蜡样芽胞杆菌的检验实验讲义-2011

蜡样芽胞杆菌的检验实验讲义
前言
蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性需氧芽胞杆菌，在自然界分布广泛。

在植物、许多生熟食品上均能分离到，例如乳制品、禽畜类制品、蔬菜、汤汁、淀粉类制品等。

污染食品后，在20℃～45℃，pH4.9～9.3条件下可以迅速繁殖并产生大量肠毒素。

该菌引起的食物中毒的食品感官性状均无明显变化，除食品有发粘、稍有异味无明显腐败变质现象，容易被人忽视。

当一次摄入食品中细菌数量达到100万／g（ml），即可发生食物中毒。

特性：①生物学性状，革兰氏阳性大杆菌，菌体两端较平整，多数呈链状排列。

芽胞呈椭圆形，多位于菌体中央或稍偏于一端，芽胞囊不突出菌体。

引起食物中毒的菌株多为周毛菌，有动力，不形成荚膜；②培养特性，需氧菌，最适生长温度28 ℃～35℃，最适pH7.0～7.4，营养要求不高。

在普通培养基上生长的菌落较大，直径3mm～10mm，灰白色，不透明，表面粗糙成毛玻璃状或融蜡状，边缘不整齐，呈扩散状。

在血平板上形成浅灰色、不透明呈毛玻璃状的菌落，有草绿色溶血环或完全溶血环。

在甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）培养基菌落为粉红色（不发酵甘露醇），周围有粉红色的晕（产生卵磷脂酶）。

在普通肉汤中呈混浊生长，常形成均膜或壁环；③生化性状，卵磷脂酶、酪蛋白酶、过氧化氢酶、青霉素酶、明胶液化、硝酸盐还原试验均阳性。

溶血。

不发酵甘露醇、木糖、阿拉伯糖。

实验安排
一、稀释菌悬液的制备：
二、细菌接种：不发酵甘露醇，且产生卵磷脂酶的细菌。

（在MYP培养基上呈粉红色，周围有粉红色晕的菌落。

三、菌数测定：
四、形态学观察：肉汤培基、营养琼脂培基、革兰氏染色、动力。

五、生化试验：酪蛋白酶、硝酸盐还原酶、明胶酶、过氧化氢酶阳性
第一部分
用灭菌生理盐水将检样作成10-1～10-5的稀释液。

取每个稀释度0.1ml接种在甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂培养基上，用L形棒涂布于整个表面，置于32±1℃温箱培养12～20h。

一、稀释菌悬液的制备：
1. 每组取5支高压灭菌的玻璃试管，用10ml吸管吸取9ml生理盐水分别加入5支试管之中。

2. 用1ml的吸管吸取样品液1ml，加入第一支玻璃试管中，吹打混匀。

3. 再用此吸管吸取该试管中的菌悬液1ml，加入第二支玻璃试管，吹打混匀。

依此类推。

二、细菌接种：
用0.1ml吸管于从最高稀释度管（10-5）开始分别吸取菌悬液0.1ml于甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂培养基上，用L形棒涂布于整个表面，置32±1℃温箱培养20～48h。

第二部分
一、观察MYP培养基上的菌落
在MYP培养基上，呈粉红色（表示不发酵甘露醇），周围有粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶）的菌落可能为蜡样芽胞杆菌。

二、菌数测定
选取适当菌落数的平板进行计数。

计数后，从中挑取5个此种菌落做证实试验。

根据证实为蜡样芽胞杆菌的菌落数计算出该平板上的菌落数，然后乘以其稀释倍数，即得每g（或ml）样品中所含蜡样芽胞杆菌数。

例如MYP平板的可疑菌落为25个，取5个鉴定，证实为4个，乘上稀释倍数（如10-4）的倒数，再乘上1g（或ml）检样数（取的是0.1ml样）则为：25×4/5×1/10-4×10=2×106
三、普通肉汤及血琼脂培养
每组挑取该平板中的5个菌落，将每个菌落分别接种于普通肉汤培养基、普通营养琼脂培养基、血琼脂平板上，35℃培养18～24h。

第三部分
一、观察普通肉汤培养基、普通营养琼脂培养基、血琼脂平板上细菌的生长状况
在普通琼脂培养基上生长的菌落较大，直径3mm～10mm，灰白色，不透明，表面粗糙成毛玻璃状或融蜡状，边缘不整齐，呈扩散状。

在血平板上形成浅灰色、不透明呈毛玻璃状的菌落，有草绿色溶血环或完全溶血环。

在普通肉汤中呈混浊生长，常形成菌膜或壁环。

二、形态学观察（革兰氏染色）
初染液：结晶紫或龙胆紫。

媒染液：卢戈(Lugol)碘液。

脱色液：95%乙醇。

复染液：石炭酸复红稀释液常规制备涂片：涂片干燥固定。

初染：将结晶紫液覆盖菌膜，染l min，水冲洗。

媒染：滴加卢戈氏碘液数滴染l min，水冲洗。

两者生成结晶紫-碘复合物。

脱色：滴加脱色液乙醇后，频频倾动玻片0.5 min ，见无紫色脱下立即用水冲洗。

复染：滴加复染液染l min，水冲洗，待干，镜检。

形态观察：革兰氏阳性大杆菌，菌体两端较平整，多数呈链状排列。

芽胞呈椭圆形，多位于菌体中央或稍偏于一端，芽胞囊不突出菌体。

三、生化试验
1. 点种酪蛋白琼脂平板。

32℃培养48h。

2. 动力和硝酸盐还原试验：取菌落穿刺接种于动力-硝酸盐半固体高层培养基，32℃培养48h。

3. 明胶液化试验：用接种针挑取少许可疑菌落，穿刺接种木糖-明胶培养基，32℃培养18～24h。

第四部分
一、观察生化试验结果
1. 点种酪蛋白琼脂平板（结果）：在菌落周围有透明圈形成（产生酪蛋白酶），为阳性。

2. 动力和硝酸盐还原试验（结果）：如细菌不限于沿穿刺线生长，并伴有混浊，即表示有动力；然后，分别加入对氨基苯磺酸和α-萘胺等量混合液0.1ml，如立即或10min内出现红色，即表示能还原硝酸盐，硝酸盐还原酶阳性。

3. 明胶液化试验（结果）：蜡样芽胞杆菌可液化明胶。

4. 触酶（过氧化氢酶）试验：挑取少许可疑菌落置于一载玻片上，加3%过氧化氢溶液一滴。

如有气泡产生，为触酶阳性。

二、撰写实验报告。