实验9 PCR产物回收

PCR产物回收酶切鉴定pcr产物回收酶切鉴定pcr产物回收.酶切鉴定pcr产物废旧、酶乌鉴别1.1实验目的1.掌控pcr产物废旧和酶乌鉴别的基本原理2.熟悉pcr产物回收和酶切鉴定的具体操作过程3.鉴别β-珠蛋白基因（β-gbobingene）多态性1.2实验原理1.2.1pcr产物废旧实验原理pcr产物一般都含有过量的引物、taqdna酶及dntp，这些成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧pcr测序反应等过程，因此有必要除去。

目前核酸纯化的方法有很多，回收试剂盒的出现使dna的纯化过程变得更加简便、快捷。

试剂盒pcr废旧原理：试剂盒中废旧管内所带的硅基质膜，具备在低盐、高ph值情况下溶解dna，高盐、低ph值情况下释放出来dna的性质。

1.2.2酶切实验原理限制性内乌酶：生物体内能辨识并研磨如上所述的双链dna序列的一种内乌核酸酶。

β-珠蛋白基因pcr产物中所含avaⅱ酶切位点，可以被avaⅱ酶研磨。

1.3方法步骤1.3.1pcr产物提纯操作步驟1.将pcr反应产物移至干净的1.5ml离心管。

2.重新加入3倍体积的bindingsolution至反应产物溶液(50μl的pcr溶液，加入150μl的bindingsolution并振荡混合均匀）3.将spincolumn放进collectiontube中，将反应溶液放进spincolumn中，以12,000×gVergt1分钟，弃置collectiontube中的液体。

4.加入700μl的washsolution，于12,000×g离心1分钟。

丢弃废液,重复此步驟一次。

5.弃置废液，12,000×gVergt除去残存的酒精。

6.将spincolumn转移至新的1.5ml离心管(microcentrifugetube)并加入30μl的elutionsolution或h2o(ph7.0~8.5)至column，静置2分钟。

PCR产物的克隆(DNA的胶回收和连接)技术方案及实验原理【实验原理】1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。

切下带有所需DNA 片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。

2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。

商品化的T载体有很多。

本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。

这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。

由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。

【试剂与器材】（一）试剂1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）。

2.TAE电泳缓冲液3.琼脂糖（Agarose）4.6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于4℃。

2 / 95.溴化乙锭(EB)溶液母液：配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。

6.70%乙醇7.胶回收试剂盒（Omega公司）（二）器材水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 凝胶成像系统或其它照相设备。

【操作方法】（一）胶回收试剂盒回收PCR产物（以Omega公司Gel Extraction Kit为例）1.当目的片段DNA完全分离时，转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。

2.凝胶块转移至1.5ml离心管(离心管已经称重了)中，称重得出凝胶块的重量。

pcr切胶回收的步骤
PCR切胶回收呀，这可是个很有趣的小实验呢。

先说说准备工作吧。

你得有已经跑过PCR并且经过琼脂糖凝胶电泳的胶块哦。

然后呢，把要用的工具都准备好，像干净的刀片啦，还有专门的切胶回收试剂盒。

开始切胶啦。

在紫外灯下看胶块的时候，就像寻宝一样呢。

找到你要的那条DNA 条带，然后用刀片小心翼翼地把它周围的胶切下来。

可别切太大块啦，不然会有好多杂质的。

切的时候就像在给小宝贝做精细的手术一样，要很小心哦。

切好胶之后，就按照试剂盒的说明来操作啦。

一般是把切下来的胶放到一个离心管里，然后加入一些溶液，让胶融化。

这时候你就看着胶慢慢变成液体，感觉就像魔法一样呢。

接着呢，要把融化后的液体加到吸附柱里。

这个吸附柱就像一个小卫士，专门把DNA吸附住，而那些杂质就被留在外面啦。

把液体加进去之后，离心一下，就像坐小过山车一样，让液体在离心力的作用下快速通过吸附柱。

然后呢，要清洗一下吸附柱。

这一步就像是给小卫士洗个澡，把它身上可能残留的杂质都洗干净。

再离心一下，把清洗的液体甩掉。

最后就是把我们想要的DNA从吸附柱上洗脱下来啦。

加入洗脱液，再离心，这个时候我们的DNA就乖乖地跑到洗脱液里啦。

就像把小宝贝从保护它的小房子里接出来一样。

这样，PCR切胶回收就完成啦。

虽然过程有点小复杂，但是只要按照步骤来，就可以得到我们想要的纯净的DNA啦。

每次做这个实验都感觉像是在和小小的DNA分子玩一场有趣的游戏呢。

pcr产物回收方法嘿，咱今儿就来说说这 PCR 产物回收的事儿！你可别小瞧了这一步，就好像是在一堆宝贝里挑出最闪亮的那颗宝石呢！首先呢，咱得准备好工具，就像战士上战场得有趁手的兵器一样。

这其中凝胶回收试剂盒那可是必不可少的呀！然后呢，就是把含有 PCR 产物的凝胶切下来。

这可得小心点儿，别把咱想要的宝贝给弄丢了或者弄破了。

你想想，这就好比是从一个大蛋糕上切下一块你最喜欢的口味，得稳稳当当的呀！切下来后，把它放到离心管里，就像是给宝贝找了个小窝。

接下来加入一些溶液，让它和凝胶好好地融合一下，把产物给释放出来。

这过程就好像是给宝贝洗个舒服的澡，让它干干净净地出来。

之后呢，离心一下，让那些不需要的杂质都沉淀下去，咱要的产物就乖乖地浮在上面啦。

这感觉就像把沙子和金子分开一样，留下的都是精华呀！再然后，把上清液转移到另一个管子里，这里面可都是咱辛辛苦苦要回收的宝贝呀。

这时候，你不觉得特别有成就感吗？就好像经过千辛万苦终于找到了宝藏一样。

接着，又加入一些试剂，让产物更好地结合在一起，变得更纯更干净。

这就像是给宝贝穿上了一件漂亮的衣服，让它更加耀眼。

最后，再离心一次，把产物沉淀下来，洗一洗，晾干。

哇哦，咱的PCR 产物就回收好啦！这感觉，就像是精心培育的花朵终于绽放了一样让人开心。

你说，这 PCR 产物回收是不是很有趣呀？虽然过程有点繁琐，但当你看到那纯净的产物时，一切都值得啦！它可是后续很多实验的重要基础呢，可不能马虎对待呀！所以呀，咱得认真仔细地做好每一步，就像呵护一个小生命一样。

你说是不是这个理儿呢？咱可不能因为一点小疏忽就前功尽弃呀，那多可惜呀！所以，加油吧，让我们在 PCR产物回收的道路上越走越稳，收获满满的成果！。

PCR产物胶回收实验引言：PCR（聚合酶链式反应）是一种用于扩增DNA片段的常用技术。

在PCR实验中，扩增产物通常需要从琼脂糖凝胶上回收和纯化，以便进一步的分析和应用。

本文将介绍一种PCR产物胶回收的实验方法。

实验材料：1. 扩增产物：经过PCR扩增得到的DNA片段。

2. 琼脂糖凝胶：用于扩增产物分离和纯化。

3. 胶回收缓冲液：用于胶回收的缓冲液。

4. 真空浓缩仪：用于回收DNA片段。

5. 无菌纯水：用于制备实验溶液。

6. DNA电泳仪：用于检测和分析PCR产物。

实验步骤：1. 准备琼脂糖凝胶：a. 根据实验需要，制备适合的琼脂糖凝胶。

b. 加入适量的琼脂糖凝胶染料（如安全染料）。

2. 进行PCR扩增：a. 根据所需扩增片段的序列，设计引物，并合成引物。

b. 准备PCR反应体系，包括DNA模板、引物、Taq DNA聚合酶等。

c. 进行PCR扩增反应。

3. 分析PCR产物：a. 用电泳法将PCR产物与DNA标准品一同进行电泳。

b. 根据需要，记录PCR产物的迁移距离和片段大小。

4. 准备胶回收缓冲液：a. 根据实验所需，制备合适的胶回收缓冲液。

5. 胶回收：a. 使用刮胶刀将PCR产物切下，放入离心管中。

b. 添加足够的胶回收缓冲液，使产物完全浸没其中。

c. 低温热激活离心管以使产物与缓冲液充分混合。

d. 放入离心机中离心，以使产物完全沉积到离心管底部。

6. 剔除上清：a. 使用吸走器小心地吸取上清，避免吸取产物。

b. 检查离心管底部是否完全干燥，如有残余液体则继续吸取。

7. 回收DNA片段：a. 加入适量的无菌纯水，以溶解和洗涤DNA片段。

b. 用手轻轻摇晃离心管，使DNA片段溶于水中。

c. 使用真空浓缩仪，将溶解的DNA片段浓缩至所需浓度。

8. 分析纯化后的PCR产物：a. 用电泳法将纯化后的PCR产物与DNA标准品一同进行电泳。

b. 检查PCR产物的迁移距离并与之前的分析结果进行比较。

结论：通过PCR产物胶回收实验，我们成功地从琼脂糖凝胶中回收和纯化了PCR扩增的DNA片段。

pcr产物纯化回收跑胶试验结果分析PCR产物的回收（玻璃奶吸附法）SYBR会使DNA部分显出绿色荧光，在紫外灯下辨认绿色荧光，可将胶切下。

实验结果及分析本次试验中，在最后一步检测中看到了荧光，说明了DNA的存在，证明回收到了PCR的产物PCR产物的直接纯化：一、原理PCR产物一般都含有过量的引物、Taq DNA酶及dNTP，这些成分的存在将直接影响到后续的酶切、双脱氧PCR测序反应等过程，因此有必要除去。

目前核酸纯化的方法有很多，商用化试剂盒的出现使得DNA的纯化过程变得更加简便快捷。

本实验中， Buffer PCR-A促使大于100bp 的DNA片段选择性地吸附到 silica膜上。

经 Buffer W. BufferW2洗涤去除残留在sica膜上的小于50-mer的引物、酶蛋白、单核苷酸、荧光染料或放射性同位素标记的单核苷酸后，吸附到sica膜上的DNA片段经微量水或 Eluent洗脱下来，即可用于各种分子生物学的操作。

二、材料与方法1、材料PCR产物2、仪器、用具恒温孵育器（65C)、离心机、移液器、1.5ml离心管3、试剂Buffer_PCR -A Buffer w1；已加无水乙醇的 Buffer V2 Eluent或去离子水4、方法(1）在PCR反应液中加入3倍体积的Buffer PCR-A若需加入的BufferPCR-A不足100ul，则加入100ul。

(2）将DNA --prep Tube置于2 -ml Microfuge Tube中，将步骤（1）中的混合液移入DNA -prep Tube I中，5500rpm离心1min。

(3）弃滤液，将DNA -prep Tube置回到原2 -ml Microfuge Tube 中，加入500 ul Bufer W1,5500rpm离心1min。

(4）弃滤液，将DNA -prep Tube置回到原2 -ml Microfuge Tube 中，加入700山已加无水乙醇的 Buffer V2,5500rpm离心1min，以同样的方法再用700山己加无水乙醇的 Buffer\2洗涤一次。

pcr产物回收原理PCR产物回收原理。

PCR（聚合酶链式反应）是一种用于扩增DNA片段的技术，它是分子生物学领域中非常重要的工具。

在PCR过程中，产生了大量的PCR产物，而回收这些产物对于后续的实验和分析非常重要。

本文将介绍PCR产物回收的原理及方法。

PCR产物回收的原理主要包括DNA片段的寡聚物纯化和DNA片段的凝胶回收两个方面。

首先，DNA片段的寡聚物纯化是指通过将PCR产物与寡聚物结合，然后利用寡聚物的亲和性将DNA片段纯化出来。

这种方法可以有效地去除PCR反应体系中的盐离子、引物和聚合酶等杂质，从而得到纯净的DNA片段。

其次，DNA片段的凝胶回收是指将PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分离出来，然后通过切割凝胶并使用凝胶回收试剂盒将DNA片段从凝胶中提取出来。

这种方法可以根据DNA片段的大小选择性地回收目标片段，从而得到所需的DNA片段。

在实际操作中，可以根据实验需求选择合适的回收方法。

下面将介绍两种常用的PCR产物回收方法。

首先是寡聚物纯化法。

这种方法通常使用商业化的DNA寡聚物纯化试剂盒，通过将PCR产物与寡聚物结合，然后通过洗涤步骤将DNA片段从其他杂质中分离出来。

这种方法操作简单，纯化效果好，适用于小规模的PCR产物回收。

其次是凝胶回收法。

这种方法通常需要进行琼脂糖凝胶电泳，将PCR产物按照大小分离出来，然后通过切割凝胶并使用凝胶回收试剂盒将DNA片段从凝胶中提取出来。

这种方法适用于需要回收多个目标片段或者需要大量PCR产物的情况。

总的来说，PCR产物回收是PCR技术中非常重要的一步，它直接影响到后续实验的结果和分析。

选择合适的回收方法并严格按照操作步骤进行操作，可以有效地得到纯净的DNA片段，为后续的实验和分析奠定基础。

在实际操作中，需要注意操作规范，避免污染和损失，保证回收的PCR产物质量和数量。

同时，根据实验需求选择合适的回收方法，并结合实际情况进行操作，可以提高PCR产物回收的效率和质量。

PCR产物回收一实验目的要求学生掌握PCR产物回收实验过程。

二实验原理本试剂盒采用新型硅基质膜技术，通过快速，简单的结合-洗涤-洗脱步骤可从大量普通或低熔点琼脂糖凝胶中回收纯化50•bp-50•kb 的DNA 片段，溶胶速度快，每个吸附柱最高可吸附30• μg 的DNA，纯化过程中有效去除引物、核苷酸、酶、矿物油、琼脂糖等杂质，获得高纯度，完整性好的DNA 片段，回收率高达90%。

本试剂盒回收纯化的DNA 可直接用于测序、连接和转化、酶切、标记、体外转录等分子生物学实验。

•三操作步骤•1. 将单一目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分），放入干净的离心管（自备）中，称取重量。

••注意：若胶块的体积过大，可将胶块切成碎块。

•2. 向胶块中加入3倍体积Buffer• PG；当琼脂糖凝胶浓度>2%时，建议使用6倍体积Buffer• PG（如凝胶重为100• mg，其体积可视为100•μl，依此类推）。

•3. 50℃孵育10分钟，其间不断温和地上下颠倒离心管，以确保胶块充分溶解。

如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块完全溶解。

•注意：1）在胶充分溶解后检测pH值，若pH值大于7.5，可向含有DNA的胶溶液中加10-30•μl•的3•M醋酸钠（pH•5.0）将pH值调到5-7。

•••• 2）胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA 的能力较弱。

4. （可选步骤）当回收片段<500• bp或>4• kb时，应加入1倍胶体积的异丙醇，上下颠倒混匀（如凝胶为100• mg，则加入100•μl异丙醇）。

•注意：当回收片段为500•bp-4•kb时，加入异丙醇不会影响回收率。

•5. 柱平衡：向已装入收集管（Collection•Tube）中的吸附柱（Spin•Column•DL）中加入200• μl•Buffer•PS，12,000•rpm（~13,400×g）离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

pcr产物回收原理PCR产物回收原理。

PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，它可以在体外扩增DNA片段，为分子生物学研究和临床诊断提供了重要的工具。

在PCR反应中，产物回收是一个关键步骤，它可以影响到PCR产物的纯度和浓度。

本文将介绍PCR产物回收的原理及相关技术。

一、PCR产物回收原理。

在PCR反应中，经过多轮循环扩增后，会得到目标DNA片段的大量产物。

但是，这些产物通常还伴随着引物、酶、盐类等多种杂质。

为了进一步的应用，需要对PCR产物进行回收和纯化。

PCR产物回收的原理主要包括DNA与固相载体的结合、杂质的去除和洗脱等步骤。

首先，PCR产物与固相载体发生特异性结合。

固相载体通常是硅胶膜、硅胶柱或磁珠等材料，它们能够与DNA发生亲和结合，而杂质则被去除。

其次，通过洗脱步骤，可以将目标DNA从固相载体上解离出来，从而得到纯净的PCR产物。

最后，经过洗脱和浓缩处理，可以得到高浓度、高纯度的PCR产物，为后续实验提供良好的基础。

二、PCR产物回收的常用技术。

1. 硅胶膜法。

硅胶膜法是PCR产物回收的常用技术之一。

在该方法中，PCR产物首先与硅胶膜发生结合，然后通过洗脱步骤将目标DNA洗脱下来。

硅胶膜法具有操作简单、成本低廉的优点，适用于小规模PCR产物的回收。

2. 硅胶柱法。

硅胶柱法是一种高通量PCR产物回收技术，通过硅胶柱的柱塞作用，可以快速、高效地将PCR产物纯化。

硅胶柱法适用于大规模PCR产物的回收，可以同时处理多个样品，提高实验效率。

3. 磁珠法。

磁珠法是一种新兴的PCR产物回收技术，通过在磁场作用下，使带有亲和基团的磁珠与PCR产物结合，然后利用磁力分离的原理实现PCR产物的回收和纯化。

磁珠法具有操作简便、高效快速的特点，适用于高通量PCR产物的回收。

三、PCR产物回收的应用。

PCR产物回收技术在分子生物学研究和临床诊断中有着广泛的应用。

例如，在基因克隆、测序分析、基因表达定量等实验中，都需要对PCR产物进行回收和纯化。

pcr纯化回收原理-回复PCR（聚合酶链反应）纯化回收是一项关键的实验步骤，用于从PCR反应体系中分离和纯化所需的目标DNA片段。

这是由于PCR反应体系中含有许多杂质物质，如剩余的引物、PCR酶、缓冲液等，这些杂质会干扰下游实验的结果。

因此，纯化回收PCR产物不仅能提高下游实验的效果，还能减少后续实验的干扰。

一般而言，PCR产物纯化回收的步骤主要包括抽提、纯化和浓缩三个过程。

下面将详细介绍这些步骤的原理和操作方法。

首先，抽提是将PCR反应液中的DNA目标片段分离出来，而且常用的抽提方法有有机溶剂法、盐析法和固相离心法等。

其中，有机溶剂法是较为常用的抽提方法。

具体而言，该方法通过将PCR反应液与有机溶剂（如丙酮、异丙醇等）进行共沉淀来分离DNA目标片段。

其原理是DNA与有机溶剂存在亲疏水性差异，通过调节反应液的pH值和添加足够的盐可以控制DNA目标片段与有机溶剂之间的分离，从而实现DNA的分离纯化。

其次，纯化是将DNA目标片段从抽提液中进一步纯化，使其获得更高纯度和更好的品质。

纯化方法根据实验需求和条件的不同，可以选择凝胶纯化、固相萃取、凝胶柱纯化等不同方法。

其中凝胶纯化是最常用的纯化方法之一。

其原理是将抽提液进行琼脂糖凝胶电泳，然后通过紫外线照射可见DNA带，最后使用DNA提取缓冲盐溶解目标DNA片段，使其从琼脂糖凝胶中溶解、纯化出来。

最后，浓缩是将纯化后的DNA目标片段从缓冲液中浓缩得到较高浓度的DNA溶液。

浓缩的方法主要有乙醇沉淀法、杂交膜浓缩法和速浓器法等。

其中，乙醇沉淀法是最常用的浓缩方法之一。

其原理是通过加入适量的乙醇使DNA溶解度降低，从而使DNA沉淀出来。

然后通过离心来分离DNA 沉淀，并去除乙醇溶液。

最后，使用适量的缓冲溶液溶解DNA沉淀，以获得目标DNA的高浓度溶液。

综上所述，PCR纯化回收的原理包括抽提、纯化和浓缩三个主要步骤。

其中，抽提通过有机溶剂法将DNA目标片段从PCR反应体系中分离出来；纯化通过凝胶纯化等方法进一步提高DNA纯度和品质；浓缩通过乙醇沉淀法等方法使纯化后的DNA目标片段从缓冲液中得到较高浓度的DNA 溶液。

PCR产物纯化回收PCR产物/凝胶回收试剂盒回收切后目的片段：1. 试剂，耗材及设备：（1）QIAquick PCR Purification Kit 50T (#28104, QIAGEN) # 回收100 bp-10 kb# 使用前向Buffer PE加无水乙醇(96–100%)（按瓶指示）# 向Buffer PB加1:250体积的pH indicator I（加后呈黄色，pH≥7.5）# 所有离心步骤均在室温17,900 x g (13,000 rpm)# 把灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。

Buffer PEBuffer PBpH Indicator IBuffer EBQIAquick spin column2mL收集管（6）ddH2O（7）分光光度计/凝胶成像仪(8) 高速离心机(9) 其它2. 步骤：（1）向酶切反应液中加入5倍体积的Buffer PB，混合均匀。

检查混合液颜色是否为黄色。

如为橙或紫色，加入10 μl 3 M醋酸钠（pH 5.0）混合, 则颜色变黄。

（2）取QIAquick spin column，侧顶标号，放入配套的2mL收集管。

（3）将混合液样加入QIAquick spin column中（如体积大，>800 μl,，可分次上样），离心1 min。

弃掉收集管中液体，将空柱放回对应收集管。

（4）加0.75 ml Buffer PE于空柱（静置2–5 min），离心1 min，弃掉收集管中液体，将空柱放回对应收集管。

（5）空柱离心1 min，弃掉残留的洗脱液体。

（6）将空柱放入一个干净的1.5 mL EP管（与QIAquick spin column同号标记）。

（7）向空柱膜中心（不要碰膜）加入预热的50 μl Buffer EB (10 mMTris•Cl, pH 8.5) 或ddH2O （pH 7.0 -8.5），（剪下1.5 mL EP 管盖盖在柱上）37°C静置5–10 min。

DNA 回收纯化及重组体的构建实验补充材料本实验是将具有HindIII 和BamH I 粘性末端的基因片段以及载体通过DNA 连接酶连接起来。

主要过程包括：直接从PCR 产物回收纯化DNA (Promega 公司试剂盒):1) 直接加90-100μl 纯化缓冲液于1.5ml 离心管，再加入30～300μl PCR 反应物，Vortex 混合；2) 加入1ml 树脂轻轻Vortex 3次，每次间隔1分钟；3) 将取出拉杆的注射器筒（3ml ）装在纯化柱上，加入上述DNA 与树脂混合液，然后装上拉杆，慢慢将混合液推进纯化柱内；4) 卸下注射器筒，拔出拉杆，再将注射器筒装上纯化柱，加2ml 80%的Isopropanol （异丙醇）, 然后装上拉杆，慢慢推出液体以清洗柱子；5) 再次卸下注射器筒，将纯化柱装在1.5ml 离心管上，10000g 离心2 min ，以干燥树脂；6) 再将纯化柱装在一个新的1.5ml 离心管上，加30-50μl 水或TE 缓冲液，1分钟后，10000g 离心20秒，溶出DNA 片段；7) 移去纯化柱，将纯化出的DNA 溶液取出部分用于酶切，其余在-20℃下保存备用。

酶切：1) （每两大组12人）在灭菌的 Eppendorf 管中加入制备的pBluescript KS 空载体0.7µg，2 µl 10×酶切缓冲液，HindIII & BamHI 酶各1µl（各5单位），用无菌双蒸水加至20µl 反应体系，于37℃保温1h ；2) （每小组2人）在另一管中加入待插入的DNA 片段（纯化的PCR 产物）0.3µg（根据实验用量而定），2µl 10×酶切缓冲液，HindIII 和 BamHI 酶各1µl （各5单位），用无菌双蒸水加至20µl 反应体系，于3 7℃保温 1-3 h ；3) 将上述两管酶解液，每管中加入2倍体积（40µl）的无水乙醇以及1/10体积（2µl）的3M NaAC(pH=5.2)，置-20℃冰箱 30 min 。

PＣR产物得胶回收分离纯化一、实验仪器1、琼脂糖凝胶电泳系统２、紫外观察分析仪3、离心机４、单面刀片5、恒温水浴锅二、试剂1、DＮA回收试剂盒２、50×TAE3、dｄH2O三、步骤１在紫外灯下切分含ＤNA得琼脂糖块,尽可能除去多余得琼脂糖。

放入1.5ml离心管中、４。

称量胶块重量,计算胶块体积。

计算胶块体积时,以1ｍg=1 μl 进行计算。

5. 向胶块中加入胶块融化液DR－I Ｂufｆeｒ,DR-ＩBufｆer 得加量如下表:凝胶浓度ＤR－I Bｕffｅｒ使用量１。

0％ 3 个凝胶体积量1.０%～１。

5% ４个凝胶体积量１、5%～2。

0％５个凝胶体积量6。

均匀混合后75℃加热融化胶块(低熔点琼脂糖凝胶只需在４5℃加热)。

此时应间断振荡混合,使胶块充分融化(约6～１0分钟)。

注)胶块一定要充分融化,否则将会严重影响DNA 得回收率。

７、向上述胶块融化液中加入ＤＲ—I Buffer量得1/2体积量得DR-ＩＩBuｆｆer,均匀混合。

当分离小于400bｐ得DＮＡ片段时,应在此溶液中再加入终浓度为20%得异丙醇。

8。

将试剂盒中得SpiｎＣolｕmn安置于Collection Tube 上。

9。

将上述操作7得溶液转移至SpiｎColumn 中,12,000 rｐm 离心 1 分钟,弃滤液、注)如将滤液再加入Sｐｉn Coｌuｍn 中离心一次,可以提高DNA 得回收率。

10.将500 μl得漂洗液Rinse Ａ加入Sｐin Ｃoluｍn中,1２,000 rp ｍ离心３０秒钟,弃滤液。

1１、将70０μｌ得Riｎｓe B加入Spｉn Ｃoluｍn中,12,000 ｒp ｍ离心30 秒钟,弃滤液。

注)请确认RinsｅB中已经加入了指定体积得100%乙醇。

12。

重复操作步骤１1、13。

将SpiｎColｕmn安置于新得1.５ml 得离心管上,在Spin Cｏlumn 膜得中央处加入25μl 得灭菌蒸馏水或Elutｉｏn Buffer,室温静置1 分钟。

pcr产物回收原理PCR产物回收原理。

PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，它可以在体外扩增DNA片段，是分子生物学领域中不可或缺的技术手段之一。

在PCR实验中，产物回收是非常重要的一步，它可以影响到后续实验的成功与否。

本文将介绍PCR产物回收的原理和方法。

首先，我们需要了解PCR反应产物的性质。

在PCR反应中，DNA 聚合酶通过反复的扩增，使得目标DNA片段得到大量复制。

这些产物通常是双链DNA，其中包括了我们需要的目标序列。

但是，PCR反应中还会产生一些非特异性产物，比如引物二聚体和引物延伸产物等。

因此，在进行产物回收时，需要将目标DNA片段从这些非特异性产物中分离出来。

产物回收的原理主要是利用DNA的亲和性分离。

在实验中，我们通常会使用凝胶电泳将PCR反应产物分离开来。

凝胶电泳是一种常用的DNA分离技术，通过电场作用使得DNA片段在凝胶中移动，从而实现分离。

在凝胶电泳后，我们可以通过紫外光照射或染色方法将目标DNA片段可视化，然后将其切割出来。

另外，产物回收的方法还包括了使用商业化的PCR纯化试剂盒。

这些试剂盒通常包括了DNA结合柱和缓冲液等，可以通过离心等步骤将目标DNA片段从反应混合物中纯化出来。

这种方法操作简单，且可以高效地将目标DNA片段回收下来。

除了上述方法，还有一些其他的产物回收方法，比如磁珠分离法、溶液抽提法等。

这些方法都是根据DNA的性质和特点来设计的，可以根据实验需要选择合适的方法进行产物回收。

在进行PCR产物回收时，需要注意一些问题。

首先，要严格控制实验条件，避免外源DNA的污染。

其次，在产物回收过程中要避免DNA的降解，可以使用RNase等酶来去除RNA的污染。

最后，要对回收的DNA片段进行定量和质量检测，确保其适用于后续实验。

总之，PCR产物回收是PCR实验中至关重要的一步，它直接影响到后续实验的成功与否。

通过合理选择回收方法，并严格控制实验条件，可以高效地将目标DNA片段从PCR反应产物中回收出来，为后续实验提供可靠的DNA样品。

真验六 PCR产品胶回支真验之阳早格格创做一、真验脚段1. 掌握胶回支的惯例支配2. 相识胶回支PCR产品的脚段两、真验本理利用胶回支试剂盒杂化PCR产品.本试剂盒提供一个从TBE或者TAE电泳慢冲液配造的琼脂糖凝胶中提与下品量DNA的简朴、赶快、灵验的技能，符合从浓度≤3%，下，矮熔面琼脂糖凝胶中，回支少度为60bp~23Kb的DNA片段，小于100bpDNA片段回支率为10%~55%，0.1~10kbDNA片段回支率最大为99%，大于10kbDNA片段回支率为20~70%.回支的基果组DNA不妨应用到克隆，测序，节造性酶切等百般下游分子死物教真验.三、试剂及配套设备战资料3.1 试剂Extraction buffer Wash buffer Elution buffer3.2 配套设备战资料无菌1.5ml离心管百般规格移液器战无菌移液器吸头无火乙醇同丙醇大概需要3M KAc (pH 5.0) 离心机四、基础技能参数五、支配步调1. 用搞洁、锋利的脚术刀，将含有脚段DNA片段的琼脂糖凝胶切下，并搁进1.5或者2.0 ml离心管中.请尽管切去不包罗DNA片段的凝胶.普遍情况下，电泳的DNA上样量≥50 ul（50ul为最后洗脱体积）.2. 按1：3的比率（凝胶品量毫克数：融胶液体积微降数）加进Extraction buffer.比圆：100mg凝胶应加进300ul Extraction Buffer.对付于每人份试剂用量，凝胶品量不克不迭超出400mg.3. 于恒温火浴或者金属浴中50℃温育，曲到凝胶融化.普遍温育时间为10分钟，温育历程中出隔23分钟混匀一次.如果温育后，混同液体颜色变紫，请加进10 ul 3M KAc （pH 5.0），使混同液颜色变回黄色.4. 可选：按1：1的比率（凝胶品量毫克数：同丙醇体积微降数）加进同丙醇，并混同匀称.如DNA片段大于500bp/小于4kb，不需要加同丙醇.5. 将混同液局部变化到Spin column内，于6,000g离心1分钟，并弃去交液管内液体.如混同液体积大于750ul可先变化750ul，其余的液体待离心弃液后，再变化.6. 背Spin column内加500ul Extraction Buffer，于12，000g 离心30~60秒，并弃去交液管内液体.7. 背Spin column内加750ul Wash Buffer，于12，000g离心30~60秒，并弃去交液管内液体.如果回支的DNA片段将用于盐浓度敏感的真验，请正在加进Wash buffer后静置2~5分钟，再离心.8. 再次于12,000 rpm离心1分钟，而后将spin column变化到无菌的1.5ml离心管中.如不举止该步离心，则无法包管离心柱内残液被真足扫除.9. 背Spin column内加50ul Elution Buffer、火或者TE溶液，并于室温静置1分钟.可根据真验的本量需要决断Elution Buffer用量.但是不要矮于20ul.10. 于12，000g离心1分钟，微量离心管内溶液中含有脚段DNA片段.回支的DNA可曲交用于百般下游分子死物教真验，如果不坐纵然用，请保存于20℃.六、注意事项1. 为了包管不中源DNA的传染，电泳的buffer战gel皆是新造的，切胶的台子浑理搞洁，刀片最佳洗洁灭菌.2. 为了缩小胶的体积，咱们不妨用相对付比较薄的胶去跑电泳，那样不妨缩小回支试剂引起的一些后绝贫苦.2. 正在洗脱前，将洗脱液于30~60℃温浴，可普及提与效用.七、思索题1. 简述效用DNA正在琼脂糖凝胶中迁移速率的果素.2. 简述PCR上样慢冲液（loading buffer）的身分及其效用.。