光学衍射极限的突破

突破衍射极限——探索纳米世界的超分辨显微技术作者：李德增陈波来源：《化学教学》2015年第01期摘要：介绍了2014年诺贝尔化学奖，并以此为背景围绕着如何突破衍射极限提高分辨率这一核心问题，通过衍射极限产生的原因、突破的途径及新型显微技术发展的历程及特点等几个方面展开阐述，以期更好地认识新型光学显微技术在探索纳米世界时的作用和意义。

关键词：诺贝尔化学奖；衍射极限；瑞利判据；超分辨率；荧光显微技术文章编号：1005–6629（2015）1–0012–05 中图分类号：G633.8 文献标识码：B1 引言2014年10月8日，2014年度诺贝尔化学奖揭晓，美国科学家埃里克·白兹格（Eric Betzig）、威廉姆·艾斯科·莫尔纳尔（William E. Moerner）和德国科学家斯特凡·W·赫尔（Stefan W. Hell）三人获奖，以表彰他们在超分辨率荧光显微技术领域取得的成就。

长期以来，光学显微镜的分辨率被认为是有极限的，它不可能超过二分之一个光波长度，对于可见光波长而言，约200纳米。

1873年德国物理学家阿贝（E. Abbe）指出衍射极限是传统光学显微镜存在最大分辨率的物理限制。

然而，在荧光分子的帮助下，今年诺贝尔奖化学奖的几位获得者巧妙地绕开了这种限制，并突破了这一极限。

他们划时代的贡献将传统光学显微镜技术带进了纳米领域，使光学显微镜步入了纳米时代。

根据纳米荧光显微技术，科学家实现了活体细胞中单个分子通路的可视化。

他们能够观察到分子是如何在大脑神经细胞之间生成神经突触；还可以追踪帕金森病、阿尔兹海默症和亨廷顿症患者体内相关蛋白的累积情况等等。

然而科学家在最小分子水平上对活体细胞细节进行研究时，却受到了限制。

由于今年三位诺奖得主的贡献，我们可以利用突破衍射极限的光学显微镜对纳米世界一探究竟。

这次获奖的是两项独立的技术。

第一项是Stefan Hell于2000年研制的受激发射损耗（STED）显微技术。

第３５卷第９期２００８年９月中国激光Ｖ０１．３５，Ｎｏ．９Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２００８ＣＨＩＮＥＳＥＪＯＵＲＮＡＬ０ＦＬＡＳＥＲＳ文章编号：０２５８—７０２５（２００８）０９—１２８３—２５超分辨远场生物荧光成像突破光学衍射极限毛峥乐王琛程亚（中国科学院卜海光学精密机械研究所强场激光物理国家重点实验室，上海２０１８００）摘要长期以来。

远场光学荧光显微镜凭借其非接触、无损伤，可探测样品内部等优点，一直是生命科学中最常用的观测ｊ＝具。

但由于衍射极限的存在，使传统的宽场光学显微镜横向和纵向的分辨率分别仅约为２３０ａｍ和ｉ０００ｎｍ。

为了揭示细胞内分子尺度的动态和结构特征，提高光学显微镜分辨率成为生命科学发展的迫切要求，在远场荧光显微镜的基础上，科学家们已经发展出许多实用的提高分辨率甚至超越分辨牢极限的成像技术。

例如，采用横向结构光照明提高横向分辨率到约１００ｎｍ．利用纵向驻波干涉效应将纵向分辨率提高５～１０倍。

然而，直到在光学荧光显微镜中引入非线性效应后。

衍射极限才被真正突破。

如受激荧光损耗显微镜利用非线性效应实现了３０～５０ｎｍ的三维分辨率。

另外应用荧光分子之间能量转移共振原理以及单荧光分子定位技术也可以突破衍射极限，甚至可以将分子定位精度提高到几个纳米的量级。

关键词光学；超分辨；远场光学荧光显微镜；生命科学；非线性效应；单分子中图分类号ＴＨ７４２．６５文献标识码Ａｄｏｉ：１０．３７８８／ＣＪＬ２００８３５０９．１２８３ＳｕｐｅｒｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎＦａｒ－ＦｉｅｌｄＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＢｉｏ－ｌｍａｇｉｎｇ：ＢｒｅａｋｉｎｇｔｈｅＤｉｆｆｒａｃｔｉｏｎＢａｒｒｉｅｒＭａｏＦｉｎｅＺｈｅｎｇｌｅＷａｎｇＣｈｅｎＣｈｅｎｇＹａ（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＨｉｇｈＦｉｅｌｄＬａｓｅｒＰｈｙｓｉｃｓ，ＳｈａｎｇｈａｉＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＯｐｔｉｃｓａｎｄＭｅｃｈａｎｉｃｓ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０１８００，Ｃｈｉｎａ）ＡｂｓｔｒａｃｔｏｗｉｎｇｔＯＦａｒ－ｆｉｅｌｄｏｐｔｉｃａｌｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｉｃｒｏｃｏｐｙｈａｓｂｅｃｏｍｅｉｔｓｕｎｉｑｕｅｃａｐａｂｉｌｉｔｙｔＯａｎｅｓｓｅｎｔｉａｌｔｏｏｌｉｎｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｆｏｒａｌｏｎｇｔｉｍｅｌａｒｇｅｌｙｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ，ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ（３Ｄ）ｉｍａｇｉｎｇｉｎｓｉｄｅｃｅｌｌｓ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆａｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌｗｉｄｅ－ｆｉｅｌｄｏｐｔｉｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｉＳｌｉｍｉｔｅｄｔＯａｂｏｕｔ２３０ｎｍｌａｔｅｒａｌｌｙａｎｄ１０００ａｍａｘｉａｌｌｙ。

结课论文题目突破衍射极限的超高分辨率成像的技术进展学生学号学院专业班级二〇一五年十二月一引言1.1选题意义光学显微成像具有极为悠久的历史，但一直以来，光学成像一直受到衍射极限的限制而分辨率无法突破200 nm。

后来虽然有了电子显微镜、核磁共振显像、x光衍射仪等微观观测或者显像设备，但是使用光学显微镜可以在活体状态下观察生命体使得其在生物、医学观察方面仍有巨大优势。

值得庆贺的是近年来，超高分辨率显微技术的发展使得光学显微成像分辨率达到了20 nm以下。

其中德国科学家Stefan Hell、美国科学家Eric Betzig和William Moerner因其在超高分辨率显微技术方面的突出贡献获得了2014年的诺贝尔化学奖。

在这篇文章中，我们就简要介绍一下超高分辨率显微技术的发展和应用，并对诸位大师致以敬意。

1.2技术指标显微技术成像优劣一般通过X-Y平面分辨率与Z轴分辨率大小来判定，分辨率越高数值越小。

下表是各种显微成像技术的分辨率指标。

普通光学显微镜200-300 500-700 4Pi显微镜100-150 STED显微技术50-70STED+4技术50 50 PALM技术20 303D STORM技术20-30 50-60 dSTORM技术30 502D SSIM技术503D SSIM技术100 200 电子显微镜0.05X光衍射仪0.03-10二衍射极限2.1 衍射极限我们能看到什么？看到多小的围？看得有多清楚？几百年来，依靠不断进步的科学手段，微观世界正一层层揭开面纱，让人们可以看得越来越“小”，进而可以进行研究。

人的肉眼能分辨0.1毫米尺度的物体，再小，就要借助工具。

1665年，英国科学家罗伯特·虎克制造了第一台用于科学研究的光学显微镜，用它观察薄薄的软木塞切片。

虎克看到了残存的植物细胞壁，它们一个个像小房间一样紧挨在一起，这就是“细胞”一词的由来。

此后，显微镜制造和显微观察技术的迅速发展，帮助科学家第一次发现了细菌和微生物。

光学衍射极限的突破纪岚森，仵云龙，李岷池，贺杰（青岛大学物理科学学院2011级材料物理1班）摘要：由于光学衍射极限的存在，使得在电子科技上边很难达到人们期望的高分辨率，然而光学衍射极限并不是不能克服的。

除了减小光波长与增加孔径外，我们还可以通过改变光路来突破艾里斑衍射极限。

减小艾里斑在很多的方面都有极其重要的意义，这里讲述的是艾里斑对显微镜技术突破的一些介绍。

关键词：艾里斑，显微镜，光学衍射极限1引言：在大量的电子图像应用领域，人们经常期望得到高分辨率（简称HR）图像。

高分辨率意味着图像中的像素密度高，能够提供更多的细节，而这些细节在许多实际应用中不可或缺。

例如，高分辨率医疗图像对于医生做出正确的诊断是非常有帮助的；使用高分辨率卫星图像就很容易从相似物中区别相似的对象；如果能够提供高分辨的图像，计算机视觉中的模式识别的性能就会大大提高。

同时随着生命科学的迅猛发展三维光学显微技术也已经成为研究生命过程的一种极为有效的工具，但是传统的基于荧光共焦技术的成像方案受到光学衍射极限的限制，其横向和纵向的数量级均在百纳米，因而无法满足科学技术发展的需要，利用各种非线性光学荧光激发方案已经打破光学极限的方案已经实现，然而这种光路较为复杂，通过其他的方法构造出来的奇异光线也是能够实现科学家长期最求的三维远场光学的超分辨成像。

根据瑞利衍射极限任意的光学系统成像就会在像方产生一个光斑，而这个光斑是无法通过改变显微镜的结构来实现的，也就是说，无论是共焦显微镜或是宽场显微镜这个光斑都是存在的，而这个光斑就是我们所说的爱里斑(Airy disc) 由于光的波动性，光通过小孔会发生衍射，明暗相间的条纹衍射图样，条纹间距随小孔尺寸的减少而变大。

大约有84%的光能量集中在中央亮斑，其余16%的光能量分布在各级明环上。

衍射图样的中心区域有最大的亮斑，称为爱里斑。

爱里斑的角度与波长(λ)及小孔的直径(d)满足关系：sinθ=1.22λ/d，θ即第一暗环的衍射方向角（即从中央亮斑的中心到第一暗环对透镜光心的张角），因为θ角一般都很小，有sinθ≈θ，故θ≈1.22λ/d。

衍射极限是指一个理想点物经光学系统成像，由于衍射的限制，不可能得到理想像点，而是得到一个夫朗和费衍射像。

因为一般光学系统的口径都是圆形，夫朗和费衍射像就是所谓的艾里斑。

这样每个物点的像就是一个弥散斑，两个弥散斑靠近后就不好区分，这样就限制了系统的分辨率，这个斑越大，分辨率越低。

这个限制是物理光学的限制，是光的衍射造成的。

这种衍射限制本质上来源于量子力学中的测不准关系限制。

对于给定频率的光子，当它在某个方向上的动量范围给定时，它的分辨率也就定了。

一般当一个艾里斑的中心和另一个艾里斑的边缘暗环刚好重合时，认为两个像斑刚好能够分辨（瑞利判据）。

这一现象用傅立叶分析理论可解释为：携带物体信息的入射光波的傅立叶分量中，较大的横向分量对应着高频成分，代表着物体的细节部分；但含高频横向分量的光波因满足2222x y k k w c +〉 (k x 、k y 为波矢量K 在x和y 方向分量，ω为光波角频率、c 为光速，传播方向为z 轴)而成为倏逝波，倏逝波在传播过程中因振幅呈指数衰减而无法到达像面，不能参与成像，造成物体细节部分的丢失，因而普通透镜的成像总是有缺陷的。

图1. 艾里斑图形（三维强度值和和平面图像）衍射极限公式是sinθ=1.22λ/D 。

其中θ是角分辨率，λ是波长，D 是光圈直径。

当θ很小时，sinθ约等于tanθ，约等于d/f ，其中d 是最小分辨尺寸，f 是焦距。

推导出d/f=1.22λ/D 。

显微镜的可分辨的最小线度为：δy=0.61λ/N.A.，其中N.A.为镜头的数值孔径。

目前，普通显微镜的分辨率一般为200nm 以上。

突破衍射极限：在物理概念上从只使用实数推广到使用虚数；从物理上讲，属于从传统中那样使用实光子辐射场推广到使用非辐射的虚光子场（不在光子质壳上的光子都是虚光子），前者就是传统中的光学成像，后者则属于近场成像。

产生电磁波的源都可以称为天线。

天线产生辐射远场和非辐射近场，前者包括我们通常看到的一束光，它在真空中传播，幅度不会衰减；后者则随空间距离迅速衰减，主要局域于天线附近，属于局域性的电磁波，或者附在材料表面附近的“表面波”。

光学超分辨突破光学衍射极限的挑战光学超分辨技术一直以来都面临着一个重大挑战，即光学衍射极限的限制。

根据光学原理，当物体的尺寸小于光波的波长时，光学显微镜无法观察到其细节。

然而，随着科技的不断发展，人们对于超越光学衍射极限的需求也越来越迫切。

在近年来，随着光学超分辨技术的不断突破，一种全新的视野正在展开。

光学超分辨技术的突破主要依赖于两种关键技术，即近场光学显微镜和荧光标记。

1. 近场光学显微镜近场光学显微镜是一种能够绕过光学衍射极限的显微镜技术。

光学显微镜为我们提供了观察微观世界的途径，然而，其分辨率一直受到限制。

近场光学显微镜通过在物体和探测器之间引入纳米刻度的探测器探头，使得探测器能够接近或直接接触被观察物体表面，从而绕过了光学衍射极限。

这种技术的发展极大地拓宽了我们对微观领域的认知。

2. 荧光标记技术荧光标记技术是另一种突破光学衍射极限的重要技术。

利用荧光标记，科学家们能够将荧光标记剂附着在被观察对象的表面或内部，从而对其进行标记。

这些荧光标记剂能够发光，并且能够通过特定的光源进行激发。

通过对荧光标记的观察和分析，科学家们能够获得超过光学衍射极限的分辨率。

这一技术的应用广泛，涵盖了生物医学研究、纳米材料研究等领域。

然而，值得注意的是，光学超分辨技术的突破并非毫无限制。

其存在一定的条件限制和技术难题。

例如，对于近场光学显微镜来说，由于纳米刻度探测器的制造和操作难度较大，其运用仍面临挑战。

同时，荧光标记技术也需要克服标记剂的选择、标记过程的可靠性等问题。

对于这些挑战，科学家们正在不断探索和研究，以期开拓更广阔的研究领域并提出更有效的解决方案。

总结而言，光学超分辨突破光学衍射极限的挑战是一个具有挑战性和前瞻性的课题。

通过近场光学显微镜和荧光标记技术的应用，科学家们正在突破光学衍射极限，实现对微观领域的更细致观察和研究。

尽管还存在一些技术难题，但相信在不久的将来，光学超分辨技术将会得到更为广泛的应用，为科学研究和各个领域的发展带来新的突破。