分离纯化蛋白质的方法及原理
（一）利用分子大小
1、透析：原理：利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。
方法：将待提纯蛋白质放在透析袋中放在蒸馏水中进行
涉及的问题：
如何加快透析过程
（1） 加大浓度差，及时更换透析液
（2） 利用磁力搅拌器
常用的半透膜：玻璃纸、火棉和其他材料合成
2、超过滤：原理：利用压力和离心力，强行使其他小分子和水通过半透膜，而蛋白质留在膜上
3、凝胶过滤层析：原理：当不同分子大小的蛋白质混合物流进凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构，排阻在凝胶珠以外，在凝胶珠缝隙间隙中向下移动。而比孔小的分子不同程度地进入凝胶珠内，这样由于不同大小分子所经历的路径不同而到分离。
结果：大分子先被洗脱下来，小分子后被洗脱下来
（二）利用溶解度差别
4、等电点沉淀：原理：不同蛋白质具有不同的等电点，当蛋白质混合物调到其中一种蛋白质的等电点时，这种蛋白质大部分和全部被沉淀下来.。
5、盐析与盐溶 ：原理：低浓度时，中性盐可以增加蛋白质溶解度这种现象称为盐溶.当离子强度增加，足够高时，例如饱和或半饱和程度，很多蛋白质可以从水中沉淀出来，这种现象称为盐析
（三）根据电荷不同
6、SDS-PAGE 全称 十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳
原理：通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也解离为单亚基，处理后的样品中肽链是处于无二硫键连接的，分离的状态。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。
7、离子交换层析：原理：氨基酸分离常用阳离子交换树脂，树脂被处理成钠型，将混合氨基酸上柱，氨基酸主要以阳离子形式存在，在树脂上与钠离子发生交换，而被挂在树脂上。
氨基酸在树脂上结合的牢固程度取决于氨基酸与树脂之间的亲和力，决定亲和力的因素有：（1）主要是静电吸引力 （2）氨基酸侧链同树脂之间的疏水作用
蛋白质的分离纯化
1.溶菌酶活性的测定
采用浊度法,用60mmol／L、pH6．2的磷酸缓冲液配制一定浊度0450--0．6"-'0．7)的溶壁微球菌(Micrococcus Lysodleikticus)为底物，取0．1mL酶液加入2．5mL底物(20℃)中，在波长450nm处读取反应体系3minl勾每隔1 5s的吸光度。以△彳45dmin变化0．001个吸光度值为一个活性单位。
酶活力=△450nm／lminx0．001 x0．1mL
式中：△450nm--lmin内吸光度的变化
2.阴离子交换柱纯化蛋白是看缓冲液中的盐离子浓度的，PH7.4只是作为缓冲保证蛋白活性的，你用阴离子交换柱要用盐梯度来洗脱，一般都是氯化钠，从0摩尔开始，逐渐增加盐的浓度，上限不定
3.上样过程是这样的，首先是样品上柱，这时候目的蛋白和一部分杂蛋白都会傍柱的，这时候出来的是FlowThrough里面应该有不上柱的杂蛋白，接下来在用无盐buffer冲洗一定的柱体积，会冲洗出一定量结合不牢固的蛋白，然后再用含盐的buffer洗脱，这一步要逐渐增加盐的浓度，可以拉线性也可以走梯度，一般不会直接用1摩尔的盐洗脱，应为1摩尔的盐基本上能洗脱阴离子柱上所有的蛋白了。
4.作酶的纯化时，每一部分，包括穿透峰，都应该做酶活测定，因为在事先是不能肯定需要纯化的蛋白是否就一定挂上柱了，只有当确定了目的蛋白对某种柱子的结合之后，确定穿透峰里面没有目的蛋白，才可以不用测定活性。否则就可能带来损失。
5.【1】分离胶的浓度和最佳分离范围：
（1）SDS-PAGE分离胶浓度 －－－ 最佳分离范围 （KD)
6%胶 －－－－ －－－－－－－－50-150
8%胶 －－－－ －－－－－－－－30-90
10%胶 －－－－－－－－－－－－20-80
12%胶 －－－－－－－－－－－－10－40
（2）分离胶浓度（％） －－－ 线性分离范围（KD)
蛋白质的分离纯化方法
蛋白质的分离纯化主要包括“前处理”，“粗分级”，“细分级”三个步骤，本文主要讲述“细分级”，即粗提的蛋白质分离纯化的方法。
蛋白质的分离纯化方法根据蛋白质不同的生理特性有不同的方法分类，主要根据以下几个性质来设计纯化方法：
一、 根据分子大小不同分离纯化：
蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同，因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开，并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。
1、透析和渗滤：
主要利用半透膜
透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中，再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜，而蛋白质被截留在半透膜上的过程。
这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用，在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中，滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果。
2、离心
离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如，在从大米渣中提取蛋白质的实验中，加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后，再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离。
3、凝胶过滤
凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。
凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外，随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外；反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。
二、 根据溶解度不同分离纯化
gst融合蛋白的分离和纯化的原理
第一步，细胞裂解。通常使用化学方法、物理方法或超声波等手段将目标蛋白所在的表达系统的细胞破碎，使蛋白从细胞溶液提取出来。常用的细胞裂解方法有冻融法、超声波法和高压法等。
第二步，亲和层析。利用GST融合蛋白在蛋白A/G琼脂糖或S-蛋白琼脂糖柱上与谷胱甘肽硫转移酶（GST）结合的特性，将目标蛋白与其他非特异性蛋白分离。在这一步骤中，首先需要将裂解液与亲和层析树脂（例如：GST树脂）充分混合，使GST融合蛋白与亲和树脂结合；然后通过洗涤步骤，去除非特异性蛋白质的结合；最后，目标蛋白与亲和树脂的结合被破坏，并将其洗脱出来。
第三步，洗脱。通过改变亲和层析树脂的pH值、离子浓度或添加特定试剂，破坏GST融合蛋白与亲和树脂的结合，实现目标蛋白从树脂上的洗脱。常用的洗脱方法有酸洗脱、碱洗脱和还原洗脱。
第四步，纯化。将洗脱的目标蛋白进行进一步的分离和纯化。通常，还需要使用其他纯化方法，例如离心、电泳、层析等，进一步净化目标蛋白。
总的来说，GST融合蛋白的分离和纯化的原理是通过利用GST融合蛋白与亲和树脂之间的特异性结合，将目标蛋白与非特异性蛋白分离，然后通过改变条件破坏结合并将目标蛋白洗脱，最后进行进一步的纯化步骤，得到纯化后的目标蛋白。这种方法具有简单、快速、高效的优点，在蛋白质分离和纯化的研究中得到广泛应用。
