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凝胶层析法(凝胶过滤)脱盐和分离蛋白质-1原理凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。
脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。
前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。
所以，要根据具体情况选择使用。
凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。
凝胶过滤（gel filtration），又称为凝胶层析（gel chromatograph y）、分子筛过滤（molecularsieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。
它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。
其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。
凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。
网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。
人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。
凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。
分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。
这样被分离物质即被按分子的大小分开。
用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品，主要有交联葡聚糖（商品名为Sephadex）、琼脂糖（商品名为Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio–gel）及具有一定网眼的细玻璃珠等和这些凝胶的衍生物。
血红蛋白的凝胶过滤植物098 原硕0901080808摘要：用凝胶过滤分离血红蛋白样品，理解凝胶过滤原理，熟悉凝胶过滤操作方法。
关键字：血红蛋白，凝胶过滤一、研究背景及目的：凝胶过滤（gel [filtration] chromatography ; gel filtration chromatography ; GFC）作为一种常用的分离过滤方法，是实验中的常用手段之一，具有它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果等优点。
在很多方面都有所应用：⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。
本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。
适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。
⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。
凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。
⑶测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。
测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。
⑷高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液所以理解其原理及应用方法也是很重要的，本实验通对血红蛋白采用凝胶过滤，理解凝胶过滤的基本原理，熟悉和掌握凝胶过滤的基本操作技术。
凝胶过滤色谱名词解释凝胶过滤色谱(gelselution column chromatographic technique)，是一种新型分离技术。
凝胶色谱柱以亲水性高分子凝胶为固定相，利用凝胶良好的吸附、分子筛特性及表面活性等特点将待分离组分吸附在固定相表面上。
凝胶可分为亲水性高分子凝胶与疏水性高分子凝胶，前者为大孔、多孔网状凝胶，后者为微孔、无定形网状凝胶，由于孔径不同，对流动相中不同极性物质有不同选择吸附力，可使极性或非极性物质实现分离。
当样品中混杂的组分经柱子传输至检测器时，样品中组分首先被凝胶中的疏水性成分所吸附，凝胶中的亲水性成分随后被流动相中的流动相携带通过凝胶颗粒间隙向检测器移动，并将其分离。
分析时将被测组分和内标一起加入到样品溶液中，样品中的待测组分会被凝胶中的亲水性成分所吸附，然后样品中被吸附的组分随着流动相向检测器移动，被内标识别并解吸下来，从而得到待测组分的含量。
凝胶过滤色谱的分离机理主要包括吸附和洗脱两个阶段。
吸附过程是在固定相表面发生的。
在这个过程中，柱中的溶剂可能会进入凝胶中，因此样品中的组分被吸附到凝胶颗粒的表面上。
这些固定相颗粒都有各自的孔隙结构，它们的表面积比较大，有利于吸附。
在凝胶吸附过程中，除了样品溶液本身的极性外，溶剂的极性也是吸附过程发生的必要条件。
同时，由于凝胶是高分子材料，因此在受到搅拌作用时，凝胶中会形成较大的内部和外部剪切应力场，这就有利于保证吸附过程的正常进行。
洗脱过程是当样品溶液通过凝胶柱后，由于凝胶的吸附作用，样品溶液中某些组分可能会留在凝胶上，从而影响了后续流动相的吸收，导致浓度信号减弱或消失，这就需要在适当的位置加入流动相把这些“逃逸”的组分重新吸引到柱子上来。
如果不考虑流动相的洗脱能力，则要求样品溶液中被吸附的组分具有较强的洗脱能力。
实际工作中，加入足够量的流动相将样品溶液洗脱下来，是保证仪器稳定运行的关键步骤之一。
所以，要达到好的分离效果，就要选择适合的流动相，且适宜的洗脱条件，但这还远远不够，还需要有好的柱设计，即凝胶色谱柱的理论模型。
gpc原理GPC原理是指凝胶过滤、离心沉淀和电泳分离这三种方法在蛋白质分离中的应用。
GPC即Gel Permeation Chromatography，又称为Gel Filtration Chromatography，中文名为凝胶渗透色谱法。
GPC是一种基于分子大小分离的液相层析技术，主要用于分离高分子化合物，如蛋白质、核酸、多糖等。
凝胶过滤色谱法是GPC原理中的第一步。
凝胶过滤色谱法是利用凝胶孔隙的分子筛作用，将样品中的大分子分离出来。
样品在溶剂中通过凝胶柱时，大分子无法通过凝胶的孔隙，只能在柱中停留，而小分子可以通过凝胶的孔隙流出柱外。
因此，通过凝胶过滤可以将不同分子大小的化合物分离开来。
离心沉淀是GPC原理中的第二步。
离心沉淀是将样品在离心的作用下分离出不同密度的组分。
样品在离心机中高速旋转时，分子按照不同的密度沉淀到离心管的不同位置，从而实现分离。
离心沉淀常用于分离细胞、细胞器和蛋白质等生物大分子。
电泳分离是GPC原理中的第三步。
电泳分离是利用电场的作用将样品中的化合物分离出来。
样品在电场中运动时，不同分子的运动速度不同，从而实现分离。
电泳分离可用于分离DNA、RNA、蛋白质等。
GPC原理可以应用于许多领域，如生物化学、药物研发、环境监测等。
在生物化学中，GPC可以用于蛋白质的分离纯化和质量检测；在药物研发中，GPC可以用于药物的分子量测定和药物的纯化；在环境监测中，GPC可以用于分离和检测污染物。
GPC原理是一种基于分子大小分离的液相层析技术，可以用于分离高分子化合物，如蛋白质、核酸、多糖等。
凝胶过滤、离心沉淀和电泳分离是GPC原理中的三种分离方法，可以分别应用于不同的领域。
GPC原理在生物化学、药物研发、环境监测等领域具有广泛的应用前景。
不同分子量蛋白质的分离――凝胶管柱层析法(gel filtration colu实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。
该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。
大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。
这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。
任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数 Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。
Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。
分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。
通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。
该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。
但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。
测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。
本实验使用血红蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－鱼精蛋白（DNP－鱼精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通过Sephadex G－25层析后达到分离。
凝胶过滤(gel filtration,GF)的应用1.生物大分子的纯化凝胶过滤是依据分子量的不同来进行分离的，由于它的这一分离特性，以及它具有简单、方便、不改变样品生物学活性等优点，使得凝胶过滤成为分离纯化生物大分子的一种重要手段，尤其是对于一些大小不同，但理化性质相似的分子，用其它方法较难分开，而凝胶过滤无疑是一种合适的方法。
例如对于不同聚合程度的多聚体的分离等。
2.分子量测定外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体积。
内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。
基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。
而柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。
洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。
设柱床体积为Vt，外水体积为Vo，内水体积为Vi，基质体积为Vg，则有：Vt＝Vo＋Vi＋Vg由于Vg相对很小，可以忽略不计，则有：Vt＝Vo＋Vi设洗脱体积为Ve，Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。
对于完全排阻的大分子，由于其不进入凝胶颗粒内部，而只存在于流动相中，故其洗脱体积Ve＝Vo；对于完全渗透的小分子，由于它可以存在于凝胶柱整个体积内（忽略凝胶本身体积Vg），故其洗脱体积Ve＝Vt。
分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。
在一定的范围内，各个组分的Kav以及Ve与其分子量的对数成线性关系。
Kav＝－b lg MW＋cVe＝－b’ lg MW＋c’由此通过对已知分子量的标准物质进行洗脱，作出Ve或Kav对分子量对数的标准曲线，然后在相同的条件下测定未知物的Ve或Kav，通过标准曲线即可求出其分子量。
凝胶过滤测定分子量操作比较简单，所需样品量也较少，是一种初步测定蛋白分子量的有效方法。
这种方法的缺点是测量结果的准确性受很多因素影响。
由于这种方法假定标准物和样品与凝胶都没有吸附作用，所以如果标准物或样品与凝胶有一定的吸附作用，那么测量的误差就会比较大；上面公式成立的条件是蛋白基本是球形的，对于一些纤维蛋白等细长的形状的蛋白不成立，所以凝胶过滤不能用于测定这类分子的分子量；另外由于糖的水合作用较强，所以用凝胶过滤测定糖蛋白时，测定的分子量偏大，而测定铁蛋白时则发现测定值偏小；还要注意的是标准蛋白和所测定的蛋白都要在凝胶过滤的线性范围之内。
提高凝胶过滤层析分辨率的方法概述摘要：凝胶过滤层析的分辨率高低关系到最后的样品纯度，提高分辨率可得到纯度更高的产物。
分辨率的高低与凝胶柱的选择、凝胶的种类、加样量、流速和洗脱液性质有关，在实验过程中，根据目的和要求综合考虑各因素。
【关键词】凝胶过滤层析；分辨率；流速Abstract：The sample purity is related to the resolution of the Gel filtration chromatography.Thus, to obtain a higher purity product, we need to improve the resolution. the selection of the gel column, the type of gel, the amount of pipetting, flow rate can effect the resolution. Consideration of various factors, during the experiment, according to the purpose and requirements.【Key words】Gel filtration chromatography; resolution; flow rate引言凝胶过滤层析法(gel filtration chromatography)也称分子筛层析法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的分子量进行分离和纯化1959年，Porath和Flodin第一次用凝胶过滤分离水溶液中不同分子量的样品。
凝胶凝胶过滤层析具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，因此广泛用于蛋白质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。
因此，凝胶层析广泛的应用于生物化学、高分子化学等方面。
