针对Ⅰ型及Ⅲ型前胶原基因的二联核酶的构建及体外活性研究

基因沉默与RNAi技术定义：基因沉默双是指链RNA被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。

RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。

由双链引发的植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。

有时转基因会同时导致TGS和PTGS。

基因沉默是一种RNA干扰技术。

RNA干扰是由双链RNA 引发的转录后基因静默机制。

其原理是：RNaseIII核酶家族的Dicer，与双链RNA结合，将其剪切成21 - 25nt及3'端突出的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA - induced silencing complex，RISC结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在靶mRNA上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制.一、基因沉默的分类及其机制（一）转录水平基因沉默转录水平基因沉默是指对基因专一的细胞核ＲＮＡ合成的失活，它的发生主要是由于基因无法被顺利转录成相应的ＲＮＡ而导致基因沉默。

转录水平基因沉默可以通过有性世代传递，表现为减数分裂的可遗传性。

引起转录水平基因沉默的机制主要有以下几种：１．基因及其启动子甲基化甲基化是活体细胞中最常见的一种ＤＮＡ共价修饰形式，通常发生在ＤＮＡ的ＣＧ序列的碱基上，该区碱基甲基化往往导致转录受抑制，该区甲基化的频率在人类及高等植物中分别可达４％和３６％。

［４］近来的研究表明，发生在转基因启动子５’端的甲基化是造成转录水平基因沉默的主要原因。

ERAP1结构与功能研究进展郭爱华;徐沪济【摘要】Endoplasmic reticulum aminopeptidase 1 (ERAP1) is a multifunctional enzyme belonging to the M1 family of aminopeptidases with roles in the regulation of blood pressure, angiogenesis, ectodomain shedding of several cytokine receptors, and processing of antigenic peptides presented to MHC class I molecules. Allelic variants of ERAP1 have been linked to a number of human diseases, including the autoimmune disease ankylosing spondylitis (AS), diabetes, some forms of cervical cancer, and hypertension.% 内质网氨基肽酶1(endoplasmic reticulum aminopeptidase 1,ERAP1)是氨基肽酶 M1家族中的一个多功能的酶,在血压调节、血管发生、细胞因子受体的胞外区脱落,以及对递呈至 I 型主要组织相容性抗原复合物(major histocompatibility complex class I,MHC I)的抗原肽的加工中发挥作用.ERAP1等位基因变异体与多种人类疾病相关,包括自身免疫性强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)、糖尿病、子宫颈癌以及高血压等.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2013(000)002【总页数】6页(P128-133)【关键词】内质网氨基肽酶 1;I型主要组织相容性抗原复合物;免疫反应;抗原加工【作者】郭爱华;徐沪济【作者单位】第二军医大学长征医院风湿免疫科，上海 200433; 中国航天员科研训练中心航天医学基础与应用国家重点实验室，北京 100094;第二军医大学长征医院风湿免疫科，上海 200433【正文语种】中文MHC I型分子对与之高亲和力结合的肽配基长度有严格要求，典型的肽配基长度为8~10个氨基酸残基，因此，被MHC I型分子递呈的肽必须在装载前进行精细剪切[1]。

HDV核酶研究近况国外医学分子生物学分册1999年第21卷第5朔1一{l}fHDV核酶研究近况于乐成毛青综述顾长海李奇芬审阅__,.—～,_.一第三军医大学西南医院全军传染病中心(重庆,400038)了7摘要HDV核酶为HDV双滚环复制所必需,最小序列约85枝苷酸(n’)左右,呈独特的假结样结掏,其结构和功能的关系已得到深入探索反式HDV核酶可能会成为一种新型有效的抗病毒药物键词HDV;核酶;结构和功能;应用丁衔韵研关键词核酶;结构和功能;应用jI竹田0’】/—一-—一J丁型肝炎病毒(HDV)基因组为单负股环状RNA,通过双滚环机制(doublerollingcirclemechanism)进行复制.该过程必须经过病毒前体RNA的自我催化裂解,即必须经过基因组核酶(genomeribozyme,gRz)和抗基因组核酶(antigenomeribozyme.ag. Rz,即复制中间体)的自裂.这一过程与一些植物致病病毒RNA复制特点相似.HDV复制过程中RNA的延伸,由宿主细胞RNA聚合酶II催化;自裂产物连接成环状,可能由宿主细胞RNA连接酶催化”.1HDV核酶的自裂位点及最小序列1988年,Sharmeen等用B『物延伸法证明ag.Rz的自裂位点在C904～G903之间.不久.Kuo等报道gRz的自裂位点在U688~G689之间.gRz36~100(自裂位点端和3’端分别含36nt和1.0nt)活性较高.后来.Perrotta等通过体外试验发现g. Rzl84和ag.Rzl84(j端分别为u和c)能保持较高自裂活性,其序列分别对应于HDV 基因组第688～772nt和抗基因组第904～820nt,提示HDV核酶的最小序列约85lit左右.g.Rzl一82和ag.Rzl一79虽能充分自*国家自然科学基金资助课题裂,但速率大大减慢.Thill等将g.RzI84的5端延长至5nt,去除3端第jl～68nt,得到g.Rz5—66(g.Rz71)仍能自裂,但同等条件下速率明显下降.2HDV核酶切割反应的机理及产物虽然.HDV核酶的结构与锤头状,发夹状核酶等明显不同,但催化反应发生的机理相似.都是转酯化反应.由自裂位点3端的2’-OH或氧原子对自裂位点处的磷原子实施亲核攻击,产物是23环化磷酸二酯和5一OH.倘缺乏2一OH或自裂位点5端为一脱氧核苷酸,则不能发生自裂.3体外HDV核酶切割反应的条件体外HDV核酶切割反应的条件为:①Mg_等二价金属阳离子为切割反应所必需. 其矶理之一可能是中和核酶RNA结构间的阴性斥力.使易于折叠成活性结构.Ca,Mn可替代Mg,有的研究甚至观察到Ca增加反式切割的效率远高于Mgis,v]. Sr”_,CA,Ba,Co,Pb,Zn对某些诱变株的自裂有较弱的辅助作用②一般在65C范围内随温度升高核酶活性增加.温度过高则因破坏HDV核酶的二级结构而使其丧失活性.⑧有的研究观察到HDV核酶裂国外医学分子生物学分册1999’年第2l卷第j期解底物的速率对数在pH4～6范围内呈线性上升,而另有研究发现某些HDV核酶的切割速率在pH5～9.1范围内并无明显变化,但大多数研究均提示pH7.0～7.5时核酶活性最高.①变性剂:G魁-CⅢb2-:’5ol群cJq/一G’1i:i4HDV核酶的结构模型及其结构域g,Rz和ag.Rz二级结构相似,但与锤头状核酶,发夹状核酶及链孢属Vs核酶不同.迄今主要提出3种模型,即假结样结街(pseudoknorstructure),斧头样结构(ax headstructure),三叶草形结构(cloverleaf structure)等模型.诱变分析,光交联,化学修饰等研究证实假结样结构(附图)最为可能’Ⅲ,可划分为9个结构域仅含lnt足可发生自裂,该nt可为U,C,A,但不能为GE]3].4.2Stem皿Lee等[.将g.Rzl0—66此延长2倍,不妨碍核酶折叠+但能增加核酶对甲酰胺的抵抗性,使活性有所增强+而减少lbp就会明显降低自裂活性此区的碱基配对所形成的双螺旋堆集结构主要起稳定核酶活性的作用,不参与构成活性中心,其序列有较大灵活性4.3Stemnl由3bp构成,5侧与stemI51侧共轴,3侧与stemI相邻.破坏其碱基配对或改变其序列均会导致活性下降+某些序列甚至完全无活性.所以此区结构和序列均很重要.4.4L3.与stemⅡ共同构成一个发夹环结构(hairpin—loopstructure).g.Rz和ag.Rz此区序列基本相同,富含嘧啶,唯g.Rz多1个U27.L3有较高的序列特异性+可能参与构或活性中心其5端,特别是CZllZ4附近区域可能靠近裂解位点的磷原子以发挥催化作用.4.5StemⅣ和L4两者共同构成另一个发夹环结构体外试验证明此区可减至4bp而对活性影响不大.但稳定的stmⅣ结构确实有利于活性提高,尤其是其根部的CG配对起着连接儿/4和J4/2的桥梁作用4.6J1/2连接stem【和stemI,对体外自裂反应意义不大,设计反式核酶时可被切断或删去但ag.Rz此区的8nt较保守,可能与核酶活性调节有关.4.7Jl/4连接stem【与stemⅣ,其中的3个G对核酶活性发挥很重要,若G38/40被A,C,u取代,则核酶活性明显下降.此区的G40/国外医学分子生物学分册l999年第21卷第5期42与位于J4/2区的G74/75的同型配对可使核酶结构扭曲,分别使C75/76靠近切割位点4.8J4/2连接stemN与stemI.对此区中G74/75,C75/76,A77/78,A78/79的碱基修饰显着降低核酶活性,C75/76的改变会导致核酶活性完全丧失光交联研究也显示ag.Rz的C76靠近切割位点.因此C75/76很可能直接参与了催化作用.4.9应用x线衍射技术发现g.RzJ1/~区的G38G39可与L3区的C22,C21形成短双链区P1.1.从而使g.Rz呈复杂的巢式双假结样(nesteddouble pseudoknot)高级结构.多种方法研究显示:L3,J1/4,J4/2可能共同参与构成催化中心.进一步研究尚发现: 若在两类HDV核酶间互换L3和J4/2+则活性均下降;但若只互换Jl/4,则活性均有不同程度升高”5反式HDV核酶的设计及意义核酶的自裂是一种分子内切割反应.称为顺式切割(cis—cleavage),核酶对底物的分子间切割则称为反式切割(trans—cleavage). HDV核酶是迄今发现的唯一可通过病毒自然感染而进入哺乳动物细胞中的核酶.所以研究其反式作用的重大意义在于利用它可能优于其它核酶的抗哺乳动物致病病毒作用. Branch等曾以斧头型结构为基础.从相应cDNA上分别转录出相当于”酶和”底物”的RNA分子,在适当条件下将两者混合,确实出现了”酶对”底物”的反式切割.假结样结构最接近实际结构,以它为基础的反式作用体系可分为3类:①”底物”和”酶”通过stemI的碱基配对结合,”底物”相当于stemI5侧序列;②”底物”和”酶”通过stem口,stemⅣ的碱基配对结合,酶由stemⅡ3侧,J4/2,stem～3侧组成;③”底国外医学分子生物学分册1999年第2l卷第5期物”和”酶通过stemI,stemⅡ,stemⅣ的碱基配对结合,”酶”由steml5侧,stemⅡ,L3,stemI3侧,J1/4及stemIV5侧构成,如Lai等设计的RNA73/RNA37(底物/酶)体系口,1个RNA37分子可切割多个RNA73分子,显示了”酶”的特点.后两类体系固核酶”对底物”序列要求过严,几无应用意义.第一类体系中+底物”与”酶”结合只需7nt,且在一定程度上可改变stemI3侧序列以适应底物序列+因此具有用来切割异源RNA分子的潜在价值.6HDV核酶活性的调节目前对HDV核酶活性的调节有这样几点认识:①基于HDV—RNA分子内约7O 碱基互补的事实,Lazinski等0认为互补序列的某些部分可充当”衰减子(attenuator)”的角色,通过碱基配对,使核酶及时失活②丁型肝炎病毒抗原(HDV Ag)虽非HDV核酶自裂所必需,但确能加快自裂和拼接反应1.Razas等1”发现未感染细胞内存在一种HDV Ag类似物,能影响HDV—RNA复制,并具有和HDV Ag相互作用的潜在能力.③新近Perrotta等通过体外试验发现ag.Rz 的第86～89nt(5,GCCA3)可与J1/z区的第10～13nt(5UGGC3)形成一双螺旋区P2a,对ag.Rz具有Na依赖性调节活性:低浓度Na(3mmol/L以下)时可显着抑制ag.Rz活性,但若先用高浓度Na一(100 mmol/L以上)与ag.Rz适当温育后再加入Mg,则使切割活性明显升高;HDV Ag对HDV桉酶活性的调节可能类似这一机制.应当指出,加强对临床分离株序列变异的研究+可更多了解HDV桉酶在体内的结构和功能变化+获取悻外实验研究所不能获取的重要信息,两者结合起来,对深入了解HDV核酶结构,性质,功能具有重要意义. 参考文献LaiMM.AnnuRevBiochem,1995;64:259 SharmeenLeta1.JVjroI,1988;62?2674 KuoMYPa1.JVirol,1988;62:4439 PerrottaATeta1.Nature,1991{350:434 BeenMDeta1.EurJBiochem,1997;247:741 PuttarajuEMeta1.NucleicAcidsRes一1993: 214253SakamotoTeta1.JBioehemTokyo,1997{l21:11238FauziHela1.NucleicAcidsRes,1997;25: 31249LeeCBeta1.Biochemistry,1996;35:12303 10DuhameIJeta1.NucleicAcidsRes,1996:24: 391111JengKSela1.NucleicAcidsRes,1996;70: 240312PerrottaATela1.NucleicAcldsRes.1996: 24:131413PerrotlaATeta1.Biochemistry,1992~31:16 14BravoCa1.NucleicAcidsRes,1996;24: 1351’15BeenMDeta1.RNA,19g5;1:106l16Ferre—D’AmareARa1.Nature,1998,395: 56717WadkinsTSela1.NucleicAcidsRes,1997; 25:408518BranchADa1.ProcNatIAcadScjUSA, 1991;88:1016319KawakamiJeta1.FEBSIe(t,1996{394:l32 20NishikawaFetEurJBicohem,1996:237: 71221LaLYCa1.Biochemistry,1996:35:12422LazinskDWel,a1.JVirol,l995{69:l】90 23JengKSeta1.JVirol一1996:7O:429524RazasR”a1.Science,1996;274:9025PerrottaATeta1.JMotBioI,1998;279:361 (1998一l1—10收稿)。

一种三螺旋重组人源化iii型胶原蛋白、制备方法及应用三螺旋重组人源化III型胶原蛋白（recombinant humanizedtype III collagen protein）是一种具有重要生物功能的蛋白质分子。

它在成纤维细胞中广泛存在，是维持细胞外基质稳定性和结构完整性的重要组成部分。

三螺旋重组人源化III型胶原蛋白的制备方法主要分为以下几个步骤：1.基因克隆：首先，通过PCR扩增技术从人体细胞中提取III型胶原蛋白的基因序列。

然后，在合适的质粒载体中插入所得基因序列，使其与表达载体相连。

2.转染和表达：将质粒载体与适当的细胞株进行转染，使其能够表达III型胶原蛋白。

常用的细胞株有CHO细胞、HEK293细胞等。

转染后，通过适当的培养条件和筛选方法，筛选出高效表达III型胶原蛋白的细胞株。

3.蛋白纯化：经过培养和表达后，收集细胞培养基，将其中的细胞残渣和其他杂质去除，得到含有III型胶原蛋白的上清液。

然后，利用离心、膜过滤、柱层析等技术手段对上清液进行纯化，得到纯净的III型胶原蛋白。

4.结构和功能验证：通过质谱、电镜等技术手段对纯化后的III 型胶原蛋白进行结构和功能验证，确保其具有预期的三螺旋结构和生物活性。

三螺旋重组人源化III型胶原蛋白的应用十分广泛。

以下是一些典型的应用领域：1.细胞外基质研究：三螺旋重组人源化III型胶原蛋白可以作为细胞外基质的组分，用于研究细胞与基质之间的相互作用、细胞迁移和侵袭等生物学过程。

2.药物载体：通过功能修饰，将药物结合到三螺旋重组人源化III 型胶原蛋白上，利用其良好的生物相容性和生物降解性，可以作为药物的有效载体，提高药物的稳定性和生物利用度。

3.修复和再生医学：三螺旋重组人源化III型胶原蛋白可以用于组织工程和再生医学研究中。

它可以作为支架材料用于组织修复和再生，促进细胞黏附和增殖，促进组织修复和再生过程。

4.皮肤抗衰老：胶原蛋白在皮肤中起着维持弹性和紧致度的重要作用。

血清Ⅰ型前胶原氨基端前肽、Ⅰ型前胶原羧基端前肽、Ⅰ型胶原羧基端肽在骨转移性癌诊断中的应用王抒;张军宁;乔田奎【摘要】Objective:To study the clinical value of determination of serum procollagen I N-terminal propeptide (PINP), pro-collagen I carboxy-terminal propeptide (PICP) and carboxyterminal telopeptide of type I collagen (ICTP) contents in cancer patients with bone metastases for diagnosis . Methods- Serum PINP, PICP and ICTP contents were measured in 41 patients with bone metastases and 39 controls without bone metastases. The patients with bone metastases consisted of Group A, Group B and Group C. The comparison of bone turnovers among patients with different bone loads were analyzed. Results.- Serum PICP, ICTP contents was significantly greater in patients with bone metastases than without bone metastases(P<0. 01). With the increase of the extent of bone metastases, serum PINP, PICP and ICTP contents elevated. Levels of PICP correlated well to the number of foci(P<0. 01) , Levels of ICTP, PINP correlated to the number of foci(P<0. 05). Levels of PINP correlated well to ICTP. Conclusions: The determinations of serum PINP, PICP and ICTP can reflect the clinical status of metastases size (PICP and ICTP more sensitive); Levels of PICP correlat well to the number of foci.%目的;探讨血清Ⅰ型前胶原氨基端前肽( PINP)、Ⅰ型前胶原羧基端前肤(PICP)、Ⅰ型胶原羧基端肽(ICTP)在骨转移癌诊断中的临床价值.方法:将80例肿瘤患者分为骨转移组41例和无骨转移组(对照组)39例,采用Soloway分级标准,将骨转移组患者再分为A、B、C3个亚组,所有患者空腹抽取静脉血.分析血清PINP、PICP、ICTP与骨转移程度之间的相关性及其彼此之间的相关性.结果:骨转移癌患者血清PINP、PICP、ICTP水平较对照组均升高,其中PICP、ICTP水平与对照组有显著差异(P＜0.01)；PINP、PICP、ICTP水平在A、B、C3组均依次递增；血清PICP水平与骨转移灶数目相关性良好(P＜0.01),ICTP、PINP水平与骨转移灶数目呈一定相关(P＜0.05)；血清ICTP 水平与PINP水平呈中度相关.结论:检测血清PINP、PICP、ICTP水平都能反映骨转移患者的病情变化,以检测血清PICP、ICTP水平临床价值高；血清PICP水平与骨转移数目的相关性良好.【期刊名称】《中国临床医学》【年(卷),期】2011(018)004【总页数】3页(P456-458)【关键词】Ⅰ型前胶原氨基端前肽(PINP);Ⅰ型前胶原羧基端前肤(PICP);Ⅰ型胶原羧基端肽(ICTP);骨转移;癌【作者】王抒;张军宁;乔田奎【作者单位】复旦大学附属金山医院放疗科,上海200540;苏州大学附属第一医院放疗科,江苏苏州,215006;复旦大学附属金山医院放疗科,上海200540【正文语种】中文【中图分类】R730.4多数恶性肿瘤易发生骨转移且可导致一系列并发症,包括病理骨折、严重骨痛等,影响患者的生活质量和生存期限。

一种三螺旋重组人源化iii型胶原蛋白、制备方法及应用三螺旋重组人源化III型胶原蛋白是一种人工合成的胶原蛋白，具有广泛的应用潜力。

它的制备方法通常包括基因克隆、重组融合表达、蛋白纯化和人源化处理等步骤。

这种胶原蛋白在医学和生物工程领域有着重要的应用价值。

首先，制备三螺旋重组人源化III型胶原蛋白的第一步是通过基因克隆获取目标基因的DNA序列，然后将其插入表达载体中，构建得到重组融合表达的质粒。

载体往往包含有启动子、增强子等转录调控元件，可以使目标基因在宿主细胞中高效表达。

接下来，经过适当的质控筛选，合成的质粒会被转染到宿主细胞中，通过细胞培养来表达目标蛋白。

这一步骤往往选择大肠杆菌作为宿主细胞，因为大肠杆菌生长速度快、易扩大培养规模且成本低廉。

表达过程中，常会选择添加诱导剂如IPTG来诱导目标蛋白的表达。

随后，可通过细胞破碎、固定化金属亲和层析等技术手段来纯化表达的目标蛋白。

在固定化金属亲和层析过程中，本蛋白中具有多个带有亲和标签的金属结合位点，可与金属离子配对，实现蛋白的选择性捕获和纯化。

最后，通过人源化处理，将目标胶原蛋白进行进一步的化学修饰，以提高其中的天然特性。

这种处理通常包括水解性能的改善、抗原性的降低及外源性物质的去除等。

此外，还可以通过控制化学修饰的程度和手段，进一步调控胶原的乙酰化、亚乙基化、羟基化等化学反应，增强其生物活性和生物相容性。

三螺旋重组人源化III型胶原蛋白具有许多应用领域。

首先，它在药物传递系统中具有广泛的应用前景。

由于其特殊的结构和生物活性，可用于制备具有高加载量、高稳定性和高生物活性的药物载体，用于靶向给药和控释药物。

其次，在组织工程中，三螺旋重组人源化III型胶原蛋白可用于构建人工组织和器官。

它的生物相容性和天然胶原相似的结构使其成为最理想的组织工程材料之一。

通过利用其完全人源化的特点，可以避免免疫排斥等问题，促进细胞的黏附和增生，实现更好的组织修复和再生效果。

生物技术制药第二版课后思考题及答案（全）1. 生物技术制药分为哪些类型？生物技术制药分为四大类：（1）应用重组DNA技术(包括基因工程技术、蛋白质工程技术)制造的基因重组多肽，蛋白质类治疗剂。

（2）基因药物，如基因治疗剂，基因疫苗，反义药物和核酶等（3）来自动物、植物和微生物的天然生物药物（4）合成与部分合成的生物药物2．生物技术制药具有什么特征？（1）分子结构复杂（2）具有种属特异性（3）治疗针对性强，疗效高（4）稳定性差（5）基因稳定性（6）免疫原性（7）体内的半衰期短（8）受体效应（9）多效性（10）检验的特殊性3.生物技术制药中有哪些应用？应用主要有：（1）基因工程制药：包括基因工程药物品种的开发，基因工程疫苗，基因工程抗体，基因诊断与基因治疗，应用基因工程技术建立新药的筛选模型，应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物，基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用，利用转基因动植物生产蛋白质类药物（2）细胞工程制药：包括单克隆抗体，动物细胞培养，植物细胞培养生产次生代谢产物（3）酶工程制药（4）发酵工程制药4.基因工程药物制造的主要程序有哪些？基因工程药物制造的主要步骤有：目的基因的克隆，构造DNA重组体，构造工程菌，目的基因的表达，外源基因表达产物的分离纯化产品的检验5.影响目的的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪些？（1）外源基因的计量（2）外源基因的表达效率：a、启动子的强弱b、核糖体的结合位点 c、SD序列和起始密码的间距 d、密码子组成（3）表达产物的稳定性（4）细胞的代谢付荷（5）工程菌的培养条件6.质粒不稳定分为哪两类，如何解决质粒不稳定性？质粒不稳定分为分裂分为分裂不稳定和结构不稳定。

质粒的分裂不稳定是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象；质粒的结构不稳定是DNA从质粒上丢失或碱基重排，缺失所致工程菌性能的改变。

提高质粒稳定性的方法如下：（1）选择合适的宿主细菌2）选择合适的载体（3）选择压力（4）分阶段控制培养（5）控制培养条件（6）固定化7.影响基因工程菌发酵的因素有哪些？如何控制发酵的各种参数？影响因素：（1）培养基（2）接种量（3）温度（4）溶解氧（5）诱导时机的影响（6）诱导表达程序（7） PH值8.什么是高密度发酵？影响高密度发酵的因素有哪些？可采取哪些方法来实现高密度发酵？高密度发酵：是指培养液中工程菌的菌体浓度在50gDCW/L以上，理论上的最高值可达200gDCW/L 影响因素：（1）培养基（2）溶氧浓度（3）PH (4)温度（5）代谢副产物实现高密度发酵的方法：（1）改进发酵条件：a、培养基 b、建立流加式培养基 c、提高供养能力（2）构建出产乙酸能力低的工程菌宿主菌：a、阻断乙酸产生的主要途径 b、对碳代谢流进行分流 c、限制进入糖酵解途径的碳代谢流d、引入血红蛋白基因（3）构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌9.分离纯化常用的色谱分离方法有哪些?它们的原理是什么?方法有离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱及高压液相色谱。