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荧光定量PCR应用指南荧光定量PCR（Fluorescent quantitative PCR）是依靠荧光信号的强度来定量PCR产物的一种PCR技术。
该技术通过在PCR反应体系中添加特异性荧光探针，利用荧光信号的强度来反映PCR产物的数量。
荧光定量PCR在生物医学研究、基因表达分析、致病微生物检测等领域有着广泛的应用。
下面将介绍荧光定量PCR的原理、实验步骤和一些注意事项。
一、原理：荧光定量PCR最常用的荧光探针是TaqMan探针，TaqMan探针是由两个DNA引物和一个荧光标记的探针组成。
当PCR反应进行到延伸阶段时，引物和探针结合到靶序列上形成荧光信号。
荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，通过检测荧光信号的强度可以定量PCR产物的数量。
二、实验步骤：1.设计引物和探针：选择特异性的引物和探针对目标序列进行扩增。
引物和探针的设计需要遵循一些原则，如避免引物和探针之间的自互补性、探针需选择合适的荧光染料等。
2.准备PCR反应体系：根据PCR反应需要，准备PCR反应体系。
一般包括模板DNA、引物、探针、聚合酶、缓冲液等。
3.荧光定量PCR反应：将PCR反应体系加入到荧光定量PCR仪中，进行PCR反应。
PCR反应的条件需要根据目标序列的特性进行优化，包括温度、延伸时间等。
4.数据分析：通过荧光定量PCR仪记录荧光信号的强度，根据荧光信号的强度可以反应PCR产物的数量。
通过数据分析软件对荧光信号进行定量计算，获得PCR产物的数量。
三、注意事项：1.引物和探针的设计需要严格控制，确保其特异性，避免与非靶序列结合。
2.PCR反应的条件需要进行优化，不同的目标序列可能需要不同的温度、延伸时间等。
3.控制实验中的阳性对照和阴性对照，确保实验结果的可靠性。
4.严格遵守无菌操作，避免PCR反应体系受到外源性污染。
5.选择合适的荧光定量PCR仪进行实验，确保获得准确的荧光信号强度数据。
6.实验过程中需严格按照操作规程进行，避免操作失误对实验结果产生影响。
荧光定量PCR技术的使用教程PCR（聚合酶链式反应）技术是分子生物学中常用的实验手段之一，它可以扩增起始序列的DNA片段。
荧光定量PCR技术是PCR技术的一种改进方法，它结合了PCR扩增和荧光检测技术，可以对扩增产物进行精确的定量分析。
本文将详细介绍荧光定量PCR技术的使用步骤和相关注意事项。
第一步：准备实验材料与试剂在进行荧光定量PCR实验前，首先需要准备好以下实验材料和试剂：1. DNA模板：可以是DNA提取物、血浆、组织样本等。
2. 引物（Primer）：引物对应于目标序列的两端，用于扩增DNA片段。
应选择合适的引物，包括正向引物和反向引物。
3. 标记荧光的探针（Probe）：探针可以是DNA分子、RNA分子或合成的寡核苷酸，用于检测PCR扩增产物。
4. dNTPs混合液：包含dATP、dCTP、dGTP和dUTP。
5. 磷酸缓冲液：用于维持PCR反应的酸碱平衡。
6. DNA聚合酶：用于酶切和DNA复制。
7. MgCl2：用于在PCR反应体系中提供镁离子。
8. 蒸馏水：用于稀释试剂和制备反应体系。
第二步：制备PCR反应体系1. 在无菌试管中依次加入如下试剂，制备PCR反应体系：- 1 μL DNA模板- 1 μL 正向引物- 1 μL 反向引物- 0.5 μL 荧光探针- 10 μL 2× PCR反应缓冲液- 0.5 μL 10 mM dNTPs混合液- 0.2 μL DNA聚合酶- 1 μL 25 mM MgCl2- 35.8 μL 蒸馏水注意：根据实验需求和试剂浓度的不同，反应体系中有时需要调整试剂的用量。
2. 轻轻混匀试管中的液体，避免形成气泡。
第三步：进行PCR扩增反应1. 将PCR反应体系分装至PCR管或96孔板中。
2. 将PCR管或96孔板放入PCR仪中，并设置合适的PCR程序。
- 初始变性：95°C，5分钟- 循环变性：95°C，30秒- 退火温度：根据引物的Tm值进行调整，通常为50-65°C，持续30秒- 延伸：72°C，持续1分钟- 终止延伸：72°C，10分钟3. 根据需要，可以设置PCR程序的循环次数。
荧光定量PCR原理及应用首先，PCR反应：荧光定量PCR使用特异性引物将目标DNA序列扩增。
PCR反应通常包括以下步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，反应体系中的DNA双链被加热至95°C，使其变性成两个单链。
随后，在退火温度下，引物与目标DNA的互补序列结合。
最后，在延伸温度下，DNA聚合酶以引物为模板合成新的DNA链。
这些步骤会重复多次，每次都会使目标DNA序列的拷贝数翻倍。
接下来，扩增曲线：随着PCR循环的进行，扩增曲线会呈指数增加。
扩增曲线反映了PCR反应体系中拷贝数的变化。
在扩增曲线的指数增长阶段，荧光信号会迅速增加。
随着PCR循环数增加，荧光信号的增加速率会逐渐减慢。
根据扩增曲线的特征，可以计算出PCR的阈值周期数（Ct值），即荧光信号超过背景噪音的周期数。
Ct值可以用来定量目标DNA序列的拷贝数。
最后，荧光探针：荧光探针是一种含有荧光染料和阻尼染料（quencher）的引物。
引物特异性地结合在扩增产物的靶标序列上。
在引物结合的过程中，荧光信号被抑制。
当引物与靶标序列结合后，PCR反应体系中DNA聚合酶会将DNA链分离，使荧光信号被释放出来。
通过检测释放的荧光信号，可以定量PCR反应体系中目标DNA序列的拷贝数。
1.肿瘤检测：荧光定量PCR可以检测肿瘤相关基因的突变、重排和拷贝数变化。
通过定量目标基因的变化，可以实现对肿瘤的早期诊断和治疗监测。
2.微生物检测：荧光定量PCR可以快速检测致病微生物的存在。
例如，在食品安全领域，可以用荧光定量PCR检测食品中的细菌和病毒污染。
3.分子诊断：荧光定量PCR可以定量检测与疾病相关的遗传变异。
例如，可以通过荧光定量PCR检测与遗传病相关的突变，为临床诊断提供准确的基因检测结果。
4.环境监测：荧光定量PCR可以快速检测环境中的微生物群落的变化。
例如，在水源污染监测中，可以用荧光定量PCR检测水体中的细菌和寄生虫的存在。
总之，荧光定量PCR是一种快速高效的检测技术，可以广泛应用于医学诊断、食品安全、环境监测等领域。
荧光定量PCR的原理方法及结果分析荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的检测DNA或RNA含量的方法，通过测定荧光信号的强度来确定起始模板数量的多少。
其原理主要包括引物的选择、PCR反应的进行、荧光信号的测定以及数据分析等步骤。
首先，荧光定量PCR需要选择适当的引物。
引物的设计要求首先能够特异性地与目标序列结合，这样才能保证只有起始模板被扩增。
引物的长度通常在18-24个碱基对之间，GC含量在40-60%之间，碱基序列中不能存在太多的重复序列或者分子倒序等结构。
此外，引物的Tm值应该相近，不应过于接近，以免引物发生二次结合。
另外，荧光标记的引物通常采用双探针（dual-labeled probe）和SYBR Green I染料，二者的优缺点各有不同：双探针对应用的目标突变不敏感，但是对于长序列的目标扩增效果较好；SYBR Green I适用于鉴定多个不同基因的扩增，但是对于PCR产物的目标特异性检测较差。
其次，PCR反应的进行是荧光定量PCR的核心步骤。
反应体系通常包括引物、模板DNA、DNA聚合酶、荧光标记剂和反应缓冲液。
PCR反应过程中，首先是变性，将模板DNA的双链分离；然后是退火，使引物与目标序列结合；接着是延伸，DNA聚合酶在适当的温度下进行链延伸。
PCR反应的循环数通常在25-40之间，具体循环数多少需要根据目标序列的长度和浓度来决定。
PCR反应条件的优化要注意引物浓度、PCR温度和时间。
第三，荧光信号的测定是荧光定量PCR中不可或缺的步骤。
通常，荧光信号的测定可以通过荧光实时扩增仪来进行。
在每一个PCR循环过程中，荧光实时扩增仪会记录下PCR反应管中荧光信号的强度。
随着PCR反应的进行，PCR产物的数量也在逐渐增加，荧光信号的强度也会增加。
荧光信号的强度与PCR产物的数量之间存在着一定的线性关系，利用标准曲线可以将荧光信号的强度转化为起始模板的绝对数量。
mrna荧光定量pcr条件
mRNA荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于
定量检测mRNA水平的分子生物学技术。
在进行mRNA荧光定量PCR 时，需要考虑一系列条件和步骤。
首先，准备PCR反应体系。
通常反应体系包括模板RNA、引物、荧光探针、核酸酶和反应缓冲液等。
引物和荧光探针的设计需要考
虑到靶mRNA的特异性和PCR反应的效率。
其次，进行PCR反应。
PCR反应一般包括初步变性、引物结合、DNA合成和延伸等步骤。
在mRNA荧光定量PCR中，需要根据实验设
计确定PCR反应的温度梯度和时间参数。
接着，进行PCR产物检测。
在PCR反应进行完毕后，需要利用
荧光定量PCR仪器进行PCR产物的检测和定量。
荧光探针的设计和
荧光信号的检测是mRNA荧光定量PCR的关键步骤。
最后，数据分析和结果解读。
通过荧光定量PCR仪器获取的数
据需要进行相应的数据分析和结果解读。
这包括标准曲线的绘制、PCR产物的定量和mRNA水平的计算等步骤。
总的来说，进行mRNA荧光定量PCR需要考虑实验设计、PCR反应条件、荧光探针设计、PCR产物检测和数据分析等多个方面。
合理设计实验条件和严格控制实验步骤是保证mRNA荧光定量PCR结果准确可靠的关键。
荧光定量PCR的原理及应用荧光定量聚合酶链反应（qPCR）是一种基于荧光信号的分子生物学技术，用于定量检测目标DNA序列的数量。
它结合了传统的聚合酶链反应（PCR）技术和荧光探针技术，通过检测盘细胞PCR扩增过程中产生的荧光信号的数量来确定目标序列的初始模板DNA的量。
以下是荧光定量PCR的原理和应用相关内容。
1.原理：荧光定量PCR基于PCR扩增技术，通过DNA的双链不断不断的分离和扩增，形成指数级别的增加，从而使DNA数量可检测，实现定量的目标DNA检测。
在PCR反应体系中加入DNA荧光探针，该探针含有一个荧光染料和一个阻断器。
在PCR反应中，荧光探针与引物结合，并通过荧光染料发射荧光信号。
当引物与靶DNA序列结合时，即在扩增成产物的过程中，荧光探针被水解，导致发射的荧光不再受到阻断器的遮挡，荧光信号显著增加。
通过检测PCR反应中荧光信号的强度，来确定目标序列的初始模板DNA量。
2.应用：（1）基因表达分析：荧光定量PCR可用于分析特定基因在不同组织、细胞类型或疾病状态下的表达水平差异。
通过测量目标基因的荧光信号，可以定量表达水平。
（2）病原体检测：荧光定量PCR可用于检测并定量常见病原体的存在。
例如，通过检测病毒或细菌的DNA或RNA来确定其感染程度。
（3）遗传疾病诊断：荧光定量PCR可用于检测一些遗传疾病相关基因突变的存在，并定量突变的数量。
（4）细菌或病毒负荷检测：在一些感染疾病的监测中，荧光定量PCR可用于检测和定量病菌或病毒在患者体内的负荷，可用于监测治疗效果。
（5）环境微生物分析：荧光定量PCR可用于分析和定量土壤、水样和空气等环境中的微生物（如细菌、真菌和病毒）的存在和变化。
（6）转基因分析：在转基因研究中，荧光定量PCR可用于检测和定量外源基因的存在并分析其表达水平。
（7）单细胞分析：荧光定量PCR可用于对单个细胞中目标基因或突变的检测和定量。
这对于研究单细胞的异质性和功能以及肿瘤细胞的进化和耐药性等方面的研究具有重要意义。
荧光定量pcr 的基本原理和步骤-回复荧光定量PCR（Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR）是一种常用于检测和定量DNA或RNA的方法。
它基于传统PCR技术，但在PCR反应中使用了特殊的荧光标记物，并且通过荧光信号的变化来测定目标分子的数量。
本文将详细介绍荧光定量PCR的基本原理和步骤。
一、基本原理：荧光定量PCR的核心原理是在PCR反应过程中，通过检测荧光信号的强度来确定目标分子的数量。
这种荧光信号可以来自于反应过程中特定的荧光探针或染料，也可以来自于PCR产物的累积。
荧光定量PCR通常基于特异性扩增和靶向检测的原则。
首先，通过引物的设计，选择特异性的引物来扩增目标序列。
然后，在PCR反应中加入荧光标记的引物或探针，使其与目标序列结合，并发出荧光信号。
荧光信号的强度与PCR产物的数量成正比，通过与标准曲线比较可以确定初始目标分子的数量。
二、步骤说明：1. 样品准备：首先，从样品中提取目标DNA或RNA，并对其进行纯化和浓缩。
样品的质量和纯度对于后续的PCR反应和荧光信号的准确性至关重要。
2. 引物设计：根据目标序列的特点，设计适当的引物。
引物的选择应考虑到其特异性、长度、GC含量、3’末端的稳定性等因素。
此外，还可以设计一对引物和一个荧光标记的探针，以提高PCR反应的特异性和灵敏度。
3. PCR反应体系：准备PCR反应的体系。
体系中通常包括模板DNA或RNA、引物、荧光标记物、酶、缓冲液和dNTPs等。
酶的选择通常是Taq DNA聚合酶，其在PCR反应温度下活性稳定。
4. PCR反应：在PCR仪中设定合适的温度参数，按照以下程序进行PCR 反应：变性（Denaturation）→退火（Annealing）→延伸（Extension）。
这个循环通常要重复多次，以扩增目标序列。
5. 荧光信号检测：在PCR反应过程中，可以使用实时荧光PCR仪，以实时监测PCR产物的荧光信号强度。
实时荧光定量RT-PCR检测内皮细胞t-PA mRNA方法的建立赵砚婷;张莲芬;金坚【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2006(22)5【摘要】目的建立实时RT-PCR检测人微血管内皮细胞组织型纤溶酶原激活物(t-PA) mRNA的表达.方法提取人微血管内皮细胞总RNA,经RT-PCR获得靶基因(t-PA)及管家基因(β-actin)的PCR产物.纯化后,作为标准品梯度稀释,采用SYBR Green I定量PCR检测,建立标准曲线.方法学考核参数为特异性、线性范围、精密度和重复性.分析全反式维甲酸对内皮细胞表达t-PA mRNA的干预效果.结果定量方法特异性好,检测的灵敏度达103拷贝,线性范围为103～ 1010拷贝,循环阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系(r2》0.990),批内变异≤3.10%,批间变异≤4.93%.1.25～20.00 μmol·L-1的全反式维甲酸能明显上调内皮细胞t-PA mRNA的表达(P《0.01),且呈剂量依赖性.结论实时荧光定量RT-PCR 的方法可对t-PA mRNA的表达进行准确定量,有助于溶栓药物药理学研究和新药筛选.【总页数】5页(P633-637)【作者】赵砚婷;张莲芬;金坚【作者单位】江南大学教育部重点实验室·细胞与分子药理研究室,江苏,无锡,214036;江南大学教育部重点实验室·细胞与分子药理研究室,江苏,无锡,214036;江南大学教育部重点实验室·细胞与分子药理研究室,江苏,无锡,214036【正文语种】中文【中图分类】R332.12;R340.3;R342.22;R345.63;R394.2;R973.2【相关文献】1.实时荧光定量RT-PCR检测剑尾鱼IgM mRNA方法的建立 [J], 张铃铃;任艳;石存斌;吴淑勤2.实时荧光定量RT-PCR检测糖皮质激素α-受体mRNA表达水平方法的建立 [J], 熊涛;曹政3.番鸭IFN-α mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 [J], 万春和;朱海侠;陈红梅;施少华;傅光华;程龙飞;黄瑜4.3种猪细胞因子mRNA实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用 [J], 王凤雪;黄双;刘莹;杨勇;孙娜;朱洪伟;张淑琴;程世鹏;温永俊5.水稻MOC1 mRNA TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 [J], 高东;孙宏伟;刘雪清;何霞红;王云月;李成云;朱有勇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
荧光定量PCR检测人PDGFB mRNA方法的建立与运用【摘要】目的:克隆人PDGFB mRNA的cDNA，并以此作标准品，建立TaqMan技术实时定量检测人PDGFB mRNA的方法并加以应用。
方法:RT-PCR扩增人PDGFB mRNA，将纯化产物与pMD18-T载体连接，转化DH-5α感受态细胞。
提取重组质粒，以PCR扩增、限制性内切酶双酶切、测序进行鉴定，作为标准品，建立实时定量检测人PDGFB mRNA的方法，用以检测HBSAg阴性组和HBSAg阳性组PDGFB mRNA含量。
结果:PCR扩增、双酶切鉴定及测序分析均证实PDGFB cDNA重组成功。
实时定量检测PDGFB mRNA后发现，HBSAg阴性组和HBSAg阳性组的Ct值分别为(32.185±2.006)和(21.769±5.256)，浓度分别为(1.27±0.87)×107拷贝/106PBMC和(1.24±0.58)×109拷贝/106PBMC(P<0.05)，后者PDGFB mRNA含量明显高于前者。
结论:本研究成功克隆了PDGFB荧光定量PCR标准；荧光定量PCR检测人PDGFB mRNA含量具有快速、准确、简便，特异性强等优点，适用于临床检测。
【关键词】血小板衍生因子-B 逆转录-聚合酶链反应T-A克隆实时定量乙肝病毒表面抗原Establishment and application of the method for determining human PDGFB mRNA with real-time quantitative polymerase chain reaction ZOU Li-lin, DING Zhi-nan, WANG Zhen, et al. Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics, Wenzhou Medical College, Wenzhou 325035 Abstract: Objective:To clone cDNA of human PDGFB and to use it as the standards for real-time quantifying PDGFB mRNA. Methods: Human PDGFB cDNA was amplified with RT-PCR, then ligated with pMD18-T vector and transformed into bacterium DH-5α. Plasmid DNA extracted from positive clones was amplified by PCR and digested with restriction endonucleases and sequenced. The recombinant plasmid DNA was used as the standards for the establishment of the method of real-time quantifying PDGFB mRNA. PDGFB mRNA from person with HBsAg negative and HBsAg positive was detected. Results: PDGFB cDNA cloning was proved by PCR amplification, digestion and sequence analysis. Determining PDGFB mRNA of person with HBsAg negative and HBsAg positive, Ct value was 32.185±2.006 and 21.769±5.256 respectively, and concentration was (1.27±0.87)×107copies/106PMBC and (1.24±0.58)×109 copies/106PMBC respectively. Conclusion: The method based on TaqMan technology can accurately quantify PDGFB mRNA, and it is suitable for clinical laboratory use.Key words: platelet-derived growth factor beta; reverse transcription-polymerase chain reaction; T-A Cloning; real-time quantification; hepatitis B surface antigen血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)可以分为血小板衍生生长因子A（PDGFA）和血小板衍生生长因子B(PDGFB)，它是由多种细胞产生的内源性多肽类生长因子，参与机体的多种病理、生理的调节过程[1]，如组织修复、胚胎发育及免疫调节等。
随着对其研究的深入，PDGF与疾病的关系逐步为人们所重视，PDGF与肝纤维化的发生和发展密切相关，在肝纤维化的病理生理过程中起重要作用[2]。
目前，定量检测PDGFB mRNA 的方法，主要是采用逆转录-聚合酶链反应的方法。
本研究通过T-A克隆法重组人PDGFB cDNA，以此重组质粒作为标准品，建立实时定量PCR检测PDGFB mRNA的方法，并用来检测HBSAg阴性组和HBsAg阳性组的PDGFB mRNA含量。
1 材料和方法1.1 标本来源收集温州医学院第一附属医院HBsAg阴性体检者和HBsAg阳性患者各20例，分别取EDTA抗凝静脉血2 ml。
1．2 试剂及仪器R T-PCR体系、pMD18-T载体、DH-5α菌种、限制性内切酶EcoRI/HindIII、DNA凝胶回收试剂盒、质粒DNA小量纯化试剂盒（大连宝生物工程有限公司生产）、PCR仪（BIO-RAD/Mycycler）、荧光定量PCR仪（MJ Opticon 2）、紫外凝胶分析系统（GENE GENIUS/BIO IMAGING SYSTEM）、分光光度计（BECKMAN DU80）。
1.3 引物、探针的设计与合成①引物序列：P1：5′-GGCCTTCTTAAAGA TTGGCTTCT-3′；P2：5′-GCCTCA TAGACCGCACCAAC-3′；PCR目的条带长度为179bp。
②TaqMan探针序列：5′-FAM-CTGTCCA GGTGAGAAAG-MGB-3′。
引物和探针用Primer Premier 5.0软件设计，引物由大连宝生物工程有限公司合成，探针由上海基康生物工程有限公司合成和修饰。
1.4 人外周全血单个核细胞分离及细胞总RNA提取用淋巴细胞分离液密度梯度离心法，收集单个核细胞，用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取总RNA[3]。
1.5 R T-PCR 以1.25μl总RNA为模板，以Random 9 mers为引物，逆转录反应体系10μl。
65 ℃1 min，30 ℃ 5 min，25 min内匀速升温至65 ℃，65 ℃20 min，98 ℃5 min，5 ℃5 min。
25μl PCR反应体系，含0.125μl 5U/μl Ex Taq，2.5μl 10×Ex Taq Buffer，2μl 25 mmol/L Mg2+，2μl 2.5 mmol/L dNTP，0.5μl 25μmol/L 引物P1，0.5μl 25μmoul/L引物P2，RT产物1μl。
95 ℃5 min预变性；94 ℃45 s，60 ℃45 s，72 ℃30 s，共35个循环；最后72 ℃5 min 延伸。
1.6 PCR产物纯化、与pMD18-T载体连接及转化用DNA凝胶回收试剂盒纯化上述PCR 产物，取纯化产物1μl、pMD 18-T载体1μl、T4DNA连接酶1μl、10×连接酶缓冲液1μl，加无菌双蒸水使总体积为10μl。
在16 ℃下连接过夜。
制备DH-5a感受态细胞，连接产物转化DH 5α，在氨苄青霉素平板上根据蓝白斑试验筛选阳性转化菌。
1.7 重组质粒的提取及鉴定取2 ml的菌液，用质粒DNA小量纯化试剂盒提取重组质粒。
PCR扩增：用PDGFB引物对重组质粒进行PCR检测。
EcoRⅠ/Hind Ⅲ双酶切反应：10μl 重组质粒，3μl 10×酶切缓冲液，1μl EcoRⅠ酶液(10 U/μl)，1μl Hind Ⅲ酶液(10 U/μl)，15μl 双蒸水，于37 ℃水浴3 h。
测序分析：取1 ml阳性转化菌液送至大连宝生物工程有限公司进行测序，结果用blast软件进行同源性分析。
1.8 重组质粒OD值的测定以及标准曲线的建立取阳性重组质粒测A260，将重组质粒稀释成不同浓度作为标准品进行荧光定量PCR检测。
25μl PCR反应体系：含0.25μl 5 U/μl Ex Taq Hs，5μl 5×Real Time PCR Buffer，0.5μl 250 mM Mg2+，0.75μl 10 mmol/L dNTP，1μl 25μmmol/L引物P1，1μl 25μmmol/L引物P2，1μl 25μmmol/L探针，上述RT产物1μl。
扩增参数为：94 ℃ 2 min预变性，95 ℃15 s，60 ℃30 s，40个循环。
1.9 荧光定量PCR检测人PDGFB mRNA的临床应用由20例HBsAg阴性对照和20例HBsAg阳性患者中分离外周血单个核细胞，显微镜下计数，收集106个单个核细胞，提取总RNA，荧光定量PCR检测人PDGFB mRNA的表达。
1.10 统计学处理方法采用SPSS13.0统计软件数据包进行分析。
HBsAg阴性对照和HBsAg阳性患者的PDGFB mRNA定量检测用两个独立样本t检验分析进行统计分析。
2 结果2.1 重组质粒PCR扩增鉴定以提取的重组质粒为模板，用PDGFB引物进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳可见179 bp的条带（见图1）。
2.2 重组质粒的限制性双酶切反应鉴定将重组质粒进行EcoR Ⅰ/Hind Ⅲ双酶切后进行琼脂糖凝胶上电泳，有236 bp条带(包括179 bp的PDGFB cDNA和载体上的57 bp)(见图1)。
2.3 重组质粒测序分析用通用引物对重组质粒DNA进行测序，序列如下：GGCCTTCTTAAAGA TTGGCTTCTTCCGCACAA TCTCGA TCTTTCTCACCTGGACAGGTCGC AGCTGCACCTGGGTGGGGCGGCACTGCACGTTGCGGTTGTTG CAGCAGCCGGAGCAGCGCTGCACCTCCACACAGGGCGGCCACACCAGGAAGTTGGCGTTGGTGCGGTCTA TGAGGC，经blast序列同源性分析，该序列为PDGFB cDNA序列，无碱基突变(参照序列号CU013426)。
