肺炎链球菌检测-菌落形态鉴定 Colony Morphology Test

肺炎链球菌活菌数含量的测定操作规程1.引言肺炎链球菌是一种常见的呼吸道病原微生物，对于疾病的防控具有重要意义。

测定肺炎链球菌的活菌数含量是判断疾病传播性和临床治疗效果的重要指标。

本文档旨在规范肺炎链球菌活菌数含量的测定操作，确保测定结果的准确性和可靠性。

2.实验所需材料肺炎链球菌培养基冰箱分装管微量移液管、移液器和吸头显微镜细菌计数板和计数室3.实验步骤1.取一小瓶肺炎链球菌培养基放置于冰箱中冷藏，保持4℃。

2.取适量肺炎链球菌培养基，分装于无菌分装管中，避免反复冻融，可存放在-20℃的冰箱内长期保存。

3.取一支肺炎链球菌分离菌株，用无菌吸头取适量细菌液，接种于肺炎链球菌培养基中。

4.将接种好的培养基放置于恒温摇床中，在37℃恒温箱中培养24小时。

5.取培养好的细菌液，用无菌吸头吸取适量的细菌悬液，放置在显微镜片上。

6.用显微镜观察细菌悬液中的活菌，计数并记录。

7.将细菌计数板放置在计数室中，将观察到的活菌在计数板上记录。

4.实验注意事项所用材料必须无菌，以防止其他微生物的污染。

活菌的计数应在24小时内完成。

活菌数的检测应重复3次并取平均值。

实验环境应保持洁净，避免灰尘和其他污染物对实验结果造成干扰。

5.结果记录与分析根据实验步骤所得的数据，计算平均活菌数含量，并记录在实验数据表中。

通过对不同样本的活菌数进行比较和分析，可以了解肺炎链球菌的传播程度和感染风险。

6.结论本操作规程提供了一种测定肺炎链球菌活菌数含量的标准化方法，经过验证具备准确性和可靠性。

科学使用本操作规程可以为疾病的早期预防和传播控制提供重要的实验数据支持。

注意：本操作规程仅供参考，具体实施过程请根据实验条件和要求进行调整。

肺炎链球菌鉴定流程肺炎链球菌（肺炎链球菌属）是导致人类社区获得性肺炎（CAP）最常见的病原体之一。

准确鉴定肺炎链球菌对于指导适当的抗菌治疗和监测抗菌剂耐药性的出现至关重要。

该鉴定过程涉及多个步骤，包括：革兰氏染色：革兰氏染色是鉴定肺炎链球菌的第一步，因为它是一种革兰氏阳性球菌，通常成链状排列。

形态学检查：通过显微镜检查革兰氏阳性标本，可以观察到肺炎链球菌的典型的链球菌形态。

链条的长度和排列模式可能因菌株而异。

荚膜染色：肺炎链球菌具有多糖荚膜，可通过荚膜染色技术（例如，奎肯斯泰特染色）显现出来。

荚膜的存在是肺炎链球菌鉴定的关键特征。

血清学检测：血清学检测，如奎肯斯泰特试验，可用于确定肺炎链球菌的荚膜血清型。

肺炎链球菌的荚膜由不同的血清型组成，每种血清型与不同的抗原性决定簇（PSA）相关。

生物化学测试：多种生物化学测试可用于确认肺炎链球菌的鉴别，包括：溶血反应：肺炎链球菌通常在绵羊红细胞琼脂平板上显示β溶血反应。

胆盐耐受性：肺炎链球菌可耐受高浓度的胆汁盐，这是区分其与其他链球菌的重要特征。

尿素酶活性：肺炎链球菌通常产生尿素酶，可水解尿素。

分子诊断：分子诊断方法，如聚合酶链反应（PCR），可用于快速鉴定肺炎链球菌，尤其是在培养困难的情况下。

PCR检测靶向肺炎链球菌基因，如lytA或cpsA。

抗菌剂敏感性测试：进行抗菌剂敏感性测试对于指导针对肺炎链球菌的适当治疗至关重要。

通常使用琼脂稀释法或扩散法来确定肺炎链球菌对各种抗菌剂的敏感性。

鉴定肺炎链球菌的流程通常涉及以下步骤：1. 革兰氏染色：确定标本中是否存在革兰氏阳性球菌。

2. 形态学检查：观察革兰氏阳性球菌的链球菌形态。

3. 荚膜染色：显示肺炎链球菌荚膜的存在。

4. 血清学检测：确定肺炎链球菌的荚膜血清型。

5. 生物化学测试：进行溶血反应、胆盐耐受性和尿素酶活性测试以确认鉴别。

6. 分子诊断：如有必要，进行PCR检测以快速鉴定肺炎链球菌。

7. 抗菌剂敏感性测试：确定肺炎链球菌对各种抗菌剂的敏感性。

从肺部感染患者痰液中检出溶血隐秘杆菌[摘要]：目的对从肺部感染患者痰液中检出溶血隐秘杆菌进行鉴定和药敏分析，为临床诊断和治疗提供参考。

方法：按《全国临床检验操作规程》第四版方法进行接种培养涂片染色镜检，以法国梅里埃API Coryne条码鉴定菌种，K-B法做药敏试验。

结果：该肺部感染患者痰培养分离出菌株，经菌落形态、染色镜检生化试验生物学性状符合隐秘杆菌属，API Coryne条码鉴定为溶血隐秘杆菌。

药敏试验对喹诺酮类、碳青霉烯类、青霉素类、头孢菌素类、大环内酯类抗生素均敏感，对复方新诺明天然耐药。

结论：溶血隐秘杆菌是引起肺部感染的病原菌，此菌对多种抗生素敏感，值得临床关注。

关键词：肺部感染痰液溶血隐秘杆菌Abstract:[Objective]To identify and analyze the susceptibility of Arcanobacterium haemolyticus in sputum of patients with pulmonary infection, in order to provide reference for clinical diagnosis and treatment. [Methods] According to the fourth edition of the National Clinical Test procedure, the smear staining was carried out. Thestrains were identified by API Coryne bar code in France by Merieux, and the drug sensitivity test was done by K-B method. [Results] The strains were isolated from sputum culture of the patients with pulmonary infection and identified as Arcanobacterium hemolyticus by colony morphology and biochemical test and staining microscope. The biological characters were conformed to Arcanobacterium hemolyticus by API Coryne bar code. Drug sensitivity tests for quinolones, carbapenems, Penicillins, cephalosporins, macrolides antibiotics are sensitive to compound Xinomin natural resistance.[Conclusion]Arcanobacterium haemolyticus is the pathogen causing pulmonary infection, which is sensitive to various antibiotics and deserves clinical attention.Key words: pulmonary infection, sputum, Arcanobacterium haemolyticus溶血隐秘杆菌,属于放线菌科，隐秘杆菌属，为兼性厌氧菌。

一、实训目的本次实训旨在通过实际操作和理论学习，深入了解肺炎链球菌的性质、生物学特性、致病机制以及相关实验室检测方法。

通过实训，提高学生对微生物学知识的掌握，培养实际操作技能，增强对病原微生物的识别和检测能力。

二、实训时间2023年X月X日至2023年X月X日三、实训地点XX大学微生物实验室四、实训内容1. 肺炎链球菌的形态学观察2. 肺炎链球菌的生化特性鉴定3. 肺炎链球菌的分离纯化4. 肺炎链球菌的致病性检测5. 肺炎链球菌的药物敏感性试验五、实训过程1. 肺炎链球菌的形态学观察（1）实验材料：肺炎链球菌标准菌株、显微镜、玻片、染色液等。

（2）实验步骤：- 将肺炎链球菌接种于玻片上，进行涂片。

- 使用革兰氏染色法对涂片进行染色。

- 使用显微镜观察肺炎链球菌的形态和排列方式。

（3）实验结果：- 观察到肺炎链球菌为革兰氏阳性球菌，呈矛头状成双排列或呈短链状。

2. 肺炎链球菌的生化特性鉴定（1）实验材料：肺炎链球菌标准菌株、生化鉴定管、培养基等。

（2）实验步骤：- 将肺炎链球菌接种于生化鉴定管和培养基上。

- 观察并记录肺炎链球菌的生化反应结果。

（3）实验结果：- 肺炎链球菌能够分解葡萄糖，产生酸性产物，不分解乳糖。

3. 肺炎链球菌的分离纯化（1）实验材料：肺炎链球菌标准菌株、琼脂平板、无菌器械等。

（2）实验步骤：- 将肺炎链球菌接种于琼脂平板上，进行划线分离。

- 将分离后的菌落进行纯化培养。

（3）实验结果：- 成功分离出纯化的肺炎链球菌菌落。

4. 肺炎链球菌的致病性检测（1）实验材料：肺炎链球菌标准菌株、实验动物、注射器等。

（2）实验步骤：- 将肺炎链球菌接种于实验动物体内。

- 观察并记录实验动物的反应。

（3）实验结果：- 实验动物出现肺炎症状，证明肺炎链球菌具有致病性。

5. 肺炎链球菌的药物敏感性试验（1）实验材料：肺炎链球菌标准菌株、药敏纸片、琼脂平板等。

（2）实验步骤：- 将药敏纸片贴于琼脂平板上。

肺炎链球菌挑取一个菌落做胆汁溶菌试验（1）原理：胆汁可激活肺炎链球菌的自溶酶从而加速了菌体自溶。

（2）方法-试管法：将细菌接种于试管内，加入10%去氧胆酸钠或纯牛胆汁，37℃，10分钟后观察试管内细菌状态。

（3）结果：若观察到试管内溶液变清则结果为阳性。

将菌液涂布做Optochin试验（1）原理：肺炎链球菌对Optochin敏感，而Optochin对其他链球菌则无抑制作用。

（2）方法：将2～3个待检菌菌落密集划线接种于羊血琼脂平板，用镊子贴放Optochin纸片（5ug/每片）于平板上，35℃5％CO2环境中孵育18～24小时，观察抑菌环大小。

（3）结果：抑菌环直径≥14mm为敏感，＜14mm时，参照胆汁溶菌试验判断是肺炎链球菌还是草绿色链球菌，无抑菌圈出现为耐药。

甲型链球菌甲型溶血性链球菌：菌落呈灰色针尖状，菌落周围有2~4mm透明溶血环触酶试验阴性，分解葡萄糖产酸不产气。

对Optochin耐药，不被胆汁溶解，不分解菊糖草绿色链球菌（Viridans Streptococci）又称为甲型（α）溶血性链球菌，是人体的重要正常菌群之一，分布于上呼吸道、胃肠道和女性生殖道，以口腔分布为最多。

性质：革兰阳性球菌该菌可致败肺炎链球菌胶乳凝集测定法1 在一干净玻片上分别滴两滴生理盐水。

2 从冰箱取出鉴定试剂(Slidex pneumo-kit)于室温。

3 在其中一滴生理盐水上滴加R1试剂，在另外一滴上滴加R2试剂，用搅拌棒混匀。

4 轻轻晃动玻片2分钟，观察结果。

5 2分钟内，如R1出现凝集为阳性；如R1和R2均未出现凝集为阴性。

注：R3为阳性对照。

药敏纸片的选择细菌鉴别要点1、革兰阳性球菌所有革兰阳性球菌第一步为触酶试验。

通常触酶阳性为葡萄球菌和微球菌，阴性为链球菌科。

但不排除例外，气球菌为弱阳性。

粪肠球菌偶有阳性。

操作触酶试验应尽量避免用铂金取菌环（针）在H2O2 上涂菌，而应先涂菌，在滴H2O2，步骤不能颠倒。

肺炎链球菌鉴定流程肺炎链球菌是一种革兰阳性菌，可引起肺炎、脑膜炎和败血症等严重感染。

其识别需要准确可靠的实验室检测。

以下是肺炎链球菌鉴定的综合流程：显微镜检查：将疑似标本制成涂片，革兰染色。

在显微镜下观察革兰阳性球菌，通常呈卵圆形或兰氏链球菌排列。

培养和形态学特征：疑似标本接种于适当的培养基上，如血琼脂平板。

培养 24-48 小时，观察菌落形态、溶血性（α、β、γ）。

α溶血菌落周围出现绿色透明晕环。

生化反应：进行生化反应，如 katalase 试验、optochin 敏感性试验。

Katalase 阳性菌产生气泡，optochin 敏感菌在含 optochin 的培养基上生长受抑制。

抗原检测：利用免疫学方法检测肺炎链球菌荚膜多糖 (CPS) 抗原。

常见的技术包括乳胶凝集试验和酶联免疫吸附测定 (ELISA)。

不同血清型荚膜多糖抗原可用于区分不同的肺炎链球菌株。

分子检测：利用聚合酶链反应 (PCR) 等分子技术检测肺炎链球菌特异性基因。

PCR 可快速灵敏地检测出肺炎链球菌，即使在标本量少或菌载量低的情况下。

血清分型：根据肺炎链球菌荚膜多糖抗原的不同，将其分为 90 多种血清型。

血清分型对于流行病学调查和疫苗接种策略至关重要。

耐药性检测：检测肺炎链球菌对常用抗生素的耐药性。

常见的抗生素包括青霉素、头孢菌素和宏观内酯类。

耐药性检测结果指导临床治疗方案的选择。

综合解读：结合上述检测结果，综合解读以确定疑似标本中是否含有肺炎链球菌。

准确的鉴定有助于指导患者的管理和控制肺炎链球菌感染的传播。

优势和局限性：肺炎链球菌的鉴定流程提供了准确可靠的结果。

综合方法提高了检测的灵敏性和特异性。

分子检测技术在标本量少或难以培养的情况下尤为有用。

培养时间和抗生素耐药性检测结果的等待时间可能是局限性。

荚膜肿胀分型试验
（Quellung Typing）
试验开始前，请准备：
1%甲基兰溶液。

试验步骤：
1.用无菌棉签刮取新鲜培养的细菌，溶于0.85%的NaCl溶液中，配制3.0麦氏
单位菌悬液。

2.分别吸取分型血清和1%甲基兰溶液各5µl于载玻片上充分混合。

3.在步骤2的混合液中添加5µl步骤1的菌悬液，混合均匀。

4.盖上盖玻片，室温下静置3min。

5.100x油镜下观察试验结果。

尽量在半小时内观察结果，勿要使两个玻璃片间
的液体干燥。

如果镜下观察：荚膜涨起可见（菌体自身肿胀）、菌体周围可见厚薄不等、边界清晰的无色环状物，为阳性试验结果。

将血清分型结果及时添加至Streptococcus pneumoniae isolates data bank。

利用荚膜肿胀法，采用丹麦Statens Serum Institut公司生产的Pneumotest Kit对肺
炎链球菌血清型/群进行鉴别，判定流程如下：。