高效液相色谱法测定椰油酰基谷氨酸钠中的月桂酰基谷氨酸含量李忠军;黄芳;吴惠勤;孟巨光【摘要】建立了高效液相色谱法(HPLC)测定表面活性剂椰油酰基谷氨酸及其钠盐中月桂酰基谷氨酸含量以及不同碳链酰基谷氨酸相对含量的分析方法.采用甲醇作溶剂,涡旋混合器溶解样品,经Agilent TC-C18(250 mm ×4.6 mm×5 μm)色谱柱分离,以乙腈-0.002 mol/L硫酸水溶液为流动相,梯度洗脱,用紫外检测器在203 nm 处检测.该方法的线性范围为0.050～ 2.0 mg/mL,检出限(S/N =3)为0.015mg/mL,回收率为92.0％～101％.方法快速、准确、重现性好,可用于不同质量椰油酰基谷氨酸及其盐的测定,为此类原料的质量控制提供了有效的技术参考.【期刊名称】《分析测试学报》【年(卷),期】2016(035)001【总页数】4页(P111-114)【关键词】高效液相色谱法;椰油酰基谷氨酸;月桂酰基谷氨酸【作者】李忠军;黄芳;吴惠勤;孟巨光【作者单位】广东食品药品职业学院,广东广州510520;中国广州分析测试中心,广东广州510070;中国广州分析测试中心,广东广州510070;广州星业科技股份有限公司,广东广州511356【正文语种】中文【中图分类】O657.72;TQ423椰油酰基谷氨酸及其盐(结构式见图1)是近年来研究较多、发展较快的一类重要的表面活性剂[1]。
其酰基部分可由单一或天然脂肪酸引入，谷氨基酸分子中的氨基电性被中和，酰化的氨基酸盐属阴离子表面活性剂[2-3]，脂肪酸可以为月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸等[4]。
氨基酸型表面活性剂不仅安全性高，对头发和皮肤作用温和，刺激性小，低毒，生物降解性能好[5-6]，而且可与十二烷基磷酸酯钾(MAP-K)、椰油酰基丙基甜菜碱(CAB)、聚氧乙烯十二烷基磷酸酯钾(AEP)、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯钠(铵)(AES(A))、月桂醇硫酸酯钠(铵)(K12(A))、烷基糖苷(APG)等表面活性剂协同复配，具有良好的抑菌性能和杀菌性能[7]。
椰油酰基氨基酸型表面活性剂不仅具有优良的表面活性，而且具有良好的生物相容性和生物降解性[8]。
由于氨基酸是维持正常生命活动的重要物质，参与了生物体内蛋白质的合成及各种代谢过程，是构成生命物质的最基本单位，而脂肪酸也是生物体内不可缺少的物质。
因此，酰基氨基酸及其盐降解产物具有较好的生物安全性，对各种动植物无毒副作用。
酰基氨基酸型表面活性剂具有良好的润湿性、起泡性、去污性能、抗菌性以及抗蚀、抗静电能力[9-11]，几乎无毒无害，对皮肤温和，被广泛应用于洗涤剂、化妆品、食品、饮料、医药卫生、矿物浮选、石油燃料、机械工业、纺织印染、农药调配等领域[12-15]。
随着椰油酰基谷氨酸钠作为日化原料的用途越来越广，其市场需求日益增大，原料真假及质量好坏的鉴别显得尤其重要。
目前尚无对于该物质直接定性定量分析的相关报道。
现有方法只能通过将原料与三氟化硼发生酯交换反应后间接测定原料中的脂肪酸组成[16]。
本文首次建立了高效液相色谱法直接测定椰油酰基谷氨酸及其盐中月桂酰谷氨酸含量的方法，并对色谱条件进行优化，从而为椰油酰基谷氨酸盐类物质的质量控制提供了有力的参考。
1.1 仪器与试剂HP1100高效液相色谱仪带可变波长紫外检测器(美国Agilent公司);Milli-Q 超纯水纯化系统( 美国Millipore 公司)；涡旋混合器(江苏健康医药公司) ；SK2510HLC超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；分析天平(感量为0.1 mg，赛多力斯(北京) 科学有限公司)。
甲醇、乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；硫酸(分析纯，广州化学试剂厂)；月桂酰基谷氨酸钠对照品(CAS号：29923-31-7)由广州星业科技股份有限公司提供，样品由不同厂家送检。
1.2 标准溶液的配制精密称取月桂酰基谷氨酸钠标准品0.100 g，用甲醇溶解并定容至50 mL，得到浓度为2.0 mg/mL 的标准储备溶液，测定时稀释成浓度为0.010，0.050，0.10，0.50，1.0，2.0 mg/mL的系列标准溶液。
1.3 样品溶液配制取样品混合均匀(颗粒状的样品磨碎后取样)，准确称取0.05 g样品，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇约40 mL，涡旋混合器混合溶解，可采用超声或加热助溶，用甲醇定容，经0.45 μm聚四氟乙烯(PTFE)滤膜过滤，转入进样小瓶中，供高效液相色谱分析用。
1.4 色谱条件色谱柱：Agilent TC C18液相色谱柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm)。
流动相：A为乙腈，B为0.002 mol/L硫酸水溶液。
梯度洗脱条件:0~15 min，40%~100%B；15~16 min，100%~40%B；16~22 min，40%B。
流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：203 nm；进样体积：10 μL。
1.5 定性定量方法测定月桂酰基谷氨酸单一组分，根据被测溶液与标准溶液的保留时间定性，峰面积外标法定量；测定不同碳链酰基谷氨酸的相对含量，采用面积归一化法定量。
2.1 紫外吸收波长的选择椰油酰基谷氨酸钠分子结构中的O键含有未共用电子对，能产生n-π跃迁，由于跃迁时的能量较低，在近紫外区出现吸收，所以只能采用近紫外吸收波长检测。
通过紫外分光光度仪对椰油酰基谷氨酸钠对照品进行波长扫描(190~400 nm)，考察其波长扫描图谱情况,得到其最大吸收波长在203 nm处，因此方法采用203 nm作为检测波长。
2.2 流动相的选择由于目标物检测波长只能用近紫外的203 nm，而在此波长处多数流动相会有吸收，因此在选择流动相时更需要选择近紫外区吸收小的溶剂，反相色谱流动相一般是甲醇和乙腈，乙腈相较甲醇具有更短的吸收波长，所以有机相选择乙腈；椰油酰基谷氨酸钠属于阳离子表面活性剂，在反相柱上的吸附较强，为了避免拖尾严重，考虑采用酸性缓冲盐体系。
由于乙酸、乙酸盐、磷酸和磷酸盐在近紫外区有吸收，作流动相时会导致基线本底高，从而难以检测到目标物。
硫酸是一种强酸，只需加入极少量即可得到低pH值的酸性流动相，因此考察了添加0.01，0.005，0.002mol/L的硫酸溶液时流动相的分离效果，发现均能得到理想的色谱峰，只是保留时间稍有不同，酸性越强保留越强，但硫酸溶液浓度越高，pH值越低，对色谱柱的寿命影响越大，因此，最终选择0.002 mol/L的硫酸水溶液为流动相。
实验还考察了恒流动相洗脱和梯度洗脱时月桂酰基谷氨酸标准溶液的分离效果，结果显示，恒流洗脱得到的色谱峰有拖尾现象，而采用梯度洗脱可得到理想色谱峰(图2A)，此时的理论塔板数达到18 000，拖尾因子为0.88。
样品溶液的色谱图如图2B，不同碳链的脂肪酰基谷氨酸达到理想分离且呈现有规律的分布，从图中可推断保留时间分别在5.76，8.27，11.1，14.2 min的色谱峰依次为不同碳链(C8/C10/C12/C14)脂肪酰基谷氨酸，采用面积归一化法计算各成分的相对含量。
2.3 线性范围、检出限及定量下限将上述月桂酰基谷氨酸标准储备液逐步稀释，得到浓度分别为2.0，1.0，0.50，0.25,0.10，0.050 mg/mL 的系列标准溶液，进样测定，以溶液浓度(C，mg/mL)为纵坐标，峰面积(A)为横坐标绘制标准曲线。
两者在0.050~2.0 mg/mL范围内线性关系良好，线性方程为A=0.906C+0.055 1，相关系数(r)为0.999 2。
以信噪比(S/N)≥3 时的浓度作为检出限，得到月桂酰基谷氨酸的检出限为0.015 mg/mL，以S/N≥10 时的浓度作为定量下限，得到定量下限为0.045 mg/mL。
2.4 回收率与重复性在椰油酰基谷氨酸样品中加入低、中、高3个不同浓度水平的月桂酰基谷氨酸对照品，按照上述方法处理样品并测定含量，每个水平测定6 次，计算其加标回收率及相对标准偏差(RSD)，结果见表1。
加标回收率为92.0%~101%，RSD均小于3%，可见该方法回收率高、重复性好。
(续表1)2.5 实际样品分析按照所建立的方法对不同厂家委托送样进行检测，有代表性地选择了A、B、C 3家样品进行检测，发现3个不同厂家的月桂酰基谷氨酸钠含量各有不同。
其中A为31.5%，B为33.0%，C为60.2%；同时发现，样品A和B中除了含有月桂酰基谷氨酸外，还含有辛酰基谷氨酸、癸酰基谷氨酸和十四烷酰基谷氨酸，而样品C 中只含有月桂酰基谷氨酸。
A样中不同碳链组成的归一化含量见表2，月桂酰基谷氨酸的相对含量为60.8%。
由此可见此类产品的质量有差别，且椰油酰基谷氨酸的纯度均有待提高。
3 结论本文首次建立了测定表面活性剂椰油酰基谷氨酸钠中月桂酰基谷氨酸的含量以及不同碳链酰基谷氨酸相对含量的高效液相色谱法，优化得到的最佳色谱条件为：Agilent TC C18液相色谱柱，柱温30 ℃，流动相为乙腈-水(含0.002 mol/L硫酸)梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，进样体积10 μL，检测波长203 nm。
本方法解决了不同质量的椰油酰基谷氨酸及其盐含量的测定问题，为此类原料的质量判断提供了参考。
Determination of Lauroyl Glutamate Content in Coconut Oleoyl Glutamate by High Performance Liquid ChromatographyLI Zhong-jun1*，HUANG Fang2，WU Hui-qin2，MENG Ju-guang3(1.Guangdong Food and Drug Vocational College,Guangzhou510520,China；2.China National Analytical Center(Guangzhou)，Guangzhou 510070，China;3.Guangzhou Startec Science & TechnologyCo.,Ltd.,Guangzhou 511356,China)Abstract：A high performance liquid chromatographic(HPLC) method was developed to detect the content of lauroyl glutamate in coconut oleoyl glutamate surfactant and its sodium salts.The sample was dissolved with methanol in vortex mixer，and separated on an Agilent TC-C18(250mm×4.6 mm×5 μm) column using acetonitrile-0.002 mmol/L H2SO4 as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 203 nm;The injection volume was 10 μL.Under the optimal conditions,the calibration curve was linear in the range of 0.050-2.0 mg/mL with a detection limit(S/N=3) of 0.015 mg/mL.The recoveries were between 92.0% and 101%.With the advantages of accurancy,rapidness and good reproducibility,this method is suitable for the determination ofcocoyl glutamate acid in different quality of fatty acids,and provides an effective reference for the quality control of this surfactants.Key words：high performance liquid chromatography(HPLC)；cocoyl glutamate acid；lauroyl glutamate中图分类号：O657.72；TQ423文献标识码:A文章编号：1004-4957(2016)01-0111-04doi：10.3969/j.issn.1004-4957.2016.01.019通讯作者：*李忠军，硕士,副教授,研究方向：精细化工的分析检测研究，Tel：************，E-mail：*****************基金项目：广东省自然科学基金资助项目(S2012010009816)；广东省科技特派员专项资助收稿日期：2015-06-12；修回日期：2015-07-29本文首次建立了测定表面活性剂椰油酰基谷氨酸钠中月桂酰基谷氨酸的含量以及不同碳链酰基谷氨酸相对含量的高效液相色谱法，优化得到的最佳色谱条件为：Agilent TC C18液相色谱柱，柱温30 ℃，流动相为乙腈-水(含0.002 mol/L硫酸)梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，进样体积10 μL，检测波长203 nm。
