冷冻切片protocol

冰冻切片详细说明切片技术最早期是从冰冻切片开始，后来逐步有了发展和更新，冰冻切片弥补了石蜡切片和火棉胶切片之不足，石蜡切片和火棉胶切片需时太久，且在制片中要使用许多化学试剂，石蜡切片还需要加温过程，因而某些重要的不稳定的组织成分如脂类、酶以及抗体等，可能被溶解和破坏。

冰冻切片过程较简单，无须经过上述步骤，组织中的水分起着包埋剂的作用，组织经固定或不固定即可进行冰冻切片，切片厚度一般可在6-8微米，组织没有收缩，易保持生活时原有状态，是保存脂肪组织，许多神经组织特殊染色方法和组织化学方法，特别是酶的活性十分理想的切片方法，对于外科临床诊断和现代免疫荧光诊断，冰冻切片也很重要。

其缺点是组织过大不易冰冻，连续切片困难。

5微米以下切片不易成功。

但是随着现在冰冻包埋液的不断改进，已经能切出少于3微米的切片一、直接冰冻切片法冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。

组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。

1．恒冷箱切片就是将组织在恒冷箱的切片机切片。

目前恒冷箱切片机的品种较多。

此种切片适用于科研和教学上的连续切片。

要求预先开动电源（预冷准备），配多种固定组织台，以便更换组织。

2．甲醇制冷器制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装制，其冷却速度比较快，属于开放式，作一般常规冰冻切片用。

3．二氧化碳冰冻法将组织用蒸馏水洗后，放在冰冻切片机的冷冻台上，加蒸馏水少许。

打开冷冻台的二氧化碳开关，二氧化碳气体喷出，待组织出现冷霜时，将二氧化碳关闭，即可切片。

若组织冷冻过硬则切片易碎；组织冷冻硬度不足，则切片呈粥糜状，需用间歇方法继续冷却。

硬度一般在刚开始解冻时最合适，应迅速切片。

4．半导体致冷冰冻切片法将组织置半导体致冷台上，滴加少许蒸馏水，调好切片机的厚度。

先接通热器的循环流水，然后接通电源，电源的正负极切勿接反，用整流电源控制温度。

二、明胶冰冻切片法明胶包埋法一般多用于冰冻切片易破碎的组织，特别是某些有树枝状突起的组织，当其切片后投入水中时，常常引起分散，甚至发生丢失，某些间隙较多的组织，有时会因发生散乱而失去相互间的联系，可形成移位现象。

冷冻切片的报告引言冷冻切片技术是一种在生物学研究中常用的方法，可以使样本保持原貌并保存细胞和组织的结构。

本报告将介绍冷冻切片的步骤和原理，以及在科学研究中的应用。

步骤1. 选择适当的样本首先，需要选择适合冷冻切片的样本。

通常，新鲜的动、植物组织或细胞是理想的选择。

确保样本是新鲜的，以避免冷冻后的细胞或组织结构变化。

2. 固定样本在进行冷冻切片之前，需要对样本进行固定。

使用适当的固定剂（如甲醛或乙醇）将样本固定，以保持其细胞和组织结构的稳定。

3. 预处理样本在切片之前，需要对样本进行预处理。

这包括去除杂质、清洁和去除多余的水分。

确保样本表面干燥，以便在冷冻切片时获得更好的结果。

4. 冷冻样本将预处理后的样本放置在冷冻剂中，通常使用液氮或液氧进行冷冻。

冷冻样本可以防止细胞和组织的结构变形，并且可以保持其原貌。

5. 切片将冷冻的样本放置在切片机中，使用切片刀快速切割样本。

切片时，保持刀片和样本的温度低，以避免样本的解冻。

6. 收集切片使用显微镜玻片或其他收集介质收集切片，确保切片的完整性和准确性。

根据需要，可以用染色剂或其他标记物对切片进行染色。

7. 分析和观察最后，将切片放在显微镜下进行观察和分析。

通过观察切片的细胞和组织结构，可以获得关于样本的更多信息，并进行科学研究或诊断。

原理冷冻切片的原理是利用冷冻样本的低温和切片机的快速切割来保持样本的结构和形态。

低温冷冻可以防止细胞和组织的变形和损伤，而快速切割则可以确保样本的完整性和准确性。

应用冷冻切片技术在生物学研究和医学诊断中有广泛的应用。

以下是一些主要的应用领域：1. 组织学研究冷冻切片可以用于对组织中细胞和结构的研究。

通过观察和分析切片，可以了解组织的构成、功能和组织病理学等方面的信息。

2. 免疫组化冷冻切片可以用于免疫组化实验。

通过在切片上使用特定的抗体，可以检测和定位特定的蛋白质或细胞标志物，从而了解其在组织或细胞中的表达和分布。

3. 分子生物学研究冷冻切片可以用于分子生物学研究中的基因表达分析、蛋白质定位等实验。

冰冻切片步骤很全面冰冻切片是一种常用的实验技术，在生物学、医学研究、组织学观察等领域有着广泛应用。

以下是一份详细的冰冻切片步骤，旨在提供全面的指导。

注意，不同的实验目的可能会有一些差异，因此请根据实际需求调整步骤。

1.準备1.1获取你所需的样本。

这个样本可以是活体动物的组织，也可以是固定处理后的组织。

1.2准备冷冻介质。

通常使用的冷冻介质包括液氮、干冰和冷冻套。

液氮是一种非常冷的液体，可以迅速冻结样本。

干冰是固态二氧化碳，可以提供较低的温度。

冷冻套是一种装置，可以通过循环冷却剂来维持全套工具的较低温度。

1.3准备工具和设备。

这些工具和设备通常包括切片机、切片模具、刀片、显微镜片和刷子。

1.4调整工作环境。

确保实验室温度适宜、空气流通，并消毒工作台和其他工具。

2.样本取样和固定2.1根据实验目的，选择合适的样本区域。

例如，在动物研究中，你可能需要选择大脑的特定区域。

2.2切下样本。

使用手术器械，例如手术剪刀和手术刀，在样本区域周围切下足够大小的组织块。

2.3快速固定样本。

使用适当的固定液将样本固定。

常用的固定液包括10%缓冲福尔马林和4%聚乙二醇。

将样本完全浸没在固定液中，确保完全固定，避免其损伤。

3.冷冻3.1冷冻样本。

将固定的样本迅速置于冷冻介质中。

如果使用液氮，直接将样本放入液氮中。

如果使用干冰，将样本放入常温下事先准备好的干冰盒中，并立即放入冷冻套中。

3.2冷冻条件。

根据样本的性质和实验要求，选择适当的冷冻条件。

通常情况下，液氮的温度低于-150°C，而干冰的温度大约为-78°C。

3.3冷冻时间。

样本的冷冻时间取决于其大小和固定液的穿透性。

通常情况下，较小的样本需要较短的冷冻时间，而较大的组织块需要较长的冷冻时间。

一般而言，冷冻时间为几个小时到几天。

4.切片4.1为切片做准备。

在切片之前，将切片模具放在切片机上，并冷却至所需的温度。

同时，将刀片插入切片机。

4.2取出样本。

免疫组化实验材料：需要进行观察的脑片存放位置：一抗、二抗、DAPI放在冰箱一层;山羊血清放于冰箱二层。

所用试剂：10%山羊血清；PBST（PBS+%Triton）；一抗（1:1000）；二抗（1:500）；PBS（配制方法：将一个1L的烧杯洗净晾干，称量8g NaCl， KCl, Na2HPO4, KH2PO4放至烧杯中，向烧杯中添加800ml ddwater，放在磁力搅拌器上搅拌，调PH至，后定容至1L）；DAPI（用PBS配制，1:10000）；抗荧光淬灭封片液仪器或器皿：24孔板（洗净晾干，为了便于后续操作，要将24孔板盖子和板子上画一条横线以防止盖子盖错，在盖子上划线对24孔板按照其作用（如：装有洗一抗用的PBST的孔，则标明PBST（洗一抗用））进行分区）；室温摇床实验步骤：1、封闭：将冷冻切片所得的脑片进行封闭，封闭用1ml山羊血清+9ml PBST，每孔加800微升，将脑片用玻璃钩取出放入24孔板中，放于4℃过夜。

2、封闭完成后，用玻璃钩将脑片取出放于添加了一抗（1:1000，一抗用封闭液配制）（rabbit or mouse or chicken）的24孔板中进行孵育，置于室温摇床，8h（记得计时），之后放于4℃过夜。

（一抗有两种，即单克隆抗体和多克隆抗体。

单克隆抗体特异性较强，但亲和性较弱；多克隆抗体特异性较弱，但亲和性较强）3、用一抗孵育后，将脑片用玻璃钩取出，放于添加了800微升PBST的24孔板中进行洗涤，洗3次，每次15分钟，每次洗涤后都要将脑片重新用玻璃钩取出放于添加了新的PBS的24孔板中，放于室温摇床。

4、之后，将脑片从含PBST的24孔板中取出，放入添加了二抗（1:500，一般用封闭液配）的24孔板中，放在室温摇床上孵育2h，每孔加800微升。

（二抗一般根据一抗来选择，如一抗为鼠源的，二抗就选择抗鼠的；一抗为兔源的，二抗就选择抗兔的）5、二抗孵育后，将脑片用玻璃钩取出，放于装有PBST的24孔板中洗5次，每次洗涤都要将脑片取出放于呈有新的PBST的24孔板中，每次15分钟，放于室温摇床。

oct冷冻切片流程英文回答：OCT Freezing Section Protocol.Materials:Fresh tissue specimen.OCT (optimal cutting temperature) compound. Disposable cryomolds.Liquid nitrogen.Cryostat.Cryosectioning blades.Slides.Hematoxylin and eosin (H&E) stain.Procedure:Tissue Preparation:1. Trim the tissue specimen to a size suitable for cryomolding (approximately 0.5 x 0.5 x 0.5 cm).2. Embed the tissue in OCT compound in a disposable cryomold.3. Orient the tissue within the OCT so that the desired plane of section is perpendicular to the base of the mold.4. Freeze the cryomold containing the tissue in liquid nitrogen until completely solid.Sectioning:1. Secure the frozen tissue block in the cryostatchamber.2. Select the appropriate cryosectioning blade and adjust the blade angle and thickness setting.3. Section the tissue at the desired thickness (typically 5-10 um).4. Mount the sections onto glass slides.Staining:1. Fix the sections in cold acetone for 10 minutes.2. Stain the sections with hematoxylin and eosin (H&E) according to standard protocols.3. Dehydrate the sections through a graded series of ethanol solutions.4. Clear the sections in xylene and mount with a coverslip.Interpretation:Examine the stained sections under a microscope to assess the morphology and architecture of the tissue.Identify and characterize any abnormalities or pathological changes.中文回答：OCT冷冻切片流程。

准备材料：酒精棉滤纸枪（1ml）24孔板刀片毛刷记号笔试剂配制：4%多聚甲醛：称取40g多聚甲醛,加入温热(约60度左右)的蒸馏水约400ml，搅拌,加入少量的1N NaOH溶液，搅拌至完全溶解；加入0.2M的PBS500ml，冷却后过滤，蒸馏水定容至1000ml。

20%蔗糖溶液：20g蔗糖加0.1MPBS（PH7.4)至100ml（温水促溶）OCT包埋剂（购买）染色剂：Tris．钙缓冲液：(O．1 mol加0．018mol氯化钙)：Tris(Hydroxymethyl)methylamine 3．025 g；氯化钙0．499 g；去离子水加至250 ml；室温保存。

酸性前孵育液：(pH4．35)乙酸钠0．2 mol 9 ml，乙酸0．2 mol 21 ml，调pH至4．35；碱性前孵育液：Tris．钙缓冲液30 mL以0．1 NHCI仔细调pH至10．4；ATP酶孵育液：A TP(disodium salt)45 mg（购买）；Tris．钙缓冲液30 ml，0．1 NHCl 调pH至9．5。

注意：1.ATP酶组织化学主要使用钙激活法。

该方法沿用已久，所用的试剂配制比较繁复，尤其对pH值有严格的要求，必须精确调试试剂的pH值，并每次都要新鲜配制，以保证染色的成功。

2.前孵育液和底物孵育液应精确调节pH值，配制完成后立即用EP管分装，置一20℃保存。

3.ATP酶染色法。

可见正常骨骼肌纤维大小均匀，形状规则，排列成马赛克状。

依前孵育液pH的不同，分为不同的纤维类型。

采用碱性前孵育液(pH 10．4)时，I型肌纤维不显色。

Ⅱ型肌纤维呈深染。

采用酸性前孵育液(pH 4．5)时，深染的为I型，浅染为IIa型，介于中间染色为IIb型肌纤维。

具体操作流程：４％多聚甲醛固定过夜２０％的蔗糖过夜冰冻切片，6-8u m烘烤２小时（３７度烘箱）染色（或者－80度保存，染色前需要37度烘烤2小时）免疫组化笔在组织片周围划圈酸性孵育液200u L滴人组织片中，室温下孵育15min（或者碱性孵育液200u L滴人组织片中，碱性孵育20 min）双蒸水冲洗数次滴入ATP酶孵育液200u L，37度孵育，酸性45min，碱性30 min1％氯化钙作用3 min2％硝酸钴3min自来水快洗自来水充分冲洗，过去离子水；脱水封片。

冷冻切片实验材料：固定好的鼠脑试剂：30%蔗糖；包埋剂；1*PBS用品与仪器：冷冻切片机；刀片；24孔板实验步骤：（切片的地点在1楼和6楼，1楼的切片机在使用前需要预约）1、将前一天放于4%PFA中固定的鼠脑样品取出放入30%蔗糖中进行固定。

（鼠脑刚放入时会浮在液面上，放置过夜，待沉淀后可进行切片操作）2、进行切片操作之前要进行一些准备工作，首先，在24孔板（每个鼠脑大概需要2个24孔板）每个孔中加入1ml PBS，用来舒展脑片。

其次，具有自带荧光的鼠脑的切片需要使用包有锡纸的24孔板，防止其荧光淬灭3、开切片机，将CT和OT温度都调节为-20℃，切片厚度设定为40μm。

4、用包埋剂包埋底座，凝固后将底座置于切片机相应位置上，调整好底座的位置，使之与刀片平行，转动切片转轮，将底座切平，注意不要让底座的厚度太大，根据切口的情况调整切片机使之运作良好。

（注意切片的转轮要在每一次切片完成后锁定，防止切伤手指）5、沿与冠状切平行的方向将鼠脑的小脑部分切除，将剩余的脑放置在底座上（注意鼠脑的中缝线要对准底座上的豁口），底座平行放置于-20℃环境下，可看到鼠脑由底座部分向上逐渐变白。

6、待鼠脑完全变白后，向鼠脑上添加包埋剂，等待鼠脑包埋好。

（如发现部分鼠脑未包埋住或包埋不充分，需要向该部位再次添加包埋剂）7、鼠脑包埋好后，将底座上流出的多余包埋剂切除，然后将样品连同底座放至切片机上进行切片。

8、放好样品后，先按后退键，将盛放样品的基座向后放，目测使刀片不能切到样品的位置。

9、转动切片机，使样品慢慢接近刀片，继续转动切片机进行切片，直至看到嗅球部位的脑组织，清理掉嗅球之前切下的切片。

10、自嗅球开始，每10片样品切片用玻璃钩粘起，放至第一个24孔内（脑切片如果粘在孔壁上不能直接用玻璃钩刮下来，而要用孔内的PBS冲刷下来），以此类推，直至得到自己需要的样品切片为至。

11、切片过程中注意观察切片形状，可发现得到切片的先后顺序依次为：嗅球、前额叶、含有胼胝体的脑片、SVZ、SCN等。

冰冻切片实验步骤
嘿，咱今儿就来讲讲这冰冻切片实验步骤！
你可别小瞧这冰冻切片，就像是厨师要做出一道美味佳肴，每一步都得精心料理。

首先呢，得准备好新鲜的样本，这就好比是做菜得有好食材呀！把样本修整好，可不能随随便便就扔那儿了。

然后就是冷冻啦！把样本放到那专门的冷冻设备里，让它快速地冻起来，这就像是给样本穿上了一层“冰铠甲”。

接下来，切片环节可就来咯！要小心翼翼地操作，不能切得厚了薄了的，那得跟艺术品一样精致才行。

想象一下，要是切得乱七八糟，那后面还怎么观察呀！
切好片之后呢，还得给它贴上标签，可不能搞混了呀，这就像给每个小宝贝起个名字一样。

再之后，就是染色啦！给这些切片染上漂亮的颜色，让它们能更好地展示出自己的特点。

这就跟给人化妆似的，得恰到好处，才能凸显出美来。

染完色，可不能忘了清洗呀，把多余的染料洗掉，让切片干干净净的。

最后就是观察啦！在显微镜下，仔细地瞅瞅这些切片，看看能发现
啥秘密。

这就像是在寻宝一样，充满了惊喜和期待呢！
做冰冻切片实验呀，就跟走一条小路似的，每一步都得稳稳当当的，要是哪一步出了岔子，那可就前功尽弃啦！所以呀，得打起十二分的
精神来。

总之呢，冰冻切片实验可不简单，但只要咱认真对待，一步一个脚
印地去做，肯定能收获满满的成果呀！加油吧！。

全部实验步骤1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时2 30%蔗糖脱水48小时以上3 -250C包埋（冰冻切片机内）4冰冻切片冰冻切片步骤1.冰冻切片4um左右，室温25°C复温30min，浸入4°C预冷的丙酮固定10min，2.PBS（PH为7.2-7.4）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换）3.用30%过氧化氢一份，纯甲醇50份（需要现配，避光条件封闭，可以用纸盒盖住皿）30min。

4.PBS（PH为7.2-7.4，酸性）在9cm皿内摇床冲洗3次，每次5min（第一次冲洗时间短些，约1min后更换），甩去PBS，擦干切片周围的水分，用免疫组化笔或蜡笔在组织周围画一适当大小的圈，距离组织不宜太近，与切片组织保持5mm左右距离，太近会导致边缘效应。

5.5%BSA，室温孵育20min，期间注意观察，以免BSA干燥而导致背景太高，请注意在皿内玻片两侧放置浸湿的卫生纸或棉球。

6.甩去血清，PBS洗1min，擦干周边水分，圈内可不擦，但尽量要甩干，以免导致抗体浓度不均。

7.配置一抗工作液用5%BSA（抗体浓度为1:100），悬空加入一抗工作液50-100ul，枪头不要触及组织，以免损伤组织结构，滴加一抗后在水平桌面画圈方式振荡，混匀一抗，否则抗体可能附着不匀。

8.放入湿盒内，置于4°C冰箱过夜（最长不可超过48h），注意盖盖，放入后观察玻片是否处于水平位（否则抗体可能流失，导致玻片组织干掉，出现背景高和假阳性），孵育期间观察抗体是否干，若干了赶快用PBS清洗浸泡。

9.第二天上午取出玻片，置常温复温30min，后PBS冲洗1+5+5+5min，10.滴加1:100生物素标记的二抗（注意选择核对一抗来源，抗体加入稀释后在EP管内弹匀，掌上离心机离心）室温孵育30min-1h，后PBS冲洗1+5+5+5min。

11.滴加1:100比例稀释的辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素PBS稀释液（SABC）室温1h，后PBS冲洗1+5+5+5min，甩干，以免显色不均。

冷冻切片操作指南在医学、生物学和食品科学等领域中，冷冻切片是一种重要的技术，用于将样品冷冻固化后，切割成薄片以供进一步观察和研究。

本文将为读者提供一份冷冻切片操作指南，介绍冷冻切片的基本原理、实验室操作步骤和注意事项。

一、冷冻切片的基本原理冷冻切片是将样品通过快速冷冻技术使其迅速固化，然后使用切片机或显微切片机将固化的样品切割成薄片。

冷冻切片的目的是保留样品的形态和结构，避免切片过程中的伤害和变形。

冷冻切片一般适用于需要保留细胞和组织结构的实验。

二、实验室操作步骤1. 样品准备：将待切割的样品准备好，可以是细胞、组织或食物等。

样品处理过程中需要注意保持样品的完整性和活性。

2. 冷冻固化：将样品放置在冷冻剂中，例如液氮或冷冻盒中的冰水混合物中，进行快速冷冻固化。

冷冻时间需要根据不同样品的特性进行优化，一般在几分钟至数小时之间。

3. 选用切片仪器：根据实验需求，选择合适的切片仪器，可以是手动的切片机或半自动/全自动的显微切片机。

4. 切片调整：根据实验需求，调整切片仪器的切割参数，例如切片厚度和速度等。

通常，薄片的厚度在几微米至数十微米之间。

5. 切片过程：将冷冻固化的样品放置在切片仪器的切片台上，固定好，并且调整好切割参数。

使用手动或电动操作切片仪器，将样品切割成所需的薄片。

6. 切片收集：将切割好的薄片收集起来，可以使用切片刷或显微镊子等工具进行操作。

注意保持薄片的完整性和干燥，避免受到污染和损坏。

7. 切片处理：根据实验需求，进行切片的进一步处理，例如染色、免疫组化等。

三、注意事项1. 样品处理过程中需要注意保持样品的完整性和活性，避免样品受到损伤和变性。

在样品处理过程中，可以使用缓冲液或甘油等物质进行保护。

2. 冷冻固化的时间和温度需要根据不同样品的特性进行优化。

过长或过短的冷冻时间都可能导致样品质量下降。

3. 在选择切片仪器时，需要根据实验需求和预算等因素进行权衡。

手动切片机相对便宜，但操作较为繁琐；半自动/全自动的显微切片机操作更为方便，但价格较高。

冰冻切片技术(恒冷箱式)
1接通电源，装好切片刀，关闭观察窗，合上降温开关，调整温度控制器到所需温度。

2箱内温度下降后，打开观察窗，并组织固着器放于箱内速冰台上，先放少量羧甲基纤维素于其上，冻结后将组织块放上，并在其周围加适当包埋剂，使组织包于其中。

3组织冻结后，将组织固着器装于切片机上，调整组织的切面，使与刀刃平行，并使贴近刀刃，调整切片厚度指示装置，至所需刻度，关闭观察窗。

4修整组织表面，放下抗卷板，切取薄切片，贴于载玻片。

5取出切片，吹干或固定处理。

6切片完毕拨回温度控制器，使箱内温度保持在0℃左右。

擦干箱内各装置，并上油。

冷冻切片技术实验及冷冻切片机的基本操作冷冻切片技术是一种常用的生物学实验技术，通过将生物组织或细胞样本在非常低的温度下快速冷冻并切割成薄片，以保持样本的原始结构和化学组成，从而观察细胞或组织的形态结构和功能。

冷冻切片技术广泛应用于组织学、细胞学、免疫学等领域的研究和临床诊断。

冷冻切片机是冷冻切片技术的关键设备，用于将冷冻后的样本切割成薄片。

下面将介绍冷冻切片技术实验的步骤及冷冻切片机的基本操作。

1.样本处理：将待切割的生物组织或细胞样本进行处理，如固定、染色等。

这些步骤可以根据实验需求进行选择，以保持样本的形态和结构。

2.冷冻固化：将处理好的样本通过冷冻剂（如液氮或液氮混合物）迅速冷冻固化。

冷冻速度越快，冰晶越小，样本的结构损伤越小。

3.取样本：将固化好的样本从冷冻剂中取出。

在取样本之前，需注意将取样本的器具和工作台等一同冷冻至与样本相同的温度，以避免样本融化。

4.进样盒固定：将样本放置在迅速冻结剂（如液氮）预冷的进样盒内，并用冷冻剂浸泡样本。

进样盒的固定有助于保持样本的形状和组织结构。

5.冷冻切片：将装有样本的进样盒置于冷冻切片机的切片台上，调节刀片与样本的切割厚度。

通常，切割厚度可根据需要调节，一般在5-100微米之间。

6.切片收集：将切割好的样本切片收集到载玻片中，通常使用水平移动的玻片支托架来收集切片。

收集时需保持切片的顺序，并用特定的液体介质（如生理盐水）浸润切片，以防止切片变形或干燥。

7.染色和显微观察：将切片进行染色处理，如组织染色、免疫染色等，以显示出组织的细胞结构和化学成分。

然后，可以使用显微镜观察和拍摄切片的形态结构和细胞组织分类。

冷冻切片机的基本操作如下：1.准备：打开冷冻切片机电源，确保刀片已经安装，并根据需要调整切割厚度。

检查是否有足够的液氮或其他冷冻剂供应。

2.进样：将待切割的样本放置在切片台上的进样盒中，使用夹具或夹具系统将其固定在进样盒上。

确保样本与刀片的切割平面垂直，并浸泡在冷冻剂中。

冰冻切片实验步骤1.准备实验所需材料和设备：包括有机溶剂（如乙醇、氯仿、甲醇等）、30%的蔗糖溶液、液氮、切片刀、显微镜玻片、显微镜载玻片、切片盒等。

2.收集和处理样品：可以选择动植物的组织或细胞作为实验样品。

收集样品后，可以用生理盐水或缓冲液进行清洗和去除杂质。

如果是动物组织，可以选择将其冷冻在液氮中，以保持其完整性。

3.组织固定：将收集到的样品转移到含有组织固定剂的试管中。

常见的组织固定剂包括缓冲液、乙醛或霍乱毒素。

根据所需的实验目的和需要，可以选择适当的组织固定剂。

4.组织固定处理：组织固定的时间因组织类型和目的有所不同，一般在数小时至数天之间。

在固定过程中可以加入一些缓冲液，以维持组织的pH值和渗透压。

5.甘油渗透：将固定的组织置于甘油溶液中。

甘油的作用是提高组织的柔软度和切片的质量。

一般可选择10%左右的甘油溶液。

6.冰冻：将处理好的组织置于液氮中，直到其完全冰冻。

冰冻的温度通常为－20℃。

在冰冻过程中，可以使用冷冻托盘和冷冻盒等设备加快组织的冻结速度。

7.切片：使用预先冷却的切片刀，将冰冻的组织切成所需的薄片。

切片的厚度一般为10-100微米。

为了保证切片的质量，可以在切片过程中使用切片保护剂，如30%蔗糖溶液。

8.华里士染色：将切好的组织切片转移到显微镜载玻片上，使用华里士染色液进行染色。

华里士染色是一种常用的组织染色方法，可以染色细胞核和细胞浆。

9.覆盖玻片：将染色后的切片盖在显微镜玻片上，并使用透明胶片或封口剂固定切片。

10.显微观察：将制备好的切片置于显微镜下，观察和记录感兴趣的细胞或组织结构。

可以使用不同放大倍数的镜头进行观察和分析。

11.结果分析：对观察到的细胞或组织结构进行分析和解释。

可以使用图像处理软件进行图像的分析和处理。

12.结论和讨论：根据实验结果，得出相应的结论并进行讨论。

可以与已有的研究结果进行对比，验证实验的准确性和可靠性。

冷冻切片操作指南
随着科学技术的进步，冷冻切片技术被广泛应用于多个领域，包括生物学、医学和材料科学等。

冷冻切片技术可以帮助研究人员了解物质的微观结构和特性，为相关研究提供有力的支撑。

本文将为您介绍冷冻切片的操作指南。

一、准备工作
1. 准备好所需材料
在进行冷冻切片之前，您需要准备好以下材料：
- 组织样本：可以是动物组织、植物组织或其他材料。

- 冷冻切片仪：根据需要选择适当型号的冷冻切片仪。

- 切片刀：保持切片刀的锋利度，以确保切片质量。

- 冷冻剂：例如液氮或乙醇。

- 切片架：用于放置切片。

2. 样本固定和冷冻
首先，您需要对样本进行固定和冷冻。

固定样本的方法根据研
究目的的不同而有所差异。

对于生物组织，常用的固定剂包括甲醛、乙酸乙酯等。

接下来，将固定的样本放入冷冻剂中进行冷冻。

确保
样本充分冷冻，以提高切片质量。

二、冷冻切片操作步骤
1. 准备切片仪
根据切片仪的使用说明准备切片仪，确保各项设置都正确。

如
有需要，调整刀片的角度和速度，以获得最佳的切片效果。

2. 切片样本
将冷冻的样本置于切片仪的切片架上，并将切片架放入切片仪中。

调整刀片的位置，使其与样本接触。

启动切片仪，开始切片操作。

切片时应保持手部稳定，以避免切片变形或切片质量下降。

3. 收集切片
使用显微镜观察切片，将切片以适当的方式收集起来。

可以使
用刷子、针头或切片网格等工具收集切片。

注意切片的顺序和位置，以便后续的实验操作和图像分析。

冰冻切片免疫组化 The document was prepared on January 2, 2021
1 冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟（另：丙酮先在-20C 预冷,然后在4C固定片子15分钟,固定后在室温下干燥后再做免疫组化），PBS洗，5分钟×3。

2 用3％（另 %）过氧化氢孵育5~10分钟（另：最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20分钟。

此配方不易产生脱片。

配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次新鲜配制），消除内源性过氧化物酶的活性。

PBS洗，5分钟×2。

3 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。

倾去血清，勿洗，
4 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。

5 回收一抗，PBS冲洗，5分钟×3次。

6 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。

7 PBS冲洗，5分钟×3次。

8 显色剂显色（DAB或AEC）。

10 自来水充分冲洗，复染，封片。

如果你的组织曾放在多聚甲醛中固定的话，建议还是抗原修复效果比较好，如果没在甲醛中浸泡，无需抗原修复。

如果你的片子切完后在冰箱中保存的话，做之前，从冰箱取出后先室温半小时，然后入37℃烤箱一小时，再进行免疫组化实验，掉片现象会少一点。

我们以前片子从-20℃取出后，接着就做免疫组化，片子掉得很多。

冰冻切⽚protocol1冰冻切⽚protocol1.材料及⽅法1.1实验材料冰冻切⽚1.2主要试剂0.1moL/L PH=7.4的PBS缓冲液4%多聚甲醛溶液50%蔗糖溶液（现⽤现配）组织冰冻切⽚包埋剂20%氨基甲酸⼄酯多聚赖氨酸包恩⽒液1.3⽤品与仪器烧杯（1000ml 100ml 50ml），量筒（1000ml 10ml），漏⽃，滤纸，玻璃棒，载玻⽚，盖玻⽚，滴管，镊⼦，标签纸，玻璃分针、⼿术⼑⽚、⼿术剪、眼科剪、⽑剪⼑、托盘、灌注针头、注射器（50ml）、三通接头、表⾯⽫。

仪器见表1所⽰。

1.4实验⽅法将昆明⼩⿏通过注射乌拉坦（氨基甲酸⼄酯）⿇醉后，进⾏⼼脏灌注⽣理盐⽔和多聚甲醛，分别取其胰腺和坐⾻神经、脑，⽤包恩⽒液和4%多聚甲醛两种⽅法来固定，然后进⾏HE染⾊，最后⽤显微镜进⾏镜检观察分析。

2 实验步骤流程2.1 组织的取材与固定2.1.1固定液的配制1、包恩⽒液（共配200ml）：2、0.1mol/LPBS缓冲液：3、多聚甲醛（共配200ml）4、脱⽔30%蔗糖2.1.2⼿术取材及固定将昆明⼩⿏进⾏腹腔注射乌拉坦(100g/ml)⿇醉后，进⾏⼼脏灌注,⽣理盐⽔（50ml）和多聚甲醛（50ml），分离坐⾻神经、脑和胰腺，PBS洗3次，各5分钟（或洗⼀次20分钟），将坐⾻神经包进⼤脑，⽤4%多聚甲醛固定坐⾻神经（2h以上），包恩⽒液固定胰腺（3h以上），PBS洗3次，各5分钟（或洗⼀次20分钟）。

2.2 脱⽔脱⽔是应⽤脱⽔剂将组织内的⽔分置换出来，同时组织⼜不出现收缩变形等⼈⼯改变。

我们选择蔗糖为脱⽔剂。

2.2.1溶液配制30%蔗糖溶液2.2.2脱⽔步骤⽤30%蔗糖溶液脱⽔，4℃冰箱内过夜，⾄组织沉底为⽌。

PBS洗三次，各5分钟（或洗⼀次20分钟）。

2.3包埋⽤包埋剂包埋，锡纸包好，放于-20℃下冰冻保存。

2.4切⽚、粘⽚及烤⽚切⽚是将组织标本制成很薄的⽚⼦，以便染⾊后，在显微镜下能观察细胞的形态结构和病变情况，是制⽚中的重要⼀环。

病理制片技术――冷冻切片的制作一、概述冷冻切片是利用物理降温的方法将新鲜的组织标本冷冻使其产生一定的硬度进行切片的技术方法。

与石蜡切片相比，由于冷冻切片不需脱水包埋因此制片速度快，是为手术进行中的临床医师提供病理诊断的良好方法。

此外由于冷冻切片的标本是未经固定的新鲜组织，因此冷冻切片也是脂肪染色、酶组织化学染色以及某些免疫组织化学染色和原位分子杂交的理想制片方法。

冷冻切片的不足是组织细胞的形态略逊于石蜡切片。

二、冷冻切片的制作方法利用氯乙烷喷洒、二氧化碳喷射、半导体制冷的方法均可制作普通的冷冻切片，用于术中的病理诊断。

恒冷箱冷冻切片机可以制作适用于各种目地的冷冻切片，是目前最为常用的理想冷冻切片制片方式。

1.冷冻切片的技术操作方法(1)将恒冷箱冷冻切片机的速冻头和箱内温度调整到适宜的切温度，一般情况下为一18～一25℃。

(2)在标本冷冻托上涂布一层冷冻包埋剂一OCT，然后将取材后新鲜标本安放在标本冷冻托上并用OCT覆盖标本。

(3)标本冷冻完成后将标本托固定在切片机的机头上，调整机头位置使其恰好位于切片刀的后方。

(4)使用粗切削方式进行标本的粗切削至暴露标本的最大平面，使用自动推进方式连续切削2～3刀后用毛笔清除机头、标本托及切片刀上的组织碎屑。

(5)调整并确认切片的厚度，一般为4～8 um，染脂肪和神经组织应控制在12~25 u m。

(6)放下防卷板使防卷板的位置恰好与切片刀的刀刃完全平行并略突出于刀刃。

(7)以自动推进的方式进行切片，良好的切片将在防卷板的下方形成一张完整平整的薄片，如切片略有弯曲可用小毛笔轻轻展平切片。

(8)打开防卷板，用载玻片平稳地轻压切片使其平整地吸附到载玻片上。

三、冷冻切片的染色切好的冷冻切片立即投入丙酮中进行固定，一般固定1～2 min即可进行染色，用于免疫组化染色的冷冻切片应在切片略干时即刻投入冷甲醇中固定10~15 rmin然后进行相应的组织化学染色程序。

1．冷冻切片的HE染色程序。

冰冻切片实验步骤冰冻切片是一种常用的实验技术，用于研究生物样品的结构和功能。

在冰冻切片实验中，样品必须被快速冻结并制成非常薄的切片，以保持样品的原始结构和形态。

以下是一个冰冻切片实验的一般步骤，供参考。

1.准备工作：-准备所需的实验材料和设备，包括动物或细胞样品、细胞培养基、PBS缓冲液、冷冻剂（如液氮或干冰）、冷冻切片机、切片刀片、切片贴片和载玻片等。

-充分冷却冷冻切片机，并确保切片刀片处于锋利和清洁状态。

-确保实验环境卫生干净，并且操作台面上没有其他杂物和细菌。

2.过度冷冻：-在离心管或培养皿中收集样品，如组织块或细胞团。

-将样品迅速置于冷冻剂中，以快速冷冻样品。

在制备过程中，样品冷冻的速度非常重要，可以使用冰浴或液氮使样品迅速冷冻。

3.制备冷冻样品：-将冷冻固态样品放入冷冻切片机的样品夹内，确保样品与夹具接触良好。

-调整切片刀片的角度和位置，以确保薄片的切割。

-使用冷冻切片机制备冷冻样品，比如用于大脑切片的考尔密斯键切片机。

4.切片过程：-打开冷冻切片机的刀片和样品夹，以容纳载玻片。

-将切片刀片横跨切片机的切片口，并确保刀刃与样品夹接触。

-使用微调装置，轻轻地将切片刀片向下移动，以制备样品切片。

可以根据需要调整切片的厚度。

5.取样和处理：-将切制好的样品轻轻地使用毛刷或细针取下，并将其浸泡在PBS缓冲液或其他处理液中进行进一步处理。

-根据实验需求，可以进行染色、免疫标记和显微镜检查等处理。

6.制备切片贴片和载玻片：-取出切片贴片并将其浸泡在PBS缓冲液中，让其变湿。

-使用镊子或其他工具将处理好的样品放在切片贴片上，然后轻轻地将切片贴片放在载玻片上。

确保样品均匀分布在切片贴片上，并避免形成气泡。

7.干燥和封装：-将切片贴片从PBS缓冲液中取出，用纸巾或吸水纸轻轻地吸去多余的液体。

-将载玻片置于干燥盒中，确保切片在常温下彻底干燥。

-使用合适的密封胶将载玻片封装，以防止切片的氧化和损坏。

总结：冰冻切片实验是一种常用的技术，用于研究生物样品的结构和功能。