnotobiotie primary specific pathogen free pigs against Haemophilus parasuis［J］.Can JVet Res，1991，55（1）:33 －36.［12］萨姆布鲁克J，弗里奇E F，曼尼阿蒂斯T.分子克隆实验指南［M］.2版.金冬雁，黎孟枫，侯云德，等译.北京:科学出版社，1999:125－126.［13］OLIVEIRA S.Haemophilus parasuis:diagnosis，epidemiology and control［D］.Minnesota:University of Minnesota，2003:129－134.［14］尹秀凤，姜平，邓雨修，等.副猪嗜血杆菌的分离与鉴定［J］.畜牧与兽医，2004，36（7）:6－8.［15］石碧，崔耀文，贾凡，等.副猪嗜血杆菌血清5型间接血凝试验和间接ELISA抗体检测方法的建立［J］.中国兽医科学，2007，37（11）:964 －968.［16］王艳，夏万田，姜平，等.副猪嗜血杆菌间接ELISA抗体检测方法的建立［J］.畜牧与兽医，2006，38（3）:5－6.［17］陈善真，李春玲，贾爱卿，等.副猪嗜血杆菌OMP5基因的克隆、表达及间接ELISA检测方法的建立［J］.中国农业科学，2011，44（14）:3036 －3044.［18］贾爱卿，李春玲，王贵平，等.副猪嗜血杆菌ompP2基因的克隆、表达及间接ELISA抗体检测方法的建立［J］.中国兽医学报，2011，31（9）:1266 －1269.［19］李鹏，姜平，李军星，等.副猪嗜血杆菌重组P2蛋白的高效表达及间接ELISA方法的建立［J］.中国兽医学报，2011，31（4）:480－484.［20］HIGGINSC F.ABC transporters:physiology，structure andmechanism-an overview ［J］.Res Microbiol，2001，152（3 －4）:205－210.［21］GOMINETM，SLAMTIL，GILOISN，etal.Oligopeptide permease is required for expression of the Bacillus thuringiensis plcRregulon and for virulence［J］.Mol Microbiol，2001，40（4）:963 －975.［22］SOLOMON J，SU L，SHYN S，et al.Isolation and characterization ofmutants of the Bacillus subtilis oligopeptide permease with altered specificity of oligopeptide transport ［J］.JBacteriol，2003，185（21）:6425 －6433.。
副猪嗜血杆菌保护性抗原的筛选与鉴定的开题报告
1. 研究背景
副猪嗜血杆菌是一种肠道致病菌，能引起副猪嗜血症，严重影响猪的生长发育和经济效益。
目前，副猪嗜血杆菌的防治主要依靠抗生素治疗，但常常会导致抗生素耐
药性的增加。
因此，研究副猪嗜血杆菌的保护性抗原，开发新型的疫苗，是防治副猪
嗜血症的重要途径。
2. 研究目的
本研究旨在对副猪嗜血杆菌的保护性抗原进行筛选与鉴定，为副猪嗜血症的防治提供科学依据。
3. 研究内容
3.1 副猪嗜血杆菌的培养和提取总蛋白
3.2 建立小鼠保护性免疫模型
选用小鼠作为实验动物，在接种副猪嗜血杆菌后进行体内保护性免疫。
3.3 保护性抗原的筛选
通过Western blotting技术检测小鼠免疫血清的反应，选择出具有保护性抗原特异性的蛋白成分。
3.4 保护性抗原的鉴定
利用质谱分析技术对筛选出的保护性抗原进行鉴定，并进行功能分析和基因克隆。
4. 预期结果
本研究可筛选出具有保护性抗原特异性的蛋白成分，并通过质谱分析技术加以鉴定，为副猪嗜血症的防治提供有力的科学依据。
5. 研究意义
副猪嗜血杆菌的防治是农业生产中的重要问题，随着抗生素耐药性问题的日益严重，研究开发新型疫苗具有极为重要的意义。
本研究筛选出的保护性抗原可为新型疫
苗的研发提供依据，为副猪嗜血症的防治起到重要的推动作用。
副猪嗜血杆菌流行病学研究及疫苗候选株的筛选副猪嗜血杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae）是一种引起副猪嗜血杆菌病的病原菌，广泛分布于全球各地的猪群中。
该疾病具有高度传染性和病原性，严重影响了全球猪肉业的发展。
因此，副猪嗜血杆菌的流行病学研究以及疫苗候选株的筛选非常重要。
流行病学研究是了解副猪嗜血杆菌传播规律和寻找有效防控策略的基础。
研究表明，副猪嗜血杆菌主要通过呼吸道传播，但也可以通过消化道直接传播。
副猪嗜血杆菌可能通过飞沫、直接接触以及器械传播等途径传播，且在饲养密度高的猪群中传播速度更快。
同时，副猪嗜血杆菌对环境条件的适应性较强，可在猪舍、育肥场等环境中长期存活，因此，及时清洗和消毒猪舍以及定期替换饲料容器等措施非常重要。
针对副猪嗜血杆菌的流行病学研究还包括对不同猪种、不同年龄段以及不同地区猪群的感染率和病程的调查。
研究发现，副猪嗜血杆菌的感染率在不同年龄段猪群中呈现明显差异，仔猪和生长肥育猪感染率较高。
此外，副猪嗜血杆菌的不同血清型之间存在差异，不同地区的猪群感染的副猪嗜血杆菌血清型也不尽相同。
这些信息对制定个性化的防控策略具有重要意义。
疫苗是预防副猪嗜血杆菌病的有效手段之一，因此，疫苗候选株的筛选也是副猪嗜血杆菌研究的重要组成部分。
目前，已经开发出多个副猪嗜血杆菌疫苗候选株，包括灭活疫苗、亚单位疫苗和活菌疫苗等。
灭活疫苗和亚单位疫苗主要通过对副猪嗜血杆菌的杀灭或者对其特定抗原的提纯制备而成。
而活菌疫苗则是通过培养和剂量调整副猪嗜血杆菌，使其具有较弱的致病性而不致引起严重的副猪嗜血杆菌病，从而产生免疫效果。
在疫苗候选株的筛选中，应考虑到副猪嗜血杆菌的多样性和抗原的变异性。
选择广谱的疫苗候选株，能够对不同血清型和地区的副猪嗜血杆菌产生免疫作用。
此外，应考虑到疫苗的安全性和有效性。
疫苗应具有较高的安全性，不引起严重的副作用，同时对副猪嗜血杆菌产生持久的免疫保护效果。
副猪嗜血杆菌CDT亚基原核表达及其抗原性鉴定李军星;王一成;袁秀芳;徐丽华;曹会敏;申世川;张鲁滨【摘要】为原核表达副猪嗜血杆菌(H.parasuis) CDT毒素并检测其在体外培养时的分泌表达情况,本实验将切除信号肽的CDT毒素的3个亚基基因分别克隆于pET-28a载体中在大肠杆菌进行表达,并将重组蛋白经亲和层析纯化后,免疫兔制备抗血清,用于鉴定H.parasuis体外培养时CDT分泌表达情况.结果表明CDT毒素3个亚基均在Rosetta菌株中得到表达,其中cdtB约为28.2 ku,符合预期大小,而cdtA和cdtC亚基比预期的23.5 ku和17.4 ku略大.表达的3个重组蛋白可以被自然感染猪血清识别,表明其具有良好的反应原性,同时也表明H.parasuis在猪体内定殖或感染过程中分泌CDT.制备的抗血清可以与体外培养H.parasuis的分泌蛋白中的CDT亚基反应,表明重组蛋白具有良好的免疫原性,同时也表明H.parasuis体外培养时也分泌CDT.%Cytolethal distending toxin (CDT) is a virulence factor of gram negative bacteria. To investigate the antigenicity of recombinant CDT subunits, the encoding sequences of 3 CDT subunits (without signal peptide) were cloned into pET-28a and expressed in E. coli and the antiserum were prepared against the CDT subunits by immunization of rabbits with purified proteins, respectively. SDS-PAGE analysis showed that the cdtA, cdtB and cdtC were about 3.5 ku, 28.22 ku and 17.4 ku which all reacted with serum from naturally infected pigs, indicating that the CDT subunits were secreted in infected pigs. Furthermore, the prepared antisera agaist CDT subunits were able to react positively with H. parasuis culture supernatant, indicationg that the CDT subunits were secretedproteins. These results provided a basis for further study of the biological activity of H. parasuis CDT.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2012(034)009【总页数】3页(P746-748)【关键词】副猪嗜血杆菌;重组CDT亚基;原核表达;抗原性【作者】李军星;王一成;袁秀芳;徐丽华;曹会敏;申世川;张鲁滨【作者单位】浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,浙江杭州310021;浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,浙江杭州310021;浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,浙江杭州310021;浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,浙江杭州310021;浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,浙江杭州310021;浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,浙江杭州310021;浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,浙江杭州310021【正文语种】中文【中图分类】S852.61副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）是猪Glasser's病的病原体，猪上呼吸道的一种共栖菌，它可以在特定条件下侵入机体从而引起以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征的全身性疾病。
副猪嗜血杆菌hhdB基因的鉴定和分析
宋帅;李春玲;杨冬霞;李淼
【期刊名称】《华北农学报》
【年(卷),期】2010(25)B12
【摘要】为了明确副猪嗜血杆菌致病菌株的毒力相关因子,从广东省不同地区发病猪场送检病猪中分离到9株细菌（H1~H9）,并对其hhdB基因进行了鉴定和分析。
结果显示,所分离的9株细菌经形态观察、生化特性鉴定和PCR鉴定为副猪嗜血杆菌阳性,并具有卫星现象和不溶血特征。
用hhdB基因引物从分离菌株中扩增到了
特异性片段,序列分析表明,所获得的hhdB基因序列与GenBank中副猪嗜血杆菌SH0165的hhdB基因同源性为99%,分离菌株hh-dB基因之间序列同源性为
97.5%~99.8%,推导的氨基酸序列与少数放线杆菌、杜克雷嗜血杆菌的溶血素激活蛋白具有一定的相似性。
RT-PCR扩增到了hhdB基因的目的条带,表明该基因在
分离菌株中得到了相应的表达。
这将为副猪嗜血杆菌致病菌株毒力特征基因的鉴定以及副猪嗜血杆菌致病机理的研究奠定基础。
【总页数】5页(P17-21)
【作者】宋帅;李春玲;杨冬霞;李淼
【作者单位】广东省农业科学院兽医研究所,广东省兽医公共卫生实验室,广东广州510640
【正文语种】中文
【中图分类】Q78
【相关文献】
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5.89株副猪嗜血杆菌临床分离株血清型、基因型鉴定与分析
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江西农业大学学报2015，37（3）：512－516http：//xuebao．jxau．edu．cn Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis DOI：10．13836/j．jjau．2015079曾文斌，刘悦欣，谢巧，等．副猪嗜血杆菌hhdA克隆、抗原表位预测和表达［J］．江西农业大学学报，2015，37（3）：512－516．副猪嗜血杆菌hhdA克隆、抗原表位预测和表达曾文斌1，刘悦欣1，谢巧2，聂小伟1，黄冬艳1，王萍1*（1．江西农业大学动物科学技术学院，江西南昌330045；2．江西省家畜血防站，江西南昌330046）摘要：根据GenBank中的副猪嗜血杆菌hhdA的基因序列，设计并合成l对特异性引物，对从江西分离的HPS的hhdA基因进行扩增、克隆、测序、生物信息学分析和原核表达。
测序结果表明，扩增的目的基因大小为1797 bp，共编码氨基酸599个氨基酸。
与GenBank上公布的ZJ0906株（CP005384．1）中对应的核苷酸序列同源性为99．8%，氨基酸同源性99．6%。
生物信息学分析表明，HPS hhdA蛋白是一种混合型结构蛋白，含有α－螺旋、β－折叠、β转角和无规则卷曲；综合柔性区域、亲水性位点、抗原指数和表面可能位点预测了hhdA蛋白可能的B细胞抗原表位的优势表位。
将目的基因转入原核表达载体pET－32a（+）构建重组原核表达质粒pET－32a （+）－hhdA，将重组质粒转化到BL21（DE3）中，进行IPTG诱导表达，经过SDS－PAGE电泳结果显示表达的融合蛋白约80kD。
为进一步研究HPS hhdA生物学功能及抗体制备和开发hhdA基因工程产品奠定了基础。
关键词：副猪嗜血杆菌；hhdA；克隆；抗原表位；原核表达中图分类号：S852．61+2文献标志码：A文章编号：1000－2286（2015）03－0512－05Cloning and Expression of the Gene Fragment Encoding Epitope of Protein hhda from Haemophilus parasuisZENG Wen-bin1，LIU Yue-xin1，XIE Qiao2，NIE Xiao-wei1，HUANG Dong-yan1，WANG Ping1*（1．College of Animal Science and Technology，Jiangxi Agricultural University，Nanchang330045，China；2．Jiangxi Livestock Schistosomiasis Control Station，Nanchang330046，China）Abstract：With the reference of the hhdA gene nucleotide sequence，a software was used to design and synthesize a pair of primers and the PCR technology was used to amplify HPS hhdA gene and build its cloning vector．The results showed that nucleotide of the HPS hhdA gene was1797bp in length，compared with the an-nounced hhdA gene nucleotide sequence CP005384．1，the resemblance was99．8%；the encoded amino acid was599aa in length，compared with the announced hhdA gene encoded acid sequece，the resemblance was 99．6%．The bioinformatics analysis of hhdA gene encoded protein was hybrid structural protein，includingα-helix regions，β-sheet regions，Beta Angle and random coil．Comprehensive flexible Regions，hydrophobicity Plot，antigenic index and surface probability plot predicted the possible advantageous B cell epitope antigen epitope of hhdA protein．The hhdA gene was cloned into pET-32a（+）vector to generate the recombinant expressing收稿日期：2014-05-19修回日期：2015-01-28基金项目：江西省科技厅科技支撑计划（2009BNA0700）和江西省教育厅科学技术研究项目（GJJ12239）作者简介：曾文斌（1989—），男，硕士生，主要从事动物免疫学基础理论与运用研究，E-mail：284777439@qq．com；*通信作者：王萍，教授，博士，E-mail：jxjs6263wplm@163．com。
第3期曾文斌等：副猪嗜血杆菌hhdA 克隆、抗原表位预测和表达plasmid pET-32a （+）-hhdA ，then pET-32a （+）-hhdA was transformed into the host cell BL21with the induc-tion of IPTG ，the result of SDS-PAGE showed that expression of fusion protein was 80kD．All this Lays the foundation for further research of the biological function of HPS hhDA ，antibody preparation and development of genetic engineering products of hhdA gene．Key words ：Haemophilus parasuis ；hhdA ；cloned ；epitope ；prokaryotic expression副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis ，HPS ）可引起猪的格氏病，临床上以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎、肺炎为特征［1］。
该菌已成为国内外引起保育仔猪死亡的一个重要因素，且死亡率呈显著上升趋势。
目前，已有关于副猪嗜血杆菌毒力因子的报道［2-5］，但对编码神经氨酸苷酶基因的了解还很少，对副猪嗜血杆菌外膜蛋白所引起的致病性研究还处于鉴定阶段，利用毒力因子来区分致病菌株和非致病菌株还存在缺陷［6-7］。
毒力因子是构成细菌毒力的物质基础，在其病原菌的致病过程中发挥主要作用，因此对毒力因子生物学特性的研究是探索病原菌致病机理的首要任务［8］。
为了进一步明确致病菌株和非致病性菌株的差异性，Meike 等研究发现在HPS 致病菌株基因组内有hhdA 基因存在于大多数致病菌株中，而非致病菌株中为阴性［9］。
因此，笔者对临床发病猪中所分离的HPS 菌株进行hhdA 基因的克隆，应用生物信息学软件对hhdA 基因及其编码的蛋白质进行结构及功能的分析，构建pET-32a （+）-hhdA 原核表达载体，诱导表达融合蛋白，将为进一步制备hhdA 单克隆抗体提供免疫原并为研究hhdA 分子生物学功能提供重组蛋白奠定基础。
1材料与方法1．1载体和菌株载体pMD18-T 购自大连宝生物公司；感受态细胞Top10、BL21（DE3）菌株均购自天根生化科技（北京）有限公司；pET-32a （+）以及副猪嗜血杆菌均由本实验室保存。
1．2工具酶和主要试剂限制性内切酶Bam H I 与Hind III 、rTaq DNA 聚合酶、dNTPs 、DNA Marker 、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、T4连接酶均为宝生物工程（大连）有限公司的产品；细菌基因组DNA 提取试剂盒、质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯产品。
1．3引物设计与合成根据GenBank 数据库中的hhdA 基因序列，利用Primmer3．0在线软件设计，由生工生物技术有限公司合成1对引物：上游引物：5'-GGATCCATTGGTAGTAAAGTGCAAGCG-3'；下游引物：5'-AAGCTTACTTGCAGAAACGCTCACACT-3'。
上下游引物的5＇端分别引入BamH I 和Hind III 2个酶切位点（下划线处）。
1．4目的基因的PCR 扩增PCR 模板为用细菌基因组DNA 提取试剂盒提取。
PCR 反应体系（25μL ）：10ˑbuffur 2．5μL ，dNTPs （2．5mmol /L ）1μL ，上、下游引物（25μmol /L ）各0．5μL ，模板DNA 2．5μL ，Taq DNA 聚合酶0．25μL ，无菌水17．75μL ；PCR 反应条件：94ħ预变性5min ；94ħ变性45s ，58ħ退火45s ，72ħ延伸1min ，共35个循环；最后72ħ延伸10min 。
扩增后，取5μL PCR 扩增产物于1%琼脂糖凝胶中进行电泳，于凝胶成像系统观察和记录结果。
1．5目的基因的克隆与鉴定采用DNA 回收纯化试剂盒，回收纯化扩增片段，将纯化后的目的基因片段与载体pMD18-T 于4ħ连接过夜，将连接产物转化至感受态细胞TOP10中，涂布于含AMP 的LB 的固体培养基，37ħ培养12 16h 后。
挑取生长良好的单个菌落接种于含AMP 的LB 液体培养基中培养后，进行菌液PCR 及提取质粒酶切鉴定。
将阳性克隆质粒命名为pMD18-T-hhdA ，并送至上海生工生物工程公司进行序列测定。
1．6hhdA 蛋白的二级结构预测预测hhdA 蛋白的二级结构用以下方法：用Garnier-Robson 和Chou-Fasman 方法预测hhdA 蛋白的α-螺旋、β-折叠、β转角和无规则卷曲。
用Karplus-Schulz 法预测其蛋白骨架区的柔韧性。
·315·江西农业大学学报第37卷1．7hhdA 蛋白抗原特异性淋巴细胞抗原表位的预测Kyte-Doolittle 方法预测hhdA 蛋白的亲水区，Jameson-wolf 方法预测hhdA 蛋白的抗原指数，Emini 原则预测hhdA 蛋白可能的抗原表位，然后综合评价hhdA 蛋白抗原特异性B 淋巴细胞的抗原表位。
