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荧光显微镜注意事项荧光显微镜是一种利用荧光性物质发出荧光来观察样品的显微镜。
它在生物学、医学、材料科学等领域有着广泛的应用。
在使用荧光显微镜时，我们需要注意以下几点：1. 样品的选择：荧光显微镜通常用于观察荧光探针标记的样品。
因此，在选择样品时，需要确保样品中含有与荧光显微镜兼容的荧光探针。
同时，样品的制备也需要注意，避免对荧光性物质的破坏。
2. 荧光探针的选择：不同的荧光探针对应不同的激发波长和发射波长。
在使用荧光显微镜时，需要根据样品和实验需要选择合适的荧光探针。
此外，还需要注意探针的浓度和标记效率，以保证观察到清晰的荧光信号。
3. 激发光源的选择：荧光显微镜的激发光源通常有汞灯、氙灯、LED等。
不同的激发光源具有不同的特点，如波长范围、亮度、稳定性等。
在选择激发光源时，需要根据样品的特性和实验要求进行合理选择。
4. 荧光滤光片的选择：荧光滤光片能够选择性地透过或阻挡特定波长的光。
在使用荧光显微镜时，需要根据荧光探针的激发波长和发射波长选择合适的荧光滤光片，以提高图像的对比度和清晰度。
5. 曝光时间的控制：荧光显微镜在观察样品时，需要适当控制曝光时间。
曝光时间过长会导致荧光信号饱和，而曝光时间过短则会导致荧光信号过弱。
因此，在观察样品时，需要根据样品的荧光强度和背景信号的情况，调整合适的曝光时间。
6. 环境的控制：在使用荧光显微镜观察样品时，需要注意环境的控制。
荧光显微镜对温度、湿度和振动等因素都比较敏感。
因此，在观察样品前，需要确保实验环境的稳定性，避免外界因素对实验结果的影响。
7. 数据分析与图像处理：观察样品后，我们需要对得到的图像进行分析和处理。
这包括荧光信号的定量分析、图像的增强和合成等。
在进行数据分析和图像处理时，需要使用专业的软件，并遵循科学的方法和流程，以确保结果的准确性和可靠性。
荧光显微镜在生物学和材料科学研究中扮演着重要的角色。
在使用荧光显微镜时，我们需要注意样品的选择、荧光探针的选择、激发光源的选择、荧光滤光片的选择、曝光时间的控制、环境的控制以及数据分析与图像处理等方面。
荧光显微镜名词解释
荧光显微镜是一种利用荧光现象观察样品的显微镜。
它通过激发样品中的荧光标记物，然后观察并记录产生的荧光信号。
荧光显微镜相比普通显微镜具有更高的分辨率和增强对细胞和分子结构的观察能力。
在荧光显微镜中，样品通常被标记上荧光染料或与荧光特性的抗体结合，使得样品在受到特定波长的激发光照射后，能够发出特定波长范围的荧光信号。
这些信号通过荧光滤光片和物镜进入显微镜系统，然后被放大和记录。
荧光显微镜常用于细胞生物学、免疫学、神经科学等领域的研究。
它可以用于观察生物样品中的细胞器、蛋白质、核酸等分子结构的位置、表达水平和相互作用关系。
同时，荧光显微镜还广泛应用于医学诊断和药物研发等实际应用中。
实验三荧光显微镜原理及应用
一、实验原理：1852年 Stokens发现当以短波光照射某些物质时，这些物质就会发出较长的光波，称之为荧光。
当某一物质的外层电子接收到能量相当时的光量子后，这个电子就会从能级较低的电子层跃迁到能级较高的电子层（激发态），但激发态是不稳定的，大约经过10ˉ8秒，电子就会以辐射光量子的形式释放能量而回到原来的稳定状态，辐射的光量子就是光（如图），因为能量还有一部分是以热能的形式散发的，所以荧光光波比激发的光波长。
动物细胞内的大部分成分经激发光波激发后，可以发出淡蓝色的荧光，植物叶绿素等经激发光照射后发出血红色荧光。
这种现象称为自发式荧光，或直接荧光。
有些细胞成分与发荧光的有机物——荧光染料结合后，而具有发荧光发能力，这种荧光成为间接荧光或次生荧光。
除少数物质具有较强的自发荧光外，大多数细胞的自发荧光否很弱，不能满足实际工作的要求，现在比较广泛利用的是间接荧光，获得间接荧光的方法有两种：
[1].荧光染色法：利用荧光染料使细胞或组织着色，它和细胞内不同成分结合后可发出一定波长的荧光。
对于不同的组织或细胞组分，目前已成立了一些有效的荧光染色方法，如显示粘蛋白成分的荧光RAS反应显示类脂质磷化氢3R荧光染色法，显示染色体分带的Q带技术等，可选用不同的方法研究不同的细胞成分。
荧光显微镜是一种使用荧光物质和特定波长的光源来观察样本的显微镜。
荧光显微镜可以分为以下几类：1. 荧光透射显微镜（Fluorescence Transmission Microscope）：这是最常见的荧光显微镜类型，它使用荧光染料标记样本，然后通过照射特定波长的光源来激发荧光染料，并通过透射光来观察样本。
2. 荧光反射显微镜（Fluorescence Reflection Microscope）：在这种类型的显微镜中，光源从上方照射样本，而观察是通过检测反射光中的荧光信号来进行的。
这种方法适用于厚样本或需要从不同角度观察的样本。
3. 荧光共聚焦显微镜（Fluorescence Confocal Microscope）：共聚焦显微镜使用一个或多个pinholes（小孔）来聚焦样品的光线，并只允许来自特定平面的光通过，这样可以获得清晰的、无层叠的图像。
这种显微镜非常适合观察厚样本或想要获取深层结构的样本。
4. 荧光扫描显微镜（Fluorescence Scanning Microscope）：这种显微镜通过扫描光源和探测器在样本上移动，以获取整个样本区域的荧光信息。
这种方法可以用于获取高分辨率的图像，但可能需要较长的成像时间。
5. 荧光点扫描显微镜（Fluorescence Point Scanning Microscope）：这种显微镜通过逐点扫描样本来获取图像，每个点的光源和探测器都非常接近，因此可以获得高分辨率的图像。
这种方法通常用于成像较小的样本或特定区域。
6. 实时荧光显微镜（Real-time Fluorescence Microscope）：这种显微镜可以实时观察样本的荧光变化，非常适合观察动态过程，如细胞呼吸、细胞通信等。
每种类型的荧光显微镜都有其特定的应用和优势，选择合适的荧光显微镜取决于研究的需求和样本的特性。
荧光显微成像系统的原理及构成1.荧光染料：荧光显微成像系统通过荧光染料标记目标物体，使其发出荧光信号。
荧光染料通常是天然或合成的荧光性物质，其分子结构含有色团和荧光基团。
当荧光染料被激发光波长的光线照射后，其激发态电子跃迁至激发态，并在短时间内回到基态，释放出发射光子，形成荧光信号。
2.荧光显微镜：荧光显微成像系统使用荧光显微镜进行成像，荧光显微镜由光源、物镜、筛片轮、探测器等组成。
光源通常是弧光灯或LED，用于产生激发荧光染料所需的光的波长。
物镜具有高放大倍数和数值孔径，用于聚焦和收集荧光信号。
筛片轮可根据荧光染料的激发光波长进行选择，以过滤非目标光。
探测器可以收集和记录荧光信号，并进行图像处理与分析。
3.激发光源：激发光源是荧光显微成像系统的重要组成部分，用于产生适当波长的激发光，激发荧光染料发出荧光信号。
常见的激发光源包括白炽灯、汞灯、激光器和LED等。
不同的激发光源具有不同的波长和强度，可根据需要进行选择。
4.探测器：探测器用于收集和记录荧光信号，常见的荧光显微成像系统探测器包括光电倍增管、CCD相机和CMOS相机等。
其中，光电倍增管用于接收低强度的荧光信号，并通过电子放大将其转换为电信号；CCD相机和CMOS相机具有高灵敏度和分辨率，能够实时采集图像并记录。
1.样品台：样品台是放置生物样品的平台，通常由固定夹持装置和控制台组成。
固定夹持装置用于固定样品的位置，确保样品在成像过程中不移动或晃动。
控制台用于调节样品台的位置和倾角，以便选取最佳的成像角度。
2.激发系统：激发系统包括激发光源和筛片轮等组件，用于产生适当波长的激发光。
激发光源通常位于显微镜的下方或侧面，经由物镜进入样品。
筛片轮可根据需要选择不同的激发光波长，以过滤非目标光。
3.探测系统：探测系统包括物镜、滤光片和探测器等组件，用于收集和记录荧光信号。
物镜通过调节焦距和数值孔径，在样品上聚焦并收集荧光信号。
滤光片用于过滤非目标光，减少背景干扰。
荧光显微镜使用方法说明书一、概述荧光显微镜是一种用于观察和研究荧光材料的显微镜，其原理是通过荧光标记技术使样品发出特定波长的荧光，以增强对样品的观察和分析能力。
本使用说明书将详细介绍荧光显微镜的使用方法，帮助用户正确操作和维护仪器。
二、仪器配置与组装1. 基本配置荧光显微镜主体部分包括显微镜主体、荧光照明系统、像差校正系统等。
除此之外，还需要配备适当的滤光片、显微镜物镜、光源等附件。
2. 组装步骤a) 将荧光显微镜主体放置于平稳的工作台上，确保镜筒与显微镜架正常插入。
b) 连接荧光照明系统，确保光源与显微镜主体之间的连接牢固。
c) 安装所需滤光片和物镜，注意正确对准并轻轻旋固定。
三、荧光显微镜的使用方法1. 准备样品根据实验需求，准备好要观察的荧光标记样品。
样品应进行适当的处理和固定，以确保观察结果的准确性。
2. 调节光源与荧光照明a) 打开荧光照明系统，并调节合适的光源亮度和荧光照射时间。
b) 使用滤光片，选择合适的荧光激发波长，避免背景干扰。
3. 调节对焦与镜头切换a) 通过转动焦距调节手轮，将样品调至清晰可见。
b) 利用显微镜附件，如镜筒切换器、滤光片切换器等，按需切换并调整观察条件。
4. 图像采集与分析a) 连接相应采集设备，如相机、计算机等。
b) 在合适的荧光激发条件下，采集样品图像，并进行相关的分析和处理。
四、维护与保养1. 日常维护a) 避免直接日光照射，保持仪器干燥清洁。
b) 注意使用时避免碰撞以及接触腐蚀性物质。
c) 定期清理镜头、滤光片等附件，并保持其表面光洁度。
2. 镜头保养a) 使用专用镜头纸轻轻擦拭，避免使用过于湿润或有腐蚀性的物质。
b) 镜头不使用时，应盖上防尘罩，并存放在干燥通风的地方。
3. 故障排除在使用过程中，如发现显微镜工作异常或出现故障，请参照用户手册进行故障排除或联系售后服务人员。
充分了解荧光显微镜的使用方法，能够帮助您更好地进行荧光标记实验，提高实验效果和研究成果的可靠性。
荧光显微镜讲授流程：1、构造2、原理3、发展史荧光显微镜是荧光显微检测的专用工具,它是光学显微镜的一种。
它除了具有光学显微镜的基本结构和光学放大作用外,基于荧光的特性,还具备以下独特的功能要求:(1)提供足够能量的能激发出荧光的光源。
(2)有着适应不同物质所需的激发光谱一组滤色片,从光源中选择合适的激发光谱,使析出的光谱与该物质的吸收光谱重合,以期望获得最大的荧光。
(3)为获得较弱的荧光图像,还要建立一套截止滤色片,它使所需观察的荧光进入系统成像,而将其余的光波,包括发射光阻挡在外,用来提高图像的衬度。
(4)放大的光学系统应适应荧光的特性,最终获得既能观察又能摄影的高亮度、高分辨力的良好衬度的荧光图像。
(5)仪器的安全性。
应用汞灯要防止紫外线的泄漏和汞灯的爆炸,保证电器安全。
滤色片初期用贮放玻璃盒中的有色液体,后改用带色胶质片,由于易变色和使用不方便已被淘汰。
现在经常使用的为色玻璃和干涉滤色片,色玻璃大都属宽波带滤色片,透过波段宽,透过率随厚度而降低,价格相对低廉。
由于色玻璃与空气的界面上,约有4%光线被反射掉,玻片愈多,光能损失愈大,限制了它的使用性能。
干涉滤色片的出现,可按需要制成能透过或截止一定波段的滤色片,从而促使荧光显微术的进展,现代技术上已能对某波段的透射率或反射率进行控制。
荧光显微镜的应用1.在环境中检测已知微生物，制作相应的带有荧光素的抗体，进行标记、定位（免疫荧光技术）对病原微生物的检测有意义--- 梅毒密螺旋体2.荧光显微镜下的细胞增殖（超链接--视频）3.选用不适合同的荧光染色剂，对同一视野下的样品进行染色（复杂环境下）4. 荧光显微镜在各领域中的应用都非常广泛,在植物细胞的观察研究中,通过染色可以更清晰地观测到细胞的形态及结构。
在实验中发现,荧光显微镜还可以直接(不做任何处理)观察植物叶的气孔器,而且能观察到气孔的变化情况,为荧光显微镜找到了一种新用途。
5. 20世纪30年代荧光染色即已用于细菌、霉菌等微生物及细胞、纤维等的形态观察和研究。
如用抗酸菌荧光染色法可帮助人们在痰中找到结核杆菌。
40年代创造了荧光染料标记蛋白质的技术,这种技术现已广泛应用于免疫荧光抗体染色的常规技术中,可检查和定位病毒、细菌、霉菌、原虫、寄生虫及动物和人的组织抗原与抗体,可用以探讨病因及发病机理,如肾小球疾病的分类及诊断,乳头瘤病毒与子宫颈癌的关系等6.在植物细胞凋亡机理的研究中对线粒体进行染色后,用荧光显微镜能够很清晰地观察到活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光;凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
利用荧光标记技术显示微管,可以在多种植物生殖细胞内清楚地看到微管骨架的存在7.在紫外光激发下,叶绿体发出火红色荧光,气孔发绿色荧光,保卫细胞呈黄色或黄绿色,且形状大小非常清晰,两保卫细胞内的火红色叶绿体则环绕气孔排列成一圈。
表皮细胞内的叶绿体数量要比叶肉细胞少,所以在荧光显微镜下看不到表皮细胞。
通过大量试验证明,单子叶,双子叶,裸子植物大都适用于这种方法而且效果较好。
荧光显微镜基本形式有两种:透射式和落射式。
透射式如图8所示,它由光源(HL)、激发滤色片(EF)和照明系统供给激发光。
图中用暗场聚光镜(DC)将光束会聚在切片(P)上,由物镜(OB)将荧光物成像于像面上,截止滤色片(SF)吸收被切片衍射的杂散激发光,仅透过荧光到目镜(OC)。
DC—暗场聚光镜; OB—物镜; SF—截止滤色片; OC—目镜。
图8透射荧光显微镜透射式备有明场聚光镜和暗场聚光镜。
明场聚光镜很少直接用于荧光检测中,常用来搜索目标,寻找或挑选切片需要的区域,这是费时的工作,不宜用强度极高的光去完成,否则会出现衰减甚至猝灭,当仪器配备高质量短波通干涉滤色片激发时,用明场聚光镜,在调节可变光适当时,也可获得满意的荧光图像。
暗场聚光镜在透射荧光中是必备的,由于使用暗场聚光镜激发光不会进入物镜,背景呈“暗”色,使荧光衬度大大提高。
荧光中应用的暗场聚光镜材料应选用自发荧光少的硝酸盐,并且能透过紫外线的材料。
图9所示是一种心形暗场聚光镜,它的心脏形反射面将光线高度会聚成一“点”,聚光镜的性能可用下式表征。
E=KõP(NA2max-NA2min)K为透过率。
可见其性能取决于聚光束最大数值孔径与最小数值孔径的平方差,差值愈大,性能愈优越。
暗场是用中空的光锥激发切片的荧光物,为得到稳定的荧光图像,聚光镜的调节机构(对中和调焦)应稳定可靠,可多次重复照明条件。
另外在使用时应注意切片的厚度,一般在0.8mm～1mm之间才获得暗场效应,这是因为受到暗场光锥顶点深度的限制。
好的暗场聚光镜,1.2mm的厚切片也能使用。
图9心形暗场聚光镜落射式如图10所示。
它将激发光由二向色分光镜(DM)反射通过物镜射至切片上激发荧光物。
二向色分光镜能通过物镜收集荧光。
截止滤色片吸收激发光谱的反射光让荧光色透过从目镜中观察。
DM—二向色分光镜图10落射荧光显微镜二向色分光镜是落射式关键部件,它是多层膜干涉滤色片,与主光路呈45°安置,它的光谱特性如图11所示。
该曲线竖轴为透过率,横轴为波长,其反射率可用100%与透过率差值求得,从380nm～400nm的波长(青色)约90%反射,520nm以上的光波从(黄至红色)透过。
以50%的反射率时的波长作为表征,如该曲线为500nm,记为DM-500。
图11二向色镜透射曲线图12落射照明光路各个分色镜还应建立相应的激发和截止滤色片,以满足不同的需要。
滤色片(包括二向色分镜)的设置与组合是荧光显微镜设计中一个重要的课题,它与荧光术的应用密切相关。
落射式激发光通过物镜垂直自上而下照明切片上表面,故又称为垂直照明器,它采用柯勒照明系统。
光源经集光镜大致成平行光束,为利用光能,增大包容角,用隔热玻璃吸收热线,聚光镜使光源成像于孔径光阑上,并使它与物镜后焦面重合,所以经物镜出射激发光束为平行光均匀投射到切片上。
要注意的是仪器配备的所有物镜均应达到此要求。
这两种基本形式,各有特点和使用价值。
对于落射式:(1)物镜兼作聚光镜,就没有聚光镜的定中与调焦问题,而且物镜的数值孔径随倍率而增大,荧光图像亮度也随之提高;(2)激发光不必透过载玻片,因而减少损失,而且激发光与荧光对物镜而言方向相反,分得很开不可能产生互相干扰,就是有部分反射激发光进入物镜后也被二向色分光镜反射至光源,仅有极小部分透过,使截止滤色片负担小,可制成较薄的片;(3)用透射式激发时,大部分荧光产生于切片底部,必须透过切片射出,而且还会产生散射。
而落射照明和观察面在同一表面,荧光图象亮度毫无损耗,而且对象质也无影响,特别对厚的切片,如菌落和组织培养等更具有独特的功能;(4)落射荧光的物镜因要通过紫外区光谱,因此必须要考虑紫外段的透过率,为此专门研制UV-F透紫外区荧光物镜系列,而透射式则不必。
对于透射式,在UV,U激发时一般用优良的消色差物镜即可,在可见光B与G激发时,用半复消色差或复消色物镜最为合适,用齐明物镜也可以,虽然齐明物镜象场不平,然而高倍物镜用于对边缘分辨力要求不高的试样。
一般中等以下倍率,干物镜适用于暗场照明。
高倍率的浸液物镜不适合暗场照明,因为暗场聚光镜照明锥光束会进入物镜。
浸液式物镜比干镜头更适宜作落射照明,因为空气—玻璃界面反射光远比玻璃—浸液界面反射光多。
对于目镜没有特殊要求。
由两种基本形式组合,具有更大机动性,适应各种研究需要。
图13(a)(b)中透射(明场或暗场)用来搜索定位,也可以用来比较荧光部位和不发荧光部位的细微结构;(d)和(e)也有相同的功能。
(d)中使用相衬时,要用相衬物镜,交替进行荧光观察和相衬观察,进行比较;(e)中偏光观察适用于双折射物质,(c)中落射荧光和透射荧光的组合适用于双重染色,如同时进行FITC和TRITC双重染色,则可用落射观察TRITC,用透射观察FITC标识过的部位。
·28·光学仪器第23卷另外在使用时应注意切片的厚度,一般在0.8mm～1mm之间才获得暗场效应,这是因为受到暗场光锥顶点深度的限制。
好的暗场聚光镜,1.2mm的厚切片也能使用。
图9心形暗场聚光镜落射式如图10所示。
它将激发光由二向色分光镜(DM)反射通过物镜射至切片上激发荧光物。
二向色分光镜能通过物镜收集荧光。
截止滤色片吸收激发光谱的反射光让荧光色透过从目镜中观察。
DM—二向色分光镜图10落射荧光显微镜二向色分光镜是落射式关键部件,它是多层膜干涉滤色片,与主光路呈45°安置,它的光谱特性如图11所示。
该曲线竖轴为透过率,横轴为波长,其反射率可用100%与透过率差值求得,从380nm～400nm的波长(青色)约90%反射,520nm以上的光波从(黄至红色)透过。
以50%的反射率时的波长作为表征,如该曲线为500nm,记为DM-500。
图11二向色镜透射曲线图12中激发滤色片从高亮度的汞灯(或氙灯)中主要透过绿光,经双色分光镜反射至物镜,落射照明切片,其中一些激发光在盖玻片和物镜表面反射回去,被截止滤色片吸收,只有切片发出的橙色荧光,才能透过进入目镜。
二向色分光镜将光源发出的光谱分为两段(故称二向色),一段反射作为激发光,一段透过荧光。
显然二向色分光光谱段太宽,还必须配备激发滤色片和附加的截止滤色片适应荧光观察。
为了覆盖光谱区应设置多少二向色分光镜?一般分4个波段,如用DM-400、DM-445、DM-505和DM-575为一组。
近年来,有的厂家又细化些,配置6个分色镜,它们是DM-400、DM-430、DM-455、DM-505、DM-575和DM-595。
·27·第2期杨广烈:荧光与荧光显微镜荧光显微镜基本形式有两种:透射式和落射式。
透射式如图8所示,它由光源(HL)、激发滤色片(EF)和照明系统供给激发光。
图中用暗场聚光镜(DC)将光束会聚在切片(P)上,由物镜(OB)将荧光物成像于像面上,截止滤色片(SF)吸收被切片衍射的杂散激发光,仅透过荧光到目镜(OC)。
DC—暗场聚光镜; OB—物镜; SF—截止滤色片; OC—目镜。
图8透射荧光显微镜透射式备有明场聚光镜和暗场聚光镜。
明场聚光镜很少直接用于荧光检测中,常用来搜索目标,寻找或挑选切片需要的区域,这是费时的工作,不宜用强度极高的光去完成,否则会出现衰减甚至猝灭,当仪器配备高质量短波通干涉滤色片激发时,用明场聚光镜,在调节可变光适当时,也可获得满意的荧光图像。
暗场聚光镜在透射荧光中是必备的,由于使用暗场聚光镜激发光不会进入物镜,背景呈“暗”色,使荧光衬度大大提高。
荧光中应用的暗场聚光镜材料应选用自发荧光少的硝酸盐,并且能透过紫外线的材料。
图9所示是一种心形暗场聚光镜,它的心脏形反射面将光线高度会聚成一“点”,聚光镜的性能可用下式表征。
