PCR常见问题

镁离子浓度不当
总结词
镁离子是PCR反应的重要成分，对PCR的效率和产物质量有 重要影响。
详细描述
镁离子浓度过高可能导致非特异性扩增和产物稳定性下降； 镁离子浓度过低则可能影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失 败或扩增效率低下。因此，需要根据实验条件和试剂盒推荐 ，选择合适的镁离子浓度。
03
pcr问题对策
详细描述
模板质量的好坏直接影响到pcr的扩增 效果，因此需要确保模板的纯度和浓 度，避免使用降解严重的模板，以提 高pcr的产量和特异性。
优化pcr循环参数
总结词
pcr循环参数的优化可以显著提高pcr的效率和特异性。
详细描述
通过调整变性、退火、延伸等温度和时间，可以优化pcr循环参数，提高pcr的效率和特异性。同时， 合理设置预变性时间和循环数，可以有效避免非特异性扩增和产物积累。
优化引物设计
总结词
引物设计是pcr反应的关键，优化引物设计可以显著提高pcr的特异性和效率。
详细描述
引物设计时需考虑特异性、长度、GC含量、引物二聚体和发夹结构等因素，通过合理设计引物，可以避免非特 异性扩增和引物二聚体形成，提高pcr的特异性。
提高模板质量
总结词
模板质量对pcr结果的影响不容忽视， 提高模板质量可以提高pcr的产量和特 异性。
模板质量差
总结词
模板质量的好坏直接影响到PCR的效率和产物质量。
详细描述
模板中可能含有抑制剂、DNA聚合酶抑制剂或DNA聚合酶竞争性抑制剂等物质， 这些物质会影响DNA聚合酶的活性，导致PCR失败或扩增效率低下。此外，模 板的浓度过低或过高也可能影响PCR结果。
pcr循环参数不当
总结词
PCR循环参数包括变性、退火、延伸等步骤，这些步骤 的温度和时间设置对PCR结果有重要影响。

PCR检测常见问题与解决途径利用PCR方法检测转基因成分时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。

尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。

为了提高转基因检测的准确性和可靠性，PCR检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。

一个好的PCR方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性，尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。

本文对PCR检测中出现的假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的原因与其解决方法予以综述。

一、假阳性：（一）假阳性现象假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。

如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。

实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。

（二）造成假阳性的原因1. 样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；2. PCR试剂的污染：主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水与其它溶液被PCR核酸模板污染。

3. PCR扩增产物污染：这是PCR反应中最主要最常见的污染问题。

因为PCR产物拷贝量大(一般为1013拷贝/ml)，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。

4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时与污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。

据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。

5. 实验室中克隆质粒的污染：由于克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具与试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性与具有很强的生命力，其污染可能性也很大。

PCR反应常见问题汇总（转自tiangen）----PCR常见问题分析及对策1.PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

2.假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR 循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

⑤模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。

酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。

②引物的浓度不仅要看OD 值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。

1. 反应后反应管壁出现液滴？可能原因：运行程序前没有开启热盖加热功能解决方法：开启热盖加热功能可能原因：反应结束后低温保存时间过久解决方法：运行结束后，热盖将自动关闭，所以冷凝会自然出现，这不会对实验结果产生影响，将反应管置于离心机上瞬时离心使液滴回到管子底部即可。

2. 使用的微孔板，反应后反应液有明显蒸发？解决方法：确保使用高质量的微孔板，反应前要严格密封解决方法：确保盖紧热盖，适当提高热盖的温度解决方法：增大反应体积3. 使用PCR管，反应后部分PCR管内反应液有明显蒸发？解决方法：确保使用高质量的PCR管或使用我们推荐的PCR管解决方法：在样品台的四角放置四个同样的空PCR管，以保证热盖压在各PCR管上的压力均匀4. 为什么在不同型号的PCR仪上扩增出的条带亮度有差异？答：不同PCR仪所用的优化的升降温策略不同，所以当将在一类PCR仪上使用的PCR步骤参数转移到另一类PCR仪上时，要进行试验优化。

5. 在PCR实验结束后我的样品可以一直放在PCR仪中低温保存吗？答：但我们推荐当程序运行结束后，及时取出样品并停止仪器运行，而不要把仪器当“冰箱”使用。

低温保存时温度尽量设定的比较高，如8℃，这可以延长仪器的使用寿命。

6. 模拟管和样品台控温模式有什么差别？答：如果采用样品台控温模式，当样品台升降温到目标温度时，由于传热延迟，样品管内样品仍等待需要较长后的时间才能达到目标温度，所以当步骤时间不超过30s时，最好用模拟管控温模式；如果要用样品台控温模式，请将步骤时间延长一倍。

常见故障下面以PE480PCR仪为例，介绍PCR仪器使用过程中遇到的基本故障以及排除方法。

1．打开电源但是仪器不响应这种情况很可能是由于电源线脱落或者没有插紧而致，将电源线重新插入插座即可排除故障。

2．屏幕无显示且马达与风扇不启动这种情况很可能是总保险丝被熔断而造成的，更换保险丝即可排除故障，更换准确型号保险丝是所有用电仪器常见的故障排除办法，需要注意的是更换时一定要严格按照使用说明书来进行，或者邀请生产厂家维修工程师来完成。

.PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低.6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。

3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

原 因
1. 2. 3. 4. 5. 6.
引物特异性差 模板或引物浓度过高 酶量过多 对 2+浓度偏高 Mg 策 退火温度偏低 循环次数过多
1. 2. 3. 4. 5. 6.
重新设计引物或者使用巢 式PCR 适当降低模板或引物浓度 适当减少酶量 降低镁离子浓度 适当提高退火温度或使用 二阶段温度法 减少循环次数
伸时间太短
1. 纯化模板或者使用试剂盒提取 模板DNA DNA或加大模板的用量 模板DNA或加大模板的用量 更换Buffer Buffer或调整浓度 2. 更换Buffer或调整浓度 重新设计引物（ 3. 重新设计引物（避免链间二聚 体和链内二级结构）或者换一 体和链内二级结构） 管新引物 降低退火温度、 4. 降低退火温度、延长延伸时间
PCR MasterMix
原 理
预配好的PCR反应液
DNA聚合酶 聚合酶 反应缓冲液 dNTP PCR增强剂 增强剂
PCR Master Mix
特 点
快速简便 减少加样误差和污染 灵敏度高 可扩增低至2个拷贝的目的模板 可扩增低至2 特异性强 稳定性好 降低PCR反应的要求， 降低PCR反应的要求，增强特异性 PCR反应的要求 长期放置活性无改变
是除了好的引物设计之外， 热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性 最重要的方法之一。 最重要的方法之一。
策略之四
使用PCR增强剂
甲酰胺， 的增强剂。 甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当 ，甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。 的增强剂
其可能的机理是降低熔解温度， 其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅 助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。 聚合酶延伸通过二级结构区 增强剂浓度要适当

PCR常见问题分析及对策（无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性）问题1 :无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因：1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策：1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间M 样品样品正对照问题2:非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3:拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4:假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。

3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

荧光定量PCR常见问题
溶解曲线不止一个主峰：
引物设计不佳：设计特异性引物； 引物浓度不适：降低引物浓度； 退火温度低：调整退火温度；
镁离子浓度过高：降低镁离子浓度；
模板中有基因组污染：注意提取过程； 耗材仪器不匹配； 反应体系污染等：设置阳性阴性对照。
荧光定量PCR常见问题
扩增效率低：
提高PCR特异性最重要的方法之一。
策略之四使用PCR增强剂
甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜碱等 都可充当PCR的增强剂。 其可能的机理是降低熔解温度，从而 有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸 通过二级结构区。 增强剂浓度要适当。
荧光定量PCR常见问题
荧光定量PCR扩增效率确认： 相关系数（R2）：大于0.98 标准曲线斜率：-3~-3.5 PCR扩增效率（E）：0.9~1.2 重复性好：STD ＜0.2 特异性好
PCR常见问题、 原因分析及其对策
PCR技术简介 PCR常见问题、原因分析及其解决方案
提高PCR反应特异性的策略 定量PCR常见问题 临床PCR检测的常见问题
PCR标准反应体系
• DNA模板
• 引物
• 反应缓冲液 • Mg 2＋浓度 • dNTPs • dH2O • 耐热聚合酶
反应体系对PCR扩增的影响
PCR常见问题之四-----假阳性
现象：空白对照出现目的扩增产物
原 因
靶序列或扩增产物的交叉污染
对 策
• • 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪 内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材 均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应 一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。
现象：正对照有条带，而样品则无

Answer：1.引物设计不合适：扩增序列与非目的扩增序列有同源性，PCR也可扩增出非靶序列的序列；靶序列太短或引物太短，可导致假阳性。

此时需重新设计引物。

2.为了避免靶序列受到整个基因组或大片段的交叉污染，操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；除了酶及不能耐高温的物质外，所有试剂及器材应高温灭菌，所有离心管及加样枪头等均应一次性使用；必要时，加样前反应管和试剂均用紫外线照射，以破坏存在的核酸；3.为了避免靶基因受到空气中小片段核酸（与靶序列具有一定同源性）污染，可用巣式PCR方法减轻或消除。

Q2：PCR产物中出现假阴性或无扩增产物（即阳性对照中有条带，而样品则无条带）Answer:1.条带放置时间过久,核酸被降解，最好在48h内进行电泳检测。

2.DNA模板纯度低，如含有杂蛋白质或Taq酶抑制剂，可对DNA进行再次纯化或重新用优质试剂盒提取DNA; DNA浓度太低时，可以加大模板量；对具有二级结构DNA使用较好的聚合酶；提取DNA时，避免吸入酚类试剂。

3.对设计不合理的引物进行重新设计合成；引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融而降解失效；检测引物OD值并进行电泳检测以确保两条引物浓度一致。

4.酶失活时，更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

5.PCR反应条件：提高变性/退火温度；适当增加循环次数。

6.Mg2+浓度过低可影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败，而Mg2+浓度过高会降低PCR的特异性，因而可适当提高Mg2+浓度。

7.如果靶序列发生突变或缺失时，也会影响引物和模板的特异性结合，产生假阴性结果。

Q3：非特异性条带扩增或者条带出现拖尾现象Answer：1.当引物特异性差或引物形成二聚体时，可重新设计引物或者使用巣式PCR2.若模板或引物浓度过高，可适当降低模板或引物浓度3.酶量过多，则适当减少酶量4.Mg2+浓度偏高，则降低镁离子浓度5.退火温度偏低，适当提高退火温度或使用二阶段温度法（94℃变性，65℃左右退火与延伸）6.循环次数过多，不仅会降低扩增效率，且会使错误掺入率增加，因此需要减少循环次数。

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4℃过夜。
B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。
D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。
4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？
引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。

2.在 QuickStrip 中没有足够的样本
QuikStrip 已变干。
加入 40 μL 水，在装载前轻轻上下移液以混合均匀。
3.电泳凝胶上看不到条带、对照 DNA 和PCR 产物
凝胶未正确制备。
确保正确稀释电泳缓冲液。
融化琼脂糖时需要特别注意较高浓度 (>0.8%) 的凝胶。在倒入凝胶之前，确保溶液 没有“团块 ”和玻璃状颗粒，也可以直接使用配置好的预制胶。省时省力。
凝胶未正确染色。
染色时注意浓度，实在不行就重新染色。
电泳装置或电源出现故障。
请联系电泳仪或电泳设备供应商，帮忙排除故障
4.凝胶染色后，DNA 条带模糊。
凝胶没有染色足够长的时间。
严格按照染色流程说明进行实验操作。
5.染色后，条带可见，但不存在 PCR 产物。
PCR扩增不成功。
注意引物设计是否合理，DNA聚合酶的加入量是否适宜。
PCR实验中常见问题解决方法
PCR实验中常见问题及解决方案
PCR实验中常见问题汇总
问题，管中的液体较少。
样品挥发，损失
确保加热的盖子达到适当的温度。
吸取样本后，尽快盖上PCR 管的盖子。防止挥发。
移液不准确
确保吸取 20 µL 引物混合物和 5 µl Lambda DNA 模板到 PCR 管中。样本量少时需要采用高精度移液器。
确保PCR的正确操作，温度设计是否合理。
6.染色后，凝胶上可见条带和对照 PCR 产物，其中一部分样品不存在。
PCR 反应中添加了错误体积的 DNA 和引物。
熟练使用移液器进行精准移液定量，确保移液的准确度

PCR 常见问题及解决方案1没有扩展条带可能的原因及对应的解决方案如下：酶失活或在反应体系中未加入酶。

Taq DNA 聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。

模板含有杂质。

特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成DNA 脱嘌呤而影响PCR 的结果。

变性温度是否准确：PCR 仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。

反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加Taq 酶以前，将反应体系95℃加热5~10 分钟。

引物变质失效。

人工合成的引物是否正确。

是否纯化，或因储存条件不当而失活。

引物错误。

利用BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。

DNA 凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是DNA 凝胶和PCR 程序的问题。

2PCR 产物量过少可能的原因和对应的解决方案如下：退火温度不合适。

以 2 度为梯度设计梯度PCR 反应优化退火温度。

DNA 模板量太少。

增加DNA 模板量。

PCR 循环数不足。

增加反应循环数。

引物量不足。

增加体系中引物含量。

延伸时间太短。

以 1 kb/分钟的原则设置延伸时间。

变性时间过长。

变性时间过长会导致DNA 聚合酶失活。

DNA 模板中存在抑制剂。

确保DNA 模板干净3扩增产物跑电泳条带弥散可能的原因和对应的解决方案如下：酶量过高。

减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。

dNTP 浓度过高。

减少dNTP 的浓度。

MgCl₂浓度过高。

可适当降低其用量。

模板量过多。

质粒DNA 的用量应<50 ng，而基因组DNA 则应<200 ng。

引物浓度不够优化。

对引物进行梯度稀释重复PCR 反应。

循环次数过多；增加模板量减少循环次数至30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的PCR 循环。

退火温度过低。

电泳体系有问题：①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；②凝胶没有凝固好；③琼脂糖质量差。

若为PCR 试剂盒则可能：①由于运输储存不当引起试剂盒失效；②试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。

PCR常见问题及解决方法1)、不出现扩增条带a)、引物设计有误：核对引物设计方案。

b)、扩增体系配制错误：重复实验。

c)、扩增反应条件不优化：调整Mg2+浓度、酶量、扩增程序。

d)、模板质粒质量偏差：长期放置、反复冻融会导致模板质粒断裂、开环或降解，应使用新鲜制备的质粒作为模板。

e)、模板的GC含量：GC含量过高会导致DNA的双链无法完全打开，此时加入Vazyme（诺唯赞生物）的PCR Enhancer(货号P021)可以有效降低解链温度；GC 含量过低会导致扩增效率较差，可适当延长引物长度或通过TD PCR摸索合适的反应条件。

2)、出现非特异性扩增带a)、引物设计不够优化：引物与靶序列有非特异性互补或自身聚合成二聚体，可降低引物浓度进行优化，必要时重新设计引物。

b)、模板不纯：模板被污染，需重新制备模板。

c)、试验条件不够优化：如果出现比目的条带小的杂带，可通过提高退火温度、降低循环数调整；如果出现比目的条带大的杂带，可缩短延伸时间、降低循环数；另外，可降低Mg2+及酶的浓度。

3)、条带弥散或拖尾a)、模板降解或过量：可通过电泳检查模板完整性及浓度，必要时重新纯化模板，对于简单模板(例如质粒、λDNA)，每50ul反应使用1pg-10ng DNA；对于复杂模板(例如基因组、cDNA)，每50ul反应使用1ng-1ug DNA。

b)、酶量加太多：如Vazyme（诺唯赞生物）的高保真系列：50ul反应体系加1U，Taq系列：50ul体系加2U。

4)、条带很暗a)、增加模板量，提高循环数。

b)、多扩几管，胶回收浓缩。

5)、产物有错配a)、检查原始模板是否原本就是突变或错配的。

b)、少量序列存在非严谨序列，有相似重组序列，导致重组错位。

PCR常见问题汇总pcr常见问题汇总PCR介绍简单的说，PCR就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内(In Vitro) 的大量合成。

基本上它是利用DN A聚合酶进行专一性的连锁复制.目前常用的技术,可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。

PCR的要素基本的PCR须具备１.要被复制的DNA模板(Template) ２.界定复制范围两端的引物(Primers). ３.DNA聚合酶(Taq. Polymearse) 4.合成的原料及水。

PCR的反应包括三个主要步骤，分别是1). Denaturation 2). Anneali ng of primers, and 3). Extension of primers。

所谓Denaturing乃是将DNA加热变性，将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的模板. 而Annealing 则是令Primers 于一定的温度下附着于模板DNA两端。

最后在DNA聚合酶(e.g. Taq-polymerase) 的作用下进行引物的延长(Extension of primers)及另一股的合成。

PCR历史PCR的发展可以说是从DNA合成酵素的发现缘起。

DNA合成酵素最早于1955年发现(DNA polymerase I), 而较具有实验价值及可得性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现,但由于这个酵素是一种易被热所破坏之酵素, 因此不符合一连串的高温连锁反应所需。

现今所使用的酵素(简称Taq polymerase), 则是于1976年从热泉Hot spring中的细菌(Thermus Aquaticus) 分离出来的。

它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酵素，但它被广泛运用则于80年代之后。

PCR的原始雏形概念是类似基因修复复制(DNA repair replication)，它是于1971年由Dr. Kjell Kleppe 提出。

PCR跑胶，目的条带很亮，但是边沿不清楚，前后有拖尾现象，是什么原因？参考见解：1模板可能有降解，建议避免反复冻融，放置时间不能太长。

模板的质量是最重要的。

2抽提RNA时有污染，包括基因组DNA污染和蛋白质污染，需重做抽提。

3提高退火温度，减少非特异性扩增。

4减少循环次数，减少非特异性扩增。

5电泳缓冲液时间太长，ph值和盐离子浓度明显改变。

6电泳时电压不能太高，8V/cm。

7一般来讲，基于promega和T aKaRa的PCR反应体系中，Mg和dNTP的浓度是相匹配的，不需改动。

8 加样量过大。

过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。

9制胶过程中胶孔没制好。

10 EB没有冲洗干净。

11模板混有基因组DNA，或模板中混有蛋白。

12非特异反映。

引物设计的不好，非特异，这种情况容易出现非特异扩增造成有非特异性扩增带或拖尾现象。

13电泳液用久了不换，电泳胶脏了。

14扩增的条件不合适，一般退火温度低时容易使引物在非特异位置结合引发扩增反应造成拖尾。

针对以上情况，可以先提高退火温度试试，如果实在不行，再看看引物是不是合适。

如果内参可以扩出来，只能说明程序可能是适合的，但不能完全说明体系合适。

体系内的各组分，如模板、dNTP、Mg 离子、引物等都可能造成拖尾。

先得考虑换了那种成分后出现了拖尾，逐项试验。

引物当然是最重要的因素，但绝非造成拖尾的唯一原因。

而且，一般而言，拖尾不会是引物的问题，尤其是已经被用过证明能扩出特异片段的引物，更不可能是它的问题了。

先不要加T aq酶，等到其他东西都加完了以后，放到PCR仪上去，到那时再加，马上开启PCR程序试试。

检查一下你的dNTP的量够不够。

适当减少2～3个循环试试，可能会有效果。

PCR结果总是不满意，要注意些什么？参考见解：1将PCR反应的试管与反应板紧贴。

2当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。

PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低对策：1.重新设计引物或者使用巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离子浓度5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退火温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏高6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提高退火温度4.适量用酶5.适当降低dNTP和镁离子的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物原因：靶序列或扩增产物对策：1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。

所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。

3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。

寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

PCR常见问题及解决方案问题可能原因解决方法无产物或产量低模板浓度偏低或偏高电泳检测模板浓度,调整模板用量模板降解重新制备;基因组DNA、cDNA应小量分装后低温保存模板中含有抑制反应的杂质纯化模板引物浓度不足调整引物浓度,特别是针对长片段PCR引物存在二级结构重新设计引物,避免二级结构;优化退火温度引物降解引物应高浓度小量分装,-20℃保存,避免反复冻融Mg2+浓度偏低适当提高Mg2+浓度,从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增,针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度dNTP降解-20℃保存,小量分装,避免反复冻融酶纯度低,扩增效率差选用高质量DNA聚合酶酶量不足适当增加酶量用酶不当针对模板、目标片段的特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南)缓冲液失效更换缓冲液或使用预混PCR反应体系模板变性不充分适当延长变性时间;对高GC或复杂结构模板,提高起始变性温度至98℃退火温度偏高降低退火温度,应比引物Tm低至少5℃ 延伸时间不足增加延伸时间,特别是针对长片段PCR 循环数目不够增加循环数PCR管污染质量可靠的PCR管通常不需灭菌,否则应先高温高压灭菌处理;用过的PCR管不可清洗后重复使用PCR仪故障检查程序和模块温度其他使用PCR增强剂非特异产物过多,引物二聚体拖尾严重体系污染设计对照实验寻找污染源,操作时应注意避免交叉污染引物浓度过高适当减少引物浓度引物序列特异性差重新设计引物Mg2+浓度过高降低Mg2+浓度,从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增,针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度dNTP浓度过高降低dNTP浓度酶量过多减少酶量,以0.5 U间隔递减退火温度过低提高退火温度延伸时间过短增加延伸时间,以1 min间隔递增循环次数过多减少循环次数模板结构过于复杂或目标片段过长特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南);使用PCR增强剂其他HotStart PCRTouchDown PCR巢式PCR引物3’末端存在互补序列重新设计引物引物浓度过高降低引物浓度模板浓度过低提高模板浓度退火温度不合适优化退火温度循环次数过多减少循环次数其他HotStart PCR引物浓度过高调整引物浓度引物序列特异性差或模板上存在同源序列重新设计引物模板降解重新制备模板模板浓度过高降低模板浓度dNTP浓度过高减少dNTP用量Mg2+浓度过高降低Mg2+浓度,从1 mM到3 mM以0.5 mM间隔递增,针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度酶量过多或质量差减少酶量,以0.5 U间隔递减;更换质量可靠的酶变性温度过低提高变性温度,以0.5℃递增退火温度过低提高退火温度延伸时间过长缩短延伸时间循环次数过多减少循环次数,以2个循环间隔递减体系污染设计对照实验,消除污染源其他HotStart PCR TouchDown PCR 巢式PCR假阳性目标片段与非特异扩增片段间存在同源性设计阴性对照,确认为引物问题后重新设计引物体系污染设计阴性对照判断是否有污染,去除污染源。