ELISA双抗体夹心法—检测HBs

第1篇

一、实验目的

1. 掌握双抗体夹心法的基本原理和操作步骤。

2. 学习利用ELISA技术检测乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）。

3. 分析实验结果，验证实验方法的有效性和准确性。

二、实验原理

双抗体夹心法是一种常用的酶联免疫吸附试验（ELISA）方法，用于检测抗原。其基本原理是将抗原与抗体结合，形成抗原-抗体复合物，再加入酶标记的抗体，通过显色反应判断抗原含量。具体步骤如下：

1. 将已知抗体包被于固相载体上，形成固相抗体。

2. 加入待测标本，若标本中含有目标抗原，则与固相抗体结合，形成抗原-抗体复合物。

3. 洗涤去除未结合的标本。

4. 加入酶标记的抗体，该抗体能与抗原-抗体复合物中的抗原结合。

5. 再次洗涤去除未结合的酶标记抗体。

6. 加入底物，底物在酶的催化下发生颜色变化，颜色深浅与抗原含量成正比。

三、实验材料

1. 乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）标准品

2. 乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）单克隆抗体

3. 酶标记的二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体）

4. 酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒

5. 微孔板

6. 仪器：酶标仪、离心机、移液器等

四、实验步骤 1. 包被抗体：将乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）单克隆抗体稀释后，加入微孔板中，每孔100μl，37℃孵育过夜。

2. 洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液洗板3次，甩干。

3. 封闭：加入封闭液，每孔200μl，37℃孵育1小时。

4. 洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液洗板3次，甩干。

5. 加样：将待测标本、阳性对照、阴性对照和空白对照分别加入对应的孔中，每孔100μl，37℃孵育1小时。

6. 洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液洗板3次，甩干。

7. 加酶标记二抗：将酶标记的二抗稀释后，加入各孔中，每孔100μl，37℃孵育1小时。

8. 洗涤：弃去孔内液体，用洗涤液洗板3次，甩干。

9. 加底物：将底物A液和B液按比例混合，加入各孔中，每孔100μl，37℃孵育15分钟。

ELISA技术可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：

（1）固相化的抗原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；

（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；

（3）酶反应的底物。

根据试剂的来源和样本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。以下主要介绍几种公司常用的检测抗原的类型：

1、间接竞争法测抗原

样本中的待测药物和固相化的抗原共同竞争一定量的抗体，加入酶标记抗抗体（酶标二抗）后能与固相化的抗原抗体复合物特异性结合，经底物显色后检测，样本中药物含量愈高，竞争结合的抗体量愈多，从而结合在固相上的酶标记抗抗体（酶标二抗）量愈少，最后的显色也愈浅。本公司及国内产品多用此法。具体操作步骤如下：

1）抗原固相化：将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质。

2）加入标准品/样本，再加入抗体，保温反应。样本中药物与固相抗原同时竞争与特异性抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去游离物质及吸附在固相载体上结合不紧密的物质。

3）加酶标抗抗体，固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与样本中受检药物的量负相关。

4）加底物显色，固相上的酶催化底物成为有色产物。通过仪器检测分析，测知样本中抗原的量。

2、直接竞争法测抗原

（1）直接竞争酶标抗原法测抗原

样本中的待测药物和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，经底物显色后检测，样本中药物含量愈高，结合在固相上的酶标抗原量愈少，最后的显色也愈浅。

（2）直接竞争酶标抗体法测抗原

样本中的待测药物和固相抗原竞争结合一定量的酶标记抗体，经底物显色后检测，样本中药物含量愈高，结合在固相上的酶标抗体愈少，最后显色也愈浅。

直接竞争法具体操作步骤如下：

1）抗原（或抗体）的固相化：将特异性抗原（或抗体）与固相载体联结，形成固相抗原（或抗体），洗涤除去未结合的抗原（或抗体）及杂质。

对ELISA方法检测HBSAg结果的分析

当前国内临床检测乙型肝炎表面抗原(HBSAg)多采用ELISA双抗体夹心法，其基本原理是:1.将抗体包被在载体后作为固相，加入待测标本，使其中的相应抗原通过免疫学反应结合到固相抗体上，洗涤除去未结合的抗原。2.加入酶结合物与已结合在固相抗体上的抗原反应，并洗涤除去未结合的游离未结合物。3.加入酶（常用辣根过氧化物酶）的相应底物，固相化的酶催化底物反应生成有色产物。在一定温度下一定时间后终止反应，显色物的量与在固相上的抗原有关。该方法检测HBSAg时，影响的因素很多，有内源性物质和外源性物质两大类。血清是最常见的ELISA标本，大约有40%的人血清标本中含有类风湿因子，补体，嗜异性抗体，嗜靶抗原自身抗体等非特异性物质，对ELISA测定有干扰作用易造成假阳性或假阴性结果，这不是人为因素造成的。在临床检验工作中，常因标本量多，紧急要求出检验报告，较难逐个分析其内源性的物质，而忽略它的存在。而工作中，因血样的采集，储存及操作程序等不当所致的外源性物质的干扰，最易影响ELISA的测定结果。本文对检验工作中经常出现的如标本溶血，标本被细菌污染，标本储存过久，标本凝固不全等因素进行分析。

1.标本溶血

由于各种人为因素引起标本溶血，使红细胞溶解细胞内的过氧化物酶进入血浆，并大量吸附于细胞碎片及纤维蛋白原上,从而造成以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定中，非特异性显色，出现假阳性。有试验证明溶血标本HBSAg假阳性率达91.7%[1]。要认真做好标本的保存和处理工作，防止溶血。

2.标本受到污染

标本受细菌污染，因菌体中可能含有内源性辣根过氧化物酶同样易产生非特异性显色，出现假阳性。

3.标本放置时间

在冰箱中保存过久的标本，血清中IGg可聚合成多聚体，AFP可形成二聚体，在ELISA测定中会导致本底过深，甚至造成假阳性。采血后若不在当天检测，应置于2-8℃冰箱中，若要储存，则置于-20℃低温冰箱内保存。

实验三 双抗夹心ELISA法检测IL-1

白细胞介素-1（IL-1）是一种单核因子，主要由单核细胞-巨噬细胞、上皮细胞以及树突状细胞分泌。它可以促进多种细胞增殖和活化，对免疫应答有重要的调节作用，也被称为淋巴细胞激活因子或内源性热原质等。本实验采用双抗加薪ELISA法检测人血清中的IL-1浓度，将标准品、待测样本加入到预先包被人IL-1单克隆抗体的酶标板中，洗涤除去未结合的成分，再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗人IL-1抗体，它将与人IL-1结合而形成免疫复合物，最后加入底物（OPD）显色，其颜色深浅（450nm波长下测定OD值）与样品中人IL-1浓度呈正相关。

【试剂与器材】

预包被的酶标板，HRP标记的抗人IL-1抗体、重组IL-1标准品、待检样品、样品稀释液；洗涤液、显色液（含底物及酶反应体系）、终止液；37度恒温水浴锅、酶标仪、微量加样器、一次性吸头、吸水纸等。

【方法】

1、吸取包被抗体加入凹孔板中，每孔200微升，将凹孔板置于湿盒中，与37度作用1-2个小时候，再置40度冰箱过夜，从冰箱取出凹孔板，帅弃孔中液体，注满洗涤液、甩干，如此重复3次，拍干备用。

2、加标准品和待测样本：分别设置标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，标准品孔中加入标准品50微升，待测样本孔中加入血清10微升，再加样本稀释液40微升，空白对照孔。。。标准稀释液，加入相应试剂200微升/孔。

3、37度中作用45分钟。

4、洗板：弃去板内液体，每孔加满洗涤液，静置1分钟，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，重复洗版3次。

5、加酶标抗体：每孔加200微升

6、37度水浴锅温育20分钟

7、洗版：弃去。。。重复3次

8、显色：每孔加200微升显色液，37度避光显色15分钟。

9、终止：取出酶标板，每孔加终止液500微升

10、测定：以空白孔调零，在终止后30分钟内，在450nm波长处测量各孔的吸光值（OD）

【结果】