双抗夹心法-ELISA
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双抗夹心法ELISA（TAS-ELISA）
步骤： 1、准备可控温培养箱或摇床和样品。样品用液氮或研钵研磨碎，再用组织：1×GEB
缓冲液=1:10（g:ml）浓度液提取。
2、用碳酸盐包被缓冲液稀释一抗，稀释倍数为200倍。每孔加入稀释后的一抗100l。将加入一抗的酶标板用锡箔纸包裹，置于4℃下过夜或室温下放置4小时
或37℃下放置2小时。
3、一抗包被结束时，在水池中倒出剩余液体，用1×PBST洗4-5次，每次将酶
标板在吸水纸上用力拍一下以去除多余液体。
4、每孔加入100l事先处理好的样品，每批实验均需加入阳性对照和样品提取
液（GEB）。将加入样品的酶标板用锡箔纸包裹，置于4℃下过夜或室温下放置4小时或37℃下放置2小时。
5、样品包被时间结束时，在水池中快速倒出剩余样品液体，用1×PBST洗7次，
最后一次在吸水纸上用力拍一下以去除多余液体。在室温中放置5min，或用枪头吸尽孔中液体。
6、用ECI抗体稀释液稀释酶标二抗，稀释倍数为200倍。每孔加入稀释后的二
抗100l。将加入二抗的酶标板用锡箔纸包裹，置于4℃下过夜或室温下放置4小时或37℃下放置2小时。
7、二抗包被结束时，在水池中快速倒出剩余抗体，用1×PBST洗8次，最后一
次在吸水纸上用力拍一下以去除多余液体。在室温中放置5min，或用枪头吸尽孔中液体和气泡。
8、在二抗包被结束前15min中准备底物显色液。PNPP/1×PNP Buffer=1mg/ml的
浓度配制，避光保存。每孔加入底物100l。将加入底物的酶标板用锡箔纸包裹，置于37℃下孵育1小时。
9、显色30min时用肉眼观察显色结果，阳性孔应该显色，GEB孔应该无色。直
到显色1h时，阴性仍然无色就在酶标仪上测405nm处的OD值，求出阴性对照的OD值的值N，若样品OD值P≥2N，则视为阳性，否则为阴性。
试剂：
ID-ELISA试剂及缓冲液 ACD Agdia (1) 碳酸盐包被缓冲液（Coating buffer），pH 9.6 无水Na2CO3，Sodium carbonate（anhydrous） 1.60 1.59 g NaHCO3，Sodium bicarbonate 2.92 2.93 g 叠氮化钠，Sodium azide 0.2g 0.2g 加DDW定容至1000 mL，调整pH值至9.6，4°C保存 (2)冲洗缓冲液（Wash Buffer, 0.01MPBST） NaCl，Sodium chloride 8.0g 8.0 g KCl，Potassium chloride 0.2g 0.2 g 无水Na2HPO4，Sodium phosphate，dibasic（anhydrous） 1.15g 2.89 g 无水KH2PO4，Potassium phosphate，monobasic（anhydrous） 0.2g 0.2 g Tween-20 0.5ml 0.5ml 加DDW定容至1000 mL pH 7.3 pH 7.4 (3)抗体稀释缓冲液（ECI Buffer, PBST-PVP） PBST 1000 mL 1000 mL 牛血清白蛋白，Bovine serum albumin （BSA） 2.0g 2.0g PVP，Polyvinylpyrrolidone(PVP) MW 24-40000 10.0 20.0 叠氮化钠，Sodium azide 0.2g 0.2g 4°C保存 pH 7.3 pH 7.4 (4)碱性磷酸酶底物稀释缓冲液（PNP Buffer），pH 9.8 二乙醇胺，Diethanolamine 97.0mL 97.0 mL MgCl2，Magnesium chloride 0.1g 0.1g 叠氮化钠，Sodium azide 0.2g 0.2g 用800mLDDW溶解，用盐酸调pH值至9.8，用DDW定容至1000mL，4°C避光保存 (5)通用抽提缓冲液（General Extract Buffer） PBST 1000 mL 1000 mL 鸡卵清蛋白，Powdered egg（chicken）albumin,Grade Ⅱ 2.0g 2.0g 无水亚硫酸钠，Sodium sulfite（anhydrous） 1.3g 1.3g PVP，Polyvinylpyrrolidone(PVP) MW 24-40000 10.0 20.0 叠氮化钠，Sodium azide 0.2g 0.2g Tween-20 10.0g 10.0ml 4°C保存 pH7.3 pH 7.4
