实验五 双水相萃取及分配系数的测定

实验一：双水相体系萃取甘草酸盐实验目的：学习双水相体系萃取的原理；掌握双水相体系萃取基本操作技术。

实验原理：双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配。

当萃取体系的性质不同时,物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如疏水键、氢键和离子键等) 的存在和环境因素的影响,使其在上、下相中的浓度不同。

物质在双水相体系中分配系数K可用下式表示：K= C上/ C下其中K为分配系数，C上和C下分别为被分离物质在上、下相的浓度。

分配系数K等于物质在两相的浓度比,由于各种物质的K值不同,可利用双水相萃取体系对物质进行分离。

其分配情况服从分配定律，即，“在一定温度一定压强下，如果一个物质溶解在两个同时存在的互不相溶的液体里，达到平衡后，该物质在两相中浓度比等于常数”，分离效果由分配系数来表征。

实验器材：离心机、粉碎机、烧杯、分液漏斗、天平、烧杯、布氏漏斗、真空泵、吸管、量筒等。

试剂与材料：甘草、氨水、无水乙醇、磷酸氢二钾、浓硫酸等。

操作步骤：取甘草5 0g粉碎至粗粉（40目左右），加400ml2％氨水100℃煎煮30min，滤过，浓缩至1:2（约25ml），称取磷酸氢二钾9g 溶于25ml甘草提取浓缩液中，搅拌使其溶解，并与36ml无水乙醇混合，倒入60ml离心管中，以2000r/min离心3min，形成二相，用分液漏斗将二相分开，分别向二相缓慢逐滴加入浓硫酸至pH＝2，停止加酸，放冰浴冷却10min，使沉淀完全析出，离心（4000r/min，3min），沉淀用无水乙醇洗涤，称重。

结果与讨论：上相结晶主要是甘草单铵盐，重量约在0.25g，下相结晶主要是磷酸盐，重约2.5g。

实验二：心脉康片人参皀苷的提取实验目的：学习吸附色谱法，掌握其原理和操作方法。

实验原理：吸附色谱利用固定相吸附中心对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。

双水相萃取技术及其应用.《生物资源开发与利用专题》双水相萃取技术及其应用152310018杨双水相萃取(ATPE)是一种利用不相容的两个水相之间分配系数的差异来萃取物质的方法。

例如:将葡聚糖和聚乙二醇按一定比例与水混合，溶液呈浑浊状，静置平衡后，溶液分为两相，两相互不混溶，上相富含聚乙二醇，下相富含葡聚糖。

当两种聚合物或一种聚合物和一种盐溶解在同一溶剂中时，由于聚合物之间或聚合物和盐之间的不相容性，当聚合物或无机盐的浓度达到一定值时，它将被分成两个不混溶的相。

因为所用的溶剂是水，所以称为双水相，其中水占很大比例(85%至95%)，活性蛋白质或细胞在这种环境中不会失活，但它可以以不同的比例分布在两相中，克服了有机溶剂萃取中容易失活蛋白质和不溶性强亲水性蛋白质的缺点。

双水相萃取的优点:1.操作条件温和，在常温常压下进行。

它不会导致生物活性物质失活或变性。

2.两相界面张力小，萃取过程中两相高度分散，传质速度快。

3.消除了有毒和易燃有机溶剂的使用，这可以提供温和的水环境，并避免提取组分的脱水和变性。

4.溶质对目标组分具有很强的选择性，大量的杂质可以与所有固体物质一起被除去，从而能够进行分离操作。

5、工艺简化，连续操作容易，处理量大，适合工业化应用。

缺点:该体系易乳化，成相聚合物成本较高，大多数水溶性聚合物粘度较高，不易定量控制，聚合物回收困难。

I:双水相萃取技术的发展趋势目前，用于分离生物物质的双水相体系主要有两种:非离子聚合物/水体系(最常用的是聚乙二醇/葡聚糖)和非离子聚合物/无机盐/水体系(常用的是聚乙二醇/盐体系)是由于在两种类型的双水相体系中使用了无毒聚合物，并且它们的多元醇和多糖结构可以确保生物大分子的稳定性。

然而，在实际应用中，这两种类型的双水相系统有其自身的缺点。

非离子聚合物/水体系能保证生物活性物质的活性，界面吸附少，但所用的高分子材料如葡聚糖价格昂贵，体系粘度大，限制了大规模应用。

与前者相比，非离子聚合物/无机盐/水体系成本低、粘度低，但该体系会导致一些敏感的生物活性物质失活，此外，还会产生大量高浓度含盐废水。

双水相萃取原理
双水相萃取是一种将有机物从水溶液中分离出来的方法。

它基于水和有机溶剂不相溶的性质，通过两相之间的分配系数差异来实现目标物质的选择性提取。

双水相萃取的原理是利用两种互不相溶的溶剂（一般是水和有机溶剂），在某一条件下将目标物质在两相之间分配。

通常情况下，有机物更易溶于有机相，而无机物更易溶于水相。

具体的操作步骤如下：首先将水溶液和有机溶剂混合，形成两相体系。

然后经过搅拌或震荡，让目标物质在两相之间达到平衡分配。

接下来，待两相分离后将有机相和水相分开。

最后，可以通过蒸发或其他方法将目标物质从有机相中提取出来。

双水相萃取的选择性是基于目标物质在两相之间的分配系数差异。

分配系数是指物质在两相之间分配的比例，由物质的溶解度和两相的互溶性决定。

通常情况下，选择合适的有机溶剂和水相条件可以使目标物质在有机相中富集，而其他杂质则大部分留在水相中。

双水相萃取的优点是操作简单、成本低廉，适用于大量样品的初步分离和富集。

但是也存在一些局限性，例如只适用于水溶液中的有机物质，对目标物质的选择性有一定要求。

总之，双水相萃取是一种利用两相体系中的分配差异来实现目标物质提取的方法。

通过选择合适的有机相和水相条件，可以实现对目标物质的选择性富集，从而达到分离和纯化的目的。

双水相萃取一实训目的掌握双水相萃取的原理及方法。

学习双水相萃取相图的制作。

二实训原理双水相萃取法（aqueous two-phase extraction）是利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。

高聚物PEG和盐（硫酸铵）形成的互不相溶的两相，倒入牛奶中，蛋白质富集在一相中。

三实训仪器和药品试管，离心机，天平，离心管，三角瓶，滴定管，聚乙二醇2000（PEG2000），硫酸铵，牛奶。

四实训步骤1 PEG2000-硫酸铵双水相体系相图的测定（1）取10%PEG2000溶液10mL于三角瓶中；（2）用40%硫酸铵溶液装入滴定管中滴定至三角瓶中溶液出现浑浊，记录硫酸铵消耗的体积。

加入1mL水使溶液澄清，继续用硫酸铵滴定至浑浊，重复7~8次，记录每次硫酸铵消耗的体积，计算每次出现浑浊时体（3）以硫酸铵的浓度（W/V）为横坐标，PEG浓度（W/V）为纵坐标，绘制出PEG2000-硫酸铵双水相体系相图。

2PEG2000-硫酸铵双水相体系的配制自行在相图中双水相区选择一个点，根据该点的PEG2000浓度和硫酸铵浓度，分别量取适量的10%PEG2000溶液和硫酸溶液，混合均匀后以2500rpm/min离心5min后分相，得到双水相体系（总量约3mL）。

3利用PEG2000-硫酸铵双水相体系萃取分离牛奶中的蛋白质取1mL 牛奶装入上述双水相体系中，搅拌均匀，于2500rpm/min 离心5min，静置分层，分别量取上下相的体积。

萃取完成后，如果牛奶中的蛋白质不能被萃取到上相，则证明所选的1PEG2000 与硫酸铵浓度不对，应重新选择。

五结果与讨论1如果正确地绘制相图。

2如何根据相图配制双水相体系，并对混合物进行分离。

2。

双水相体系配制与萃取实验报告。

注意事项
平行试验测定值之差不得超过3%。

四、双水相系统在蛋白酶分离中的应用
利用选择的五个成相体系对蛋白酶进行分离纯化，确定一个最佳分离体系。

1·向干燥的离心管中按比例加入一定质量PEG和盐溶液，先用玻璃棒搅匀，再在混合器上混匀，加入2mlL的酶液，在混合器上混合，调pH，静置15分钟，离心10分钟（2000r/min）o
2·读取上下相体积及总体积，用1mL注射器分别取上、下相ImL，分别定容至100mL，测其酶活力。

3.测原酶液酶活力：用移液管吸取ImL发酵液，定容至100mL，测其酶活力为原酶液酶活力。

双水相萃取相图的绘制1．实验目的⑴掌握绘制双水相相图的方法⑵理解双水相形成条件和定量关系2．实验原理双水相是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以一定的浓度混合而形成互不相容的两相，由于溶质在两相间的分配系数的差异而进行萃取的方法即为双水相萃取。

双水相形成条件和定量关系常用相图来表示（见图1）。

成相物质都能与水无限混合，当它们的组成位于曲线的上方时（用M点表示）体系就会分成两相，分别有不同的组成密度，轻相（或称上相）组成用T点表示，重相（或称下相）组成用B点表示，T、B点称为节点。

直线TMB称为系线，是相图的重要特征，关系到相的平衡组成。

所有组成在系线上的点，分成两相后，其上下相组成均分别为T、B，但是其体积比（V T/V B）不同。

相体积比可由相图上线段比（BM/MT）估算，即服从杠杆规则。

本实验绘制PEG/(NH4)2SO4体系双水相相图。

图1 双水相体系相图3．实验材料及仪器PEG1000原液（0.6g/mL，w/w=56.926%，密度1.054）；PEG2000原液（0.4g/mL，密度1.02）；硫酸铵原液（0.43g/mL，密度1.2）。

4．实验方法准确称取2.0mLPEG原液，加入25 mL具塞刻度试管中，然后逐滴加入硫酸铵原液，混合，直至试管中开始出现混浊为止，记录加入硫酸铵量，算出PEG和硫酸铵在系统中的质量百分浓度，再向试管中加入适量水（0.2~0.5~1.0 mL），使体系变澄清，记录加入水的量，并继续加入硫酸铵，使体系再次变混浊，如此反复操作二十几次，计算达到混浊时PEG 和硫酸铵在系统中的质量百分含量，得出不同相对分子量的PEG和硫酸铵的双节线相图节点。

以上述试验所得结点绘制出不同相对分子量的PEG/(NH4)2SO4体系双水相相图。

5．数据处理表1 相图节点数据序号PEG质量（g）体系中盐溶液（mL）盐质量（g）体系加水量（g）体系总质量（g）PEG质量分数（w/w）盐质量分数（w/w）1 02 0.33 0.5……………………n 1.5双水相萃取牛血清白蛋白1．实验目的⑴掌握PEG/无机盐体系双水相萃取蛋白质的方法⑵了解影响蛋白质在双水相体系中分配行为的主要参数2．实验原理双水相是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以一定的浓度混合而形成互不相容的两相，由于溶质在两相间的分配系数的差异而进行萃取的方法即为双水相萃取。

蛋白质在双水相中分配系数的测定实验流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。

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两水相系统中蛋白质分配系数的测定一、实验目的和要求了解蛋白质在两水相系统中分配系数的测定方法二、实验原理1、两水相的形成高聚物与无机盐在水中会形成两个相，如PEG与硫酸盐或碱性磷酸盐，这是由于盐析作用。

两种亲水性高聚物在水中会形成两个相，这是由于聚合物的不相容性。

但是只有达到一定的浓度时，才能形成两相；两水相形成的定量关系可用相图来表示；相图是研究双水相萃取的基础。

2、两水相系统的优点（1）生物大分子活性物质（蛋白）不易受到破坏；（2）两相中水分占很大比例；（3）两水相的相间张力小,相分离过程温和。

（4）两水相之间的传质过程和平衡过程快速，可以实现快速分离；（5）易于放大3、在两水相系统中，生物物质与成相组分之间通过疏水键、氢键和离子键等相互作用而不同程度地分配在两相中。

（1）分配系数：当萃取达到平衡时，蛋白质在上、下两相中的浓度之比称为分配系数，分配系数K = C上/ C下;（2）相比：上下相体积比称为相比R = V上/ V下三、实验器材与试剂1. 器材天平，台式离心机，10 mL刻度离心管，移液管，容量瓶，试管等。

2. 试剂糖化酶，聚乙二醇400，硫酸铵和考马斯亮蓝等。

四、操作方法1、蛋白质在两相中的分配在10 mL刻度离心管中，用电子天平称取硫酸铵固体1.30 g，聚乙二醇400液体2.00 g，用吸管加入已稀释的糖化酶液2.00 mL，然后加水，直到总量为8.00g，用橡皮塞塞紧试管口，用力振摇数分钟，使硫酸铵完全溶解，并使两相充分混合，以便酶在两相中的分配达到平衡，然后，用台式离心机离心3 min，转速调节至3000 r/min，分别读出上、下相的体积，求相比R，并用考马斯亮蓝比色法测定两相中的蛋白质浓度，求出分配系数。

2、考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量制作标准曲线。

样品测定方法如下：上相液：吸取上相液0.5 mL，用水稀释定容到50 mL，取1 mL稀释液于试管中，按标准曲线相同的方法加入考马斯亮蓝溶液并比色测定。

分配系数的测定实验报告
实验名称：分配系数的测定实验
实验目的：
1、了解液体与液体之间的相互作用力。

2、学习利用分配系数来进行有机物的提取和分离。

3、掌握测定物质分配系数（K值）的方法。

实验原理：
分配系数K值（K=浓度在有机相中的浓度/浓度在水相中的浓度）
是描述物质在两种液体中分配均相的程度的指标，该指标可以用来描
述两种液体之间的相互作用力。

在实验时，将待提取的物质溶于水中，然后加入有机相，经反复摇动后，使物质在两相之间分配均相，经离
心分离后，得到两相之间的分配系数K值。

实验器材：
滴定管、计量瓶、量筒、试管、取样瓶、离心机
实验步骤：
1、取一定量的石油醚加入试管中，加入待提取物溶液（如苯环）。

2、摇匀，均相分配后放置一段时间离心分离。

3、取上层有机相并装入烘干皿进行烘干。

4、称量所得有机相质量，计算分配系数K值。

实验结果：
在实验中，成功分离了异丙基苯磺酸盐和苯乙二酮。

测定结果如下：
样品溶剂 K值
苯环石油醚 0.36
苯石油醚 2.38
分析和讨论：
实验结果与文献数据表明，不同物质的分配系数具有很大差异，这主要是由于它们分子之间相互作用力的差异所导致的。

对于大多数铁电物质而言，水相的生物活性更强，而有机相可以更好地溶解不极性物质，因此，利用分配系数提取和分离化合物的方法能够极大地增加实验的效率和准确性。

结论：
通过此次实验，我们学会了利用分配系数来进行有机物的提取和分离，并掌握了测定物质分配系数的方法，积累了实验经验，对学习后续实验和专业的学习有积极的指导意义。

分离技术实验实验⼀: 双⽔相萃取⽜⾎清蛋⽩⼀.实验⽬的1.了解双⽔相系统的成相原理和⽅法；2.了解制作双⽔相系统相图的⽅法，加深对相图的认识；3.掌握双⽔相溶液配制与双⽔相萃取的操作；4.掌握分配系数和萃取收率的计算⽅法。

⼆. 实验原理双⽔相系统是由两种互不相溶的聚合物（如聚⼄⼆醇（PEG）与葡聚糖（DX））或者互不相溶的聚合物溶液和盐溶液（如PEG与（NH4）2SO4）组成。

双⽔相系统的制备⼀般是将两种溶质分别配制成⼀定浓度的⽔溶液，然后将两种溶液按照不同的⽐例混合，静⽌⼀段时间，当两种溶质的浓度超过某⼀浓度范围时，就会产⽣两相。

相图是研究双⽔相萃取的基础，双⽔相形成条件和定量关系常⽤相图来表⽰。

图1是典型的⾼聚物-⾼聚物双⽔相体系的直⾓坐标相图，两种聚合物A、B 以适当⽐例溶于⽔就会分别形成有不同组成的两相，上相组成⽤T点表⽰，下相组成⽤B点表⽰，由图1可知上下相所含⾼聚物有所偏重，上相主要含B，下相主要含A。

曲线TCB称为结线，直线TMB称为系线。

结线上⽅是两相区，下⽅为单相区，若配⽐取在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为混浊。

组成在系线上的点，分为两相后，其上下相组成分别为T和B，T、B量的多少服从相图的杠杆定律。

即T和B相质量之⽐等于系线上MB与MT的线段长度之⽐。

⼜由于两相密度相差很⼩，故上下相体积之⽐也近似等于系线上MB与MT线段长度之⽐。

图1 A-B双⽔相体系相图双⽔相萃取与有机溶剂萃取原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配原则。

当物质进⼊双⽔相体系后，由于表⾯性质、电荷作⽤和各种⼒（如憎⽔性、氢键、离⼦键等）的存在，使得待分离的物质在上、下相中的浓度不同。

对于某⼀物质，只要选择合适的双⽔相体系，控制⼀定的条件就可以得到合适的分配系数，从⽽达到分离纯化的⽬的。

本实验选择PEG-硫酸铵双⽔相系统萃取⽜⾎清蛋⽩。

双缩脲反应是指蛋⽩质在碱性溶液中与⼆价铜离⼦结合⽣成紫⾊络合物的反应。