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1．阐述你对基因概念的理解和诠释。
基因是编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的遗传信息的基本单位，是染色体或基因组的一段DNA序列（对以RNA作为遗传信息载体的ＲＮＡ病毒而言则是ＲＮＡ），包活编码序列（外显子）、编码区前后对于基因表达具有调控功能的序列和单个编码序列间的间隔序列（内含子）。
基因是生物体传递和表达遗传信息的基本单位，基因通过复制把遗传信息传递给下一代，使后代出现与亲代相似的性状。
１）染色体水平上的基因概念：孟德尔的豌豆杂交试验总结出生物的遗传性状是由遗传因子控制的，肯定遗传的物质性。
基因一词由丹麦生物学家约翰逊提出。
著名遗传学家摩尔根对基因做出定义：基因在染色体上呈直线排列，基因是遗传物质的基因单位和突变单位，基因是控制性状的功能单位，它能产生对立的表现型，这意味基因是染色体上的一个特定区域。
２）代谢水平上的基因概念：比德尔和塔特姆提出“一个基因一个酶”学说，只适用于同源多聚体构成的酶类。
本柔进行了经典的基因精细结构分析，将比德尔提出的学说发展为“一个基因一条多肽链”的概念，把遗传功能单位称为顺反子。
3）DNA分子水平的基因概念：Avery的细菌转化实验中指出：携带遗传信息的是DNA而非蛋白质，Hershey和Chase对T4噬菌体感染大肠杆菌证实遗传的分子基础是核酸，Waltson和Crick提出DNA 双螺旋结构模型，从分子水平揭示了基因的结构。
Blake进一步提出可能每一个外显子相当于蛋白质的一个结构单位，“一个外显子，一个结构域”的精细表达。
分子生物学的发展进一步扩展了基因的概念，证明了基因不仅可以重叠，而且可被分离，有的基因并不被转录或不完全转录，而作为一个单位转录的也往往不是一个基因。
以前认为基因是在染色体上成直线排列的独立单元，现已发现一些相关的基因在染色体上的排列并不是随意的，而是由相关功能的基因构成一个小的“家族”或基因群。
随分子水平上基因结构与功能的研究，发现了移动基因、断裂基因、假基因、重叠基因等。
利用生物大数据技术分析转录因子结合位点的步骤说明在利用生物大数据技术分析转录因子结合位点的步骤中，首先需要了解转录因子及其结合位点的基本概念。
转录因子是一类调控基因表达的蛋白质，通过结合到DNA上的特定区域，即转录因子结合位点，来调控基因的转录活性。
通过分析转录因子的结合位点，可以揭示基因调控网络的组成和功能，进而深入了解生物过程中的细节及其相互关系。
接下来，将介绍利用生物大数据技术分析转录因子结合位点的步骤说明，包括获取转录因子结合位点数据、数据预处理、位点注释、转录因子结合位点的富集分析等。
第一步，获取转录因子结合位点数据。
生物数据库，如Encode、JASPAR、TRANSFAC等提供了大量的转录因子结合位点数据，可以通过这些数据库获取所需要的数据。
此外，还可以通过ChIP-seq、DNase-seq等高通量测序技术获得转录因子结合位点数据。
第二步，数据预处理。
由于生物大数据往往具有较高的维度和复杂性，处理这些数据的第一步是进行预处理。
预处理过程包括数据清洗、数据格式转换、数据质量评估等，目的是排除噪声和不可靠的数据，保留高质量的转录因子结合位点数据。
第三步，位点注释。
位点注释是将转录因子结合位点与基因组中的基因、剪接变异、启动子区域等进行关联，以了解这些位点的功能和可能的调控机制。
常用的位点注释工具包括Homer、BEDTools等，它们可以根据对应的基因组信息进行注释分析。
第四步，转录因子结合位点的富集分析。
富集分析是用来判断一组结合位点是否在某些功能上过于聚集或分散。
常见的富集分析方法包括基于超几何分布的富集分析和基于基因集合比较的富集分析。
这些方法可以帮助研究人员发现与特定生物过程或疾病相关的转录因子结合位点。
此外，还可以进行转录因子结合位点共现网络的构建。
共现网络分析可以帮助研究人员揭示转录因子之间的相互作用关系，进一步理解转录调控网络的复杂特性。
在进行以上步骤时，需要借助生物信息学工具和编程语言进行数据处理和分析。
鉴定转录因子与启动子结合的方法和原理引言：转录因子是一类调控基因表达的蛋白质，它们通过与启动子区域结合来激活或抑制基因的转录。
因此，鉴定转录因子与启动子结合的方法和原理对于深入理解基因调控网络具有重要意义。
本文将介绍常用的鉴定转录因子与启动子结合的方法和原理。
一、电泳迁移实验(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)电泳迁移实验是一种常用的体外鉴定转录因子与启动子结合的方法。
该方法基于转录因子与启动子结合后形成的复合物在凝胶电泳中迁移速度较慢的原理。
具体步骤如下：1. 提取转录因子：从细胞中提取转录因子，通常采用细胞裂解和柱层析等技术。
2. 标记启动子：利用放射性同位素或荧光标记技术标记待测启动子。
3. 结合反应：将提取的转录因子与标记的启动子进行体外结合反应。
4. 凝胶电泳：将反应体系经过凝胶电泳，根据转录因子与启动子结合后形成的复合物迁移速度的不同，可以观察到不同的带状图谱。
通过比较不同样品的带状图谱，可以确定转录因子与启动子的结合情况。
二、染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)染色质免疫沉淀是一种常用的体内鉴定转录因子与启动子结合的方法。
该方法基于转录因子与启动子结合后形成的复合物可以通过抗体与染色质一起沉淀下来的原理。
具体步骤如下：1. 交联染色质：将细胞或组织中的染色质与蛋白质交联，使其处于稳定的状态。
2. 染色质免疫沉淀：利用特异性抗体选择性地沉淀下转录因子与启动子结合的复合物。
3. 蛋白质解交联：将沉淀下来的复合物中的蛋白质与染色质解交联。
4. 提取DNA：提取解交联后的染色质DNA，并进行PCR扩增或测序等分析。
通过分析PCR扩增产物或测序结果，可以确定转录因子与启动子的结合位点和强度。
三、质谱分析(Mass spectrometry, MS)质谱分析是一种常用的鉴定转录因子与启动子结合的方法。
专利名称：含MyoDI基因启动子片段的重组质粒的构建方法专利类型：发明专利
发明人：许厚强,桓聪聪,陈伟,赵佳福,张雯,周迪
申请号：CN201410383229.8
申请日：20140806
公开号：CN104131019A
公开日：
20141105
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种含MyoDI基因启动子片段的重组质粒的构建方法，本发明采用4对5'端加磷的引物扩增不同长度的MyoDI基因启动子片段，与用高保真DNA聚合酶扩增出的不含启动子区的pEGFP-N3载体片段进行平末端连接，构建重组质粒。
这种方法简便精确获得重组载体，与双酶切的方法比较具有不受酶切位点限制的优势，同时也不引入新的酶切位点，使实验结果更加符合单一变量的要求，实验结果更加可信。
申请人：贵州大学
地址：550025 贵州省贵阳市花溪区贵州大学北校区科学技术处
国籍：CN
代理机构：贵阳中新专利商标事务所
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畜牧兽医学报 2023,54(9):3689-3699A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i c ad o i :10.11843/j.i s s n .0366-6964.2023.09.010开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):牛C A R T 基因核心启动子鉴定及转录调控分析王栋梁1,任 静2,郝琴琴2,李鹏飞2*(1.朔州职业技术学院,朔州036002;2.山西农业大学生命科学学院,太谷030801)摘 要:旨在筛选牛C A R T 基因核心启动子区并鉴定调控C A R T 表达的转录因子,探究其转录调控机制㊂本研究采集3头健康母牛下丘脑组织,提取基因组D N A ,通过P C R 扩增㊁测序获得牛C A R T 启动子序列,E M B O S S ㊁M e t h P r i m e r ㊁N e w P L A C E 数据库分析启动子结构特征;构建4个包含不同截短长度的C A R T 启动子报告基因载体,双荧光素酶报告基因活性检测鉴定核心启动子区;应用D N A p u l l d o w n 结合质谱分析(n =3),功能聚类及结合位点预测分析筛选核心启动子区候选转录因子;构建转录因子过表达载体,转染至293T 细胞,分析转录因子对牛C A R T 核心启动子区的转录调控功能(n =3)㊂结果表明,牛C A R T 基因-1200b p ~+22b p 区域存在C pG 岛和T A T A b o x ㊁C A A T b o x 等顺式作用元件;构建的4个截短启动子报告基因载体均具有转录起始活性,-292b p ~+22b p 片段转录起始活性最强,为牛C A R T 基因核心启动子区;转录因子R F X 5㊁C R E B ㊁R F X 1㊁J U N D ㊁T E A D 4㊁T F A P 2D ㊁R E L A 可与牛C A R T 基因核心启动子区特异性结合;进一步研究证实R F X 5㊁R F X 1㊁T E A D 4抑制C A R T 转录(P <0.01),C R E B 与R E L A 激活C A R T 转录(P <0.001)㊂本研究成功扩增获得牛C A R T 启动子区域,筛选鉴定-292b p ~+22b p 为牛CA R T 基因的核心启动子区,证实R F X 5㊁R F X 1㊁T E A D 4为C A R T 转录抑制因子,C R EB ㊁R E L A 为C A R T 转录激活因子㊂研究结论为丰富牛下丘脑C A R T 表达调控机制,深入研究C A R T 调控卵泡发育机理提供依据㊂关键词:牛;C A R T ;核心启动子;转录调控;D N A p u l l d o w n中图分类号:S 823.2 文献标志码:A 文章编号:0366-6964(2023)09-3689-11收稿日期:2023-03-24基金项目:国家自然科学基金面上项目(31873002);山西省应用基础研究计划面上项目(20210302123380);山西农业大学横向科技项目(2022H X 010;2021H X 23;2020H X 06;2019H X 03)作者简介:王栋梁(1982-),男,山西朔州人,硕士,讲师,主要从事动物生殖生理方面的研究,E -m a i l :349859460@q q .c o m *通信作者:李鹏飞,主要从事动物生殖生理方面的研究,E -m a i l :a d a m l pf @126.c o m I d e n t i f i c a t i o n a n d T r a n s c r i p t i o n a l R eg u l a t i o n A n a l ys i s o f C o r e P r o m o t e r o f B o v i n e C A R T G e n eWA N G D o n g l i a n g 1,R E N J i n g 2,H A O Q i n q i n 2,L I P e n g f e i 2*(1.S h u o z h o u V o c a t i o n a l T e c h n o l o g y C o l l e g e ,S h u o z h o u 036002,C h i n a ;2.C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e ,S h a n x i A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y ,T a i gu 030801,C h i n a )A b s t r a c t :T h e p r e s e n t s t u d y a i m e d t o s c r e e n t h e c o r e p r o m o t e r o f b o v i n e C A R T g e n e a n d i d e n t i f yt h e t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s r e g u l a t i n g C A R T e x p r e s s i o n ,a n d e x p l o r e i t s t r a n s c r i p t i o n a l r e gu l a t i o n m e c h a n i s m.T h e h y p o t h a l a m u s o f 3h e a l t h y co w w e r e c o l l e c t e d f o r g e n o m i c D N A e x t r a c t i o n .T h e p r o m o t e r o f b o v i n e C A R T g e n e w a s o b t a i n e d t h r o u g h P C R a m p l i f i c a t i o n a n d c l o n e s e q u e n c i n g ,a n d i t s s e q u e n c e c h a r a c t e r i s t i c s w e r e a n a l y z e d b y E M BO S S ,M e t h P r i m e r ,N e w P L A C E d a t a b a s e .T h e 4C A R T g e n e p r o m o t e r r e p o r t e r v e c t o r s c o n t a i n i n g d i f f e r e n t t r u n c a t e d l e n gt h s w e r e c o n -s t r u c t e d t o i d e n t i f y t h e c o r e p r o m o t e r r e g i o n b y d u a l l u c i f e r a s e r e p o r t e r g e n e a c t i v i t y a s s a y.D N A p u l l d o w n a n d m a s s s p e c t r o m e t r y ,f u n c t i o n a l c l u s t e r a n d b i n d i n g s i t e p r e d i c t i o n a n a l ys i s w e r e畜牧兽医学报54卷u s e d t o s c r e e n t h e c a n d i d a t e t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s i n t h e c o r e p r o m o t e r r e g i o n(n=3).T h e t r a n-s c r i p t i o n f a c t o r s o v e r e x p r e s s i o n v e c t o r s w e r e c o n s t r u c t e d a n d t r a n s f e c t e d t o293T c e l l s t o a n a l y z e t h e r e g u l a t o r y f u n c t i o n o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s o n b o v i n e C A R T g e n e t r a n s c r i p t i o n(n=3).T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e r e w e r e C p G i s l a n d a n d c i s-a c t i n g e l e m e n t s s u c h a s T A T A b o x a n d C A A Tb o x i n t h e-1200b p-+22b p r e g i o n o f b o v i n e C A R T g e n e.A l l t h e4r e p o r t e r v ec t o r s w i 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T是牛卵泡发育过程中的关键调控因子[5],体外培养牛卵泡颗粒细胞(g r a n u-l o s a c e l l s,G C s)发现,添加C A R T可显著抑制促卵泡素(f o l l i c l e-s t i m u l a t i n g h o r m o n e,F S H)诱导的G C s中雌激素(e s t r o g e n,E2)的分泌,G C s中芳构化酶C Y P19A1m R N A表达量减少,因此认为C A R T在牛卵泡发育过程中发挥负调控作用[6]㊂真核生物的基因表达极为复杂,可大致分为转录水平调控和转录后水平调控,其中细胞在转录水平对基因的表达调控最为经济有效,转录水平调控依赖基因启动子和特异性转录因子的相互作用㊂S h o b a t a k e等[7]报道,人C A R T启动子区域存在转录因子G A T A2㊁G A T A3结合位点,进一步研究表明干扰上述两个转录因子表达能够消除由间歇性缺氧诱导的C A R T m R N A水平上调㊂Z h a n g等[8]发现,人C A R T启动子和内含子中均含有1个N R S F 结合位点(N R S E),转录因子N R S F通过招募共阻遏复合物抑制C A R T表达,且N R S F对内含子N R S E的亲和力高于启动子N R S E㊂有研究发现,给予可卡因刺激后,大鼠伏隔核中C A R T和转录因子C R E B含量增加,C h I P试验证明C R E B直接与C A R T启动子区域结合激活转录[9-10]㊂本课题组前期致力于筛选并鉴定位于牛卵泡G C s膜上的能够与C A R T特异性结合并发挥调控作用的G蛋白偶联受体[11-12],而目前对于牛C A R T转录因子鉴定及其转录调控机制的研究也鲜有报道㊂本研究利用P C R扩增㊁生物信息学分析㊁双荧光素酶报告基因试验对牛C A R T基因核心启动子区进行分析与鉴定;D N A p u l l d o w n筛选能够与C A R T基因核心启动子区特异性结合的转录因子,并通过体外试验分析转录因子对牛C A R T基因核心启动子转录活性的影响,为进一步完善牛下丘脑C A R T基因表达调控网络,分析并阐明C A R T基因调控卵泡发育的作用机理提供理论依据㊂1材料与方法1.1试验样品山西文水县肉牛屠宰场选择3头正常发情的健康西门塔尔母牛,采集下丘脑组织后,投入灭菌D P B S中洗涤后液氮速冻,带回实验室处理㊂09639期王栋梁等:牛C A R T 基因核心启动子鉴定及转录调控分析1.2 试验试剂人胚胎肾上皮细胞(293T )由山西农业大学生命科学学院实验室保存;组织基因组D N A 提取试剂盒(天根);2ˑT a q P C R M a s t e r M i x (中科瑞泰);限制性内切酶K pn I ㊁S m a I ,T B G r e e n P r e m i x E x T a q T MII (T a K a R a );p G L 3-B a s i c 载体㊁p R L -T K 载体(P r o m e g a );p c D N A 3.1(+)载体(I n v i t r o ge n );T r a n s I n t r o T ME L (全式金);D N A p u l l d o w n(伯信)㊂1.3 试验方法1.3.1 启动子序列结构分析 从N C B I G e n -B a n k 数据库中获取牛C A R T (G e n B a n k 登录号:NM _001007820)基因组D N A 序列,选取转录起始位点(t r a n s c r i pt i o n s t a r t s i t e ,T S S )上㊁下游启动子区域1222b p 作为研究对象,利用E M B O S S 数据库(h t t p s ://w w w .e b i .a c .u k /T o o l s /s e qs t a t s /e m b o s s _c p g p l o t /)㊁M e t h P r i m e r 数据库(h t t p ://w w w .u r o -g e n e .o r g /c g i -b i n /m e t h p r i m e r /m e t h p r i m e r .c g i )预测启动子区内潜在的C pG 岛位置;利用N e w P L A C E 数据库(h t t p s ://w w w .d n a .a f f r c .g o .j p/P L A C E /)分析启动子上顺式作用元件位点㊂1.3.2 基因组D N A 提取 根据组织基因组D N A 提取试剂盒说明书从牛下丘脑组织中抽提D N A ,N a n o d r o p 超微量核酸蛋白测定仪检测浓度及纯度后,置于-20ħ暂存备用㊂1.3.3 引物设计㊁P C R 扩增及测序 利用P r i m e r P r e m i e r 5.0针对C A R T 启动子区设计特异性引物,交由公司合成,引物详细信息见表1㊂表1 本试验所用引物T a b l e 1 P r i m e r s u s e d i n t h i s s t u d y基因名称G e n e n a m e引物序列(5'ң3')P r i m e r s e qu e n c e 用途U s a ge C A R T p r o m o t e rF :G C C T C T A G G T A A G T G G G A A A A C A T C TR :G G T G C T G A A A C T C G G C G CP C RR F X 5F :C G C T T C C G C T A C A A G T G T G A G G R :A G G C T G C T T C T A C C A C C T C A T C CR T -q P C R C R E B F :C C C T G G A G T T G T T A T G G C G T C T T C R :C T C G T G C T G C T T C C C T G T T C T T CR T -q P C R R F X 1F :A G A C A C C T A T C G C C G T G A T G G G R :A T C C T C C T C C T C T T C C T C C T C C T CR T -q P C R J U N D F :T G A A G G A C G A G C C T C A G A C A G T G R :C T T G C T G G C G G C G A T C C T A T T CR T -q P C R T E A D 4F :C C C C T G C G G A A G A A G A A A G A T C A T C R :C C T G G T T C T G G T C T T G C C T G T T CR T -q P C R T F A P 2D F :C C A A T T C C A C T G T C G C C T A T T C C T C R :T G G C T G T G C T G A A A C T C G T A A T G GR T -q P C R R E L A F :C G C T T C C G C T A C A A G T G T G A G G R :T C T T G A T A G T G G G G T G G G T C T T G GR T -q P C R β-a c t i n F :G G G A C C T G A C T G A C T A C C T CR :T C A T A C T C C T G C T T G C T G A TR T -qP C R 1.3.4 重组载体构建及双荧光素酶活性检测根据顺式作用元件位点对启动子序列5'端进行截短,具体截短长度及位置见图1,在截短片段上㊁下游分别引入K pn I 和S m a I 酶切位点,交由上海吉玛制药技术有限公司合成㊂利用限制性内切酶K pn I 和S m a I 对p G L 3-B a s i c 质粒进行双酶切,酶切产物经T 4DN A 连接酶连接后转化感受态细胞,选取阳性重组质粒测序,重组质粒分别命名为p G L 3-314(-292b p ~+22b p )㊁p G L 3-497(-475b p ~+22b p )㊁p G L 3-827(-805b p ~+22b p )㊁pG L 3-1222(-1200b p ~+22b p)㊂将重组质粒瞬时转染至293T 细胞48h 后,收集细胞并用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测每个样品中萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性,萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性的比值即为荧光素酶相对活性(r e l a t i v e l u c i f e r a s e a c t i v i t y ,R L A )㊂1.3.5 D N A p u l l d o w n 试验 针对C A R T 核心1963畜牧兽医学报54卷启动子区域设计5'端生物素标记探针,交由伯信公司合成,N C探针选择编码β-半乳糖苷酶的L a c Z基因㊂提取牛下丘脑组织核蛋白,B r a d f o r d法测定样品浓度,-80ħ保存㊂上述生物素标记的目的探针和N C探针分别与链霉亲和素磁珠25ħ结合1h,向磁珠-探针混合物中加入核蛋白样品,4ħ旋转孵育结合1h㊂洗脱收集蛋白复合物,S D S-P A G E电泳分离蛋白条带并进行考马斯亮蓝染色㊂从考染后的胶块上切下差异条带,进行质谱检测㊂图1牛C A R T基因启动子5'端截短示意图F i g.1S c h e m a t i c d i a g r a m o f b o v i n e C A R T g e n e p r o m o t e r5't r u n c a t e d p r o m o t e r1.3.6 质谱鉴定与数据处理使用O r b i t r a pE x p l o r i s T M480质谱仪进行质谱分析,液相所用A 液为0.1%甲酸水溶液,B液为0.1%甲酸乙腈水溶液㊂取1μg酶解后的蛋白胶条由自动进样器上样到Z o r b a x300S B-C18p e p t i d e t r a p s,再经由色谱柱R P-C18进行分离,色谱柱以95%的A液进行平衡,流速为300n L㊃m i n-1㊂分离梯度为:0~50m i n,B 液线性梯度4%~50%;50~54m i n,B液线性梯度50%~100%;54~60m i n,B液维持在100%㊂Q E x a c t i v e质谱仪对分离产物进行质谱分析㊂P r o t e o m e D i s c o v e r2.4对原始文件进行数据库检索,数据库为B o s t a u r u s-e n s e m b l-f a s t a,酶解方式为胰蛋白酶,固定修饰为C a r b a m i d o m e t h y,可变修饰为M O x i d a t i o n㊁A c e t y l㊂T B t o o l s绘制韦恩图并获取差异蛋白列表,G e n e O n t o l o g y数据库(h t t p:// g e n e o n t o l o g y.o r g/)对差异蛋白进行G O富集分析,K E G G数据库(h t t p://w w w.g e n o m e.j p/ k e g g/)分析差异蛋白参与的信号通路,A n i m a l T-F D B3.0在线分析数据库(h t t p://b i o i n f o.l i f e.h u s t.e d u.c n/A n i m a l T F D B/)进行转录因子与核心启动子互作分析㊂1.3.7过表达转录因子对C A R T启动子转录活性的影响 N C B I G e n B a n k数据库中获取牛R F X5 (G e n B a n k登录号:X M_010803041)㊁C R E B基因(G e n B a n k登录号:NM_174285)㊁R F X1(G e n B a n k 登录号:X M_024994860)㊁J U N D(G e n B a n k登录号:NM_001103253)㊁T E A D4(G e n B a n k登录号: X M_010805630)㊁T F A P2D(G e n B a n k登录号:N M_001192329)㊁R E L A(G e n B a n k登录号:NM_ 001080242)序列,与p c D N A3.1(+)质粒连接构建过表达载体,交由上海吉玛制药技术有限公司合成;根据上述序列设计转录因子与β-a c t i n定量引物,交由公司合成,引物信息见表1㊂转录因子过表达载体分别与牛C A R T核心启动子双荧光素酶报告基因载体共转染293T细胞㊂转染24h后,T r i z o l提取细胞总R N A,经反转录合成c D N A后进行R T-q P C R检测转录因子过表达情况,反应体系为:c D N A模板1μL,T B G r e e n P r e m i x E x T a qⅡ5μL,上㊁下游引物各0.4μL, d d H2O3.2μL㊂反应程序为:95ħ预变性10s;定量P C R反应95ħ5s,60ħ30s,72ħ20s,40个循环;熔解曲线:95ħ15s,60ħ60s,95ħ15s㊂以β-a c t i n为内参基因,2-әәC T值计算基因相对表达量㊂转染48h后,双荧光素酶报告基因系统检测细胞R L A㊂1.3.8统计分析每个试验设置3个重复,通过G r a p h P a d P r i s m9.0软件统计分析试验数据,结果采用 平均值ʃ标准误 表示,采用单因素方差分析比较C A R T截短启动子活性,采用t检验分析转录因子与C A R T核心启动子结合性各组间的差异, P>0.05表示无显著差异,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著㊂2结果2.1牛C A R T基因启动子区序列扩增以下丘脑基因组D N A为模板,P C R扩增牛29639期王栋梁等:牛C A R T 基因核心启动子鉴定及转录调控分析C A R T 基因候选启动子区域,扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测得到单一清晰㊁与目的产物一致的特异性扩增条带(图2),测序证实扩增产物与N C B IG e n B a n k 中牛C A R T 基因序列一致,表明已成功获得牛C A R T 基因1222b p 的启动子序列㊂M.D N A 相对分子质量标准D L 2000;1~3.牛C A R T 基因启动子扩增产物M.D L 2000m a r k e r ;1-3.P C R p r o d u c t s o f p r o m o t e r f o r b o -v i n e C A R T g e n e图2 牛C A R T 基因启动子P C R 扩增产物F i g .2 P C R a m pl i f i e d p r o d u c t o f p r o m o t e r o f b o v i n e C A R T g e n e2.2 牛C A R T 基因启动子区序列特征分析序列分析结果显示,牛C A R T 基因启动子区内A 碱基为256个(20.95%),T 碱基为325个(26.60%),G 碱基为298个(24.39%),C 碱基为343个(28.07%)㊂牛C A R T 基因T S S 可能位于翻译起始位点A T G 上游22b p 处的A 碱基(记为+1),利用E M B O S S 和M e t h P r i m e r 数据库在线分析C pG 岛位点,筛选标准为:G C %>50%㊁I s l a n d s i z e >100以及O b s /E x p>0.60,结果显示牛C A R T 基因启动子区含有1个C p G 岛,位于-239b p ~-35b p (205b p)(图3A )㊂顺式作用元件位点预测结果显示,存在2个T A T A b o x ,分别位于-28~-21b p 和-846~-840b p;8个C A A T b o x ,分别位于-147~-142b p ㊁-809~-806b p㊁-868~-865b p ㊁-896~-892b p ㊁-1046~-1043b p ㊁-1087~-1082b p ㊁-1121~-1118b p 和-1166~-1162b p(图3B )㊂A.C pG 岛位点分析;B .顺式作用元件位点预测A.A n a l y s i s o f C p G i s l a n d s i t e s ;B .P r e d i c t i o n o f c i s -a c t i n g el e m e n t s i t e s 图3 牛C A R T 基因启动子序列特征分析F i g .3 T h e s e q u e n c e c h a r a c t e r i s t i c a n a l ys i s o f b o v i n e C A R T g e n e p r o m o t e r 3963畜牧兽医学报54卷2.3牛C A R T基因核心启动子区鉴定双荧光素酶活性检测结果显示,截短重组载体相对荧光活性均显著高于p G L-B a s i c对照载体,其中p G L-314的相对荧光活性显著高于p G L-497(图4),表明-292b p~+22b p内可能存在正向转录调控元件,该区域为牛C A R T基因转录所需的最短核苷酸序列,即牛C A R T基因的近端核心启动子区㊂*.P<0.05;**.P<0.01;n s.P>0.05㊂下同*.P<0.05;**.P<0.01;n s.P>0.05.T h e s a m e a s b e l o w图4牛C A R T基因启动子截短片段相对荧光活性检测F i g.4D e t e c t i o n o f t h e r e l a t i v e f l u o r e s c e n c e a c t i v i t y o f b o v i n e C A R T g e n e p r o m o t e r t r u n c a t e d f r a g m e n t s2.4D N A p u l l d o w n筛选核心启动子区转录因子D N A p u l l d o w n产物进行S D S-P A G E分离及考马斯亮蓝染色,结果显示对照组(N C)与试验组(D P D)在40~55k u间存在2条差异条带(图5)㊂质谱分析去除各组中特异性肽段数ɤ2的蛋白质后,D P D组获得互作蛋白921个,去除与N C组有交集的143个蛋白质后,共获得778个与N C组差异表达的蛋白质(图6)㊂图5差异性互作蛋白筛选F i g.5S c r e e n i n g o f d i f f e r e n t i a l l y i n t e r a c t i n g p r o t e i n s2.5互作蛋白功能分析G O功能富集分析显示,778个蛋白质中有15个具有D N A结合功能(图7A);K E G G分析显示,差异蛋白涉及的10条主要的信号通路包括:信号转导㊁内分泌调节㊁癌症发生㊁神经调节㊁细胞生长与凋图6差异蛋白韦恩图F i g.6V e n n d i a g r a m o f d i f f e r e n t i a l p r o t e i n s亡㊁免疫调节㊁糖代谢㊁翻译㊁转录和能量代谢(图7B),其中R F X5㊁C R E B㊁R F X1㊁J U N D㊁T E A D4㊁T F A P2D㊁R E L A共7个蛋白质具有基因转录调控功能,且均与牛C A R T核心启动子区存在结合位点(表2)㊂2.6转录因子对C A R T基因核心启动子转录活性的影响p c D N A3.1(+)-转录因子重组质粒瞬时转染至293T细胞,R T-q P C R检测细胞中转录因子表达水平㊂结果显示,转染p c D N A3.1(+)-R F X5㊁p c D N A3.1(+)-C R E B㊁p c D N A3.1(+)-R F X1㊁p c D N A3.1(+)-J U N D㊁p c D N A3.1(+)-T E A D4㊁p c D N A3.1(+)-T F A P2D㊁p c D N A3.1(+)-R E L A 后,细胞中相应的候选转录因子m R N A水平均极显著提高(P<0.01)(图8),表明转录因子过表达载体构建成功㊂应用双荧光素酶报告基因系统检测各转录因子对牛C A R T基因核心启动子区转录活性49639期王栋梁等:牛C A R T 基因核心启动子鉴定及转录调控分析A.分子功能富集分析;B .信号通路分析A.M o l e c u l a r f u n c t i o n e n r i c h m e n t a n a l y s i s ;B .S i g n a l i n g p a t h w a y a n a l ys i s 图7 差异蛋白功能分析F i g .7 F u n c t i o n a l a n a l y s i s o f d i f f e r e n t i a l pr o t e i n s 表2 转录因子结合位点预测T a b l e 2 P r e d i c t i o n o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r b i n d i n g si t e s 蛋白名称P r o t e i n n a m e起始点/b pS t a r t 终止点/b pE n d 结合位点序列(5'ң3')B i n d i n g s i t e s e qu e n c e 评分S c o r eR F X 5-157-136G C C C G G C G G G C A T T G A C G T C A A 15.9079C R E B -155-135C C G G C G G G C A T T G A C G T C A 15.5303R F X 1-197-181T C G T T C C G G G G C G C C T G11.7079J U N D -83-62C C T C C T T C T T C C C T G C G C C C C G13.6316T E A D 4+14+22T T C A G C A C C 16.9079T F A P 2D -186-173C G C C T G G A G C C C G G10.0407R E L A-106-91C C C C C T T C C T T C C T T C12.1053的影响,结果显示,过表达R F X 5㊁R F X 1㊁T E A D 4后,293T 细胞相对荧光活性显著下降(P <0.05);过表达C R E B ㊁R E L A 后293T 细胞相对荧光活性极显著上升(P <0.0001);过表达J U N D ㊁T F A P 2D 对293T 细胞相对荧光活性无显著变化(P >0.05)(图9)㊂3 讨 论包裹在卵泡外周的G C s 为卵母细胞发育提供营养物质,并通过分泌E 2促进卵泡成熟和排卵[13],G C s 凋亡是引起卵泡闭锁的主要原因[14]㊂研究发现,神经肽C A R T 通过下丘脑-垂体-卵巢轴作用于G C s ,抑制E 2分泌[15],E 2水平降低是卵泡闭锁的主要特征之一[16],低浓度的E 2促进GC s 凋亡[17]㊂前期对牛优势卵泡(d o m i n a n t f o l l i c l e s ,D F s)和从属卵泡(s u b o r d i n a t e f o l l i c l e s ,S F s)转录组测序分析发现,C A R T 在D F s 中表达量显著高于S F s ,且主要在G C s 层表达,认为C A R T 通过促进C G s 凋亡来影响E 2分泌,进而对卵泡发育发挥抑制作用[18]㊂本课题组对C A R T 在牛下丘脑表达的转录后水平调控机制进行了研究,发现b t a -m i R -377可与C A R T 3'U T R 区结合抑制C A R T m R N A 转录[19]㊂为进一步完善C A R T 表达调控网络,本研究对牛C A R T 基因表达转录水平调控机制进行了深入探究㊂启动子是基因转录起始的关键区域,转录因子与该区域内的顺式作用元件结合,发挥转录增强或抑制作用㊂Y a m a d a 等[20]克隆获得人C A R T 基因启动子序列,对T S S 上游1072b p 的序列进行结构分析,发现-156b p 处的基因多态性位点与肥胖遗传相关㊂D o m i n gu e z 等[21]构建小鼠D N A 文库,对C A R T 基因测序鉴定后发现在近端启动子区内存5963畜 牧 兽 医 学 报54卷A.R F X 5过表达检测;B .C R E B 过表达检测;C .R F X 1过表达检测;D.J U N D 过表达检测;E .T E A D 4过表达检测;F .T F A P 2D 过表达检测;G.R E L A 过表达检测㊂***.P <0.001;****.P <0.0001,下同A.O v e r e x p r e s s i o n d e t e c t i o n o f R F X 5;B .O v e r e x p r e s s i o n d e t e c t i o n o f C R E B ;C .O v e r e x pr e s s i o n d e t e c t i o n o f R F X 1;D.O v e r e x p r e s s i o n d e t e c t i o n o f J U N D ;E .O v e r e x p r e s s i o n d e t e c t i o n o f T E A D 4;F .O v e r e x p r e s s i o n d e t e c t i o n o f T F A P 2D ;G.O v e r e x p r e s s i o n d e t e c t i o n o f R E L A .***.P <0.001;****.P <0.0001,t h e s a m e a s b e l o w 图8 293T 细胞内转录因子过表达检测F i g .8 D e t e c t i o n o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s o v e r e x pr e s s i o n i n 293T c e l l s 在c AM P 反应元件等多种顺式作用元件,且人和小鼠C A R T 基因-320b p ~+1b p 区同源性高达83%㊂L i n g 等[22]分析猪CA R T 5'端缺失启动子片段转录起始活性,确定-217b p ~+152b p 为猪C A R T 转录起始所需的最短序列,即猪C A R T 基因核心启动子区㊂本研究从牛下丘脑组织中扩增获得牛C A R T 基因启动子片段,构建4个不同截短长度的启动子报告基因载体,筛选并鉴定C A R T 基因核心启动子区,明确-292b p ~+22b p 区为牛C A R T 基因核心启动子区㊂C pG 岛通过甲基化影响转录因子与启动子的结合能力,在真核生物基因转录过程中发挥重要调控作用[23-24]㊂生物信息学分析结果显示,牛C A R T 基因C p G 岛位于核心启动子区,认为C A R T 基因转录调控可能受到C p G 岛甲基化的影响㊂C R E B 是目前研究较为广泛的一类转录激活因子,主要参与调控神经元反应相关基因的表达[25],可通过磷酸化和去磷酸化调节靶基因转录[26],前人研究表明C R E B 激活大鼠下丘脑C A R T 表达[10],本研究同样明确C R E B 对牛下丘脑C A R T 转录发挥激活作用㊂R F X 家族可与主要组织相容性抗原MH C Ⅱ类基因特异性结合影响机体免疫性应答,在真核生物的各类细胞中广泛表达并发挥基因转录激活作用[27-28]㊂R F X 转录因子家族广泛存在于真核生物的各个组织中,通过与细胞增殖和迁移相关基因启动子结合发挥转录激活作用,进而影响癌症发生发展[29-30]㊂R F X 1是已知的具有双向活性的转录因子[31];王娜等[32]研究表明,干扰神经元中R F X 5表达导致P c d h α基因水平显著上调,表明R F X 5具有抑制基因转录的功能,本研究则发现R F X 5可显著降低C A R T 核心启动子转录活性,因此认为R F X 5具有与R F X 1相似的双向转录活性㊂T E A D 4可与转录辅助激活因子Y A P /T A Z 结合发挥共激活作用,参与调节H i p po 信号通路并影响癌症发生[33-34],另有研究发现,T E A D 4参与介导P I 3K /A K T 信号通路,促进膀胱癌细胞的迁移[35],还可在肝癌细胞中抑制p 27基因的表达[36]㊂本研究筛选获得的转录因子J U N D ㊁T F A P 2D 和R E L A均已被证明具有双向转录活性[37-40]㊂综上所述,转录因子在不同细胞中对不同基因转录调控方向有所69639期王栋梁等:牛C A R T基因核心启动子鉴定及转录调控分析A.R F X 5组相对荧光活性检测;B .C R E B 组相对荧光活性检测;C .R F X 1组相对荧光活性检测;E .J U N D 相对荧光活性检测;F .T E A D 4组相对荧光活性检测;G.T F A P 2D 组相对荧光活性检测;H.R E L A 组相对荧光活性检测A.R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e a c t i v i t y o f R F X 5g r o u p ;B .R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e a c t i v i t y o f C R E B g r o u p;C .R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e a c t i v i t y o f R F X 1g r o u p ;E .R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e a c t i v i t y o f J U N D g r o u p ;F .R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e a c t i v i t y of T E A D 4g r o u p ;G.R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e a c t i v i t y o f T F A P 2D g r o u p ;H.R e l a t i v e f l u o r e s c e n c e a c t i v i t y o f R E L A g r o u p 图9 转录因子对牛C A R T 基因核心启动子转录活性的影响F i g .9 E f f e c t s o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s o n t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y of b o v i n e C A R Tg e n e c o r e p r o m o t e r 不同,仅根据前人研究成果判断某转录因子对目的基因的转录调控作用易导致结果偏差㊂本研究应用双荧光素酶报告基因系统对R F X 5㊁C R E B ㊁R F X 1㊁J U N D ㊁T E A D 4㊁T F A P 2D ㊁R E L A 7个转录因子与牛C A R T 基因核心启动子区的靶向结合关系进行验证,初步明确R F X 5㊁R F X 1㊁T E A D 4抑制牛C A R T 核心启动子转录活性;C R E B 与R E L A 增强牛C A R T 核心启动子转录活性㊂本研究未针对牛下丘脑细胞及动物活体进行转录因子功能验证,后续将开展定点突变及细胞功能试验,并设计相应的转录因子靶向药物进行动物活体试验,探究转录因子对牛下丘脑C A R T 分泌及卵泡发育的影响,进一步明确各转录因子与C A R T 核心启动子区的靶向结合位点及相互作用关系㊂4 结 论本研究扩增获得牛C A R T 基因启动子序列,预测该片段上存在C p G 岛等多种涉及基因转录调控的顺式作用元件,确定-292b p ~+22b p 为C A R T 核心启动子区,构建转录因子过表达载体并明确R F X 5㊁R F X 1㊁T E A D 4为牛C A R T 基因转录抑制因子,C R E B 与R E L A 为转录激活因子㊂上述7963畜牧兽医学报54卷结论为进一步揭示牛下丘脑C A R T转录调控机制奠定理论基础㊂参考文献(R e f e r e n c e s):[1] R A J A K O S K I E.T h e o v a r i a n f o l l i c u l a r s y s t e m i ns e x u a l l y m a t u r e h e i f e r s w i t h s p e c i a l r e f e r e n c e t os e a s o n a l,c y c l i c a l,a n d l e f t-r i g h t v a r i a t i o n s[J].A c t aE n d o c r i n o l,1960,34(S3):S7-S68.[2] S AM S O N W K,S A L V E M I N I D,Y O S T E N G L C.O v e r c o m i n g s t r e s s,h u n g e r,a n d p a i n:c o c a i n e-a n da m p h e t a m i n e-r e g u l a t e d t r a n s c r i p t p e p t i d e s p r o m i s e[J].E n d o c r i n o l o g y,2021,162(8):b q a b108.[3] O N G Z Y,M C N A L L Y G P.C A R T i n e n e r g y b a l a n c ea n d d r u g a d d i c t i o n:C u r r e n t i n s i g h t s a n d m e c h a n i s m 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基于转录组测序的关岭牛肌肉生长发育关键基因筛选与鉴定作者：周迪赵忠海王府杨蓉王燕敖叶谢玲玲陈秋生田兴舟李波来源：《南方农业学报》2024年第03期摘要：【目的】基于轉录组测序挖掘出贵州关岭牛肌肉生长发育关键基因，为后续培育贵州优质肉牛品种提供理论依据。
【方法】选取3头健康且体重相近的24月龄成年关岭牛，屠宰后采集其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、大腿肌及肩峰等组织样品，采用TRIzol法提取各组织总RNA，构建cDNA文库后进行转录组测序，通过生物信息学手段筛选出不同样品间的差异表达基因（DEGs），结合GO功能注释分析和KEGG信号通路富集分析挖掘出关岭牛肌肉生长发育相关候选基因，再经实时荧光定量PCR对候选基因进行验证。
【结果】测序样品有效序列（Clean reads）比对至参考基因组序列的平均比对率为90.76%，检测到26367个新转录本（有编码潜能的转录本19659个，非编码转录本 6708个）；在各组织中检测到共表达基因53912个，其中已知基因51688个、预测新基因2224个；GO功能注释分析发现这些共表达基因主要发挥生物调节、代谢过程、生物膜组成、催化活性和转录调节活性等功能。
通过DEGseq检测，最终筛选获得16个与肌肉生长发育相关的DEGs（QKI、CHKB、MYBPCI、MBNLI、MYHII、MYLK2、TPM3、NEXN、EZH2、 TNNT3、PPARGCIA、SGCA、DMPK、FOXPI、FLNB和TNS2），主要参与内吞作用、心肌收缩、癌症、代谢及MAPK信号通路。
实时荧光定量PCR验证结果显示，筛选出的16个DEGs在关岭牛背最长肌或肩峰中高表达，与转录组测序结果一致。
【结论】基于转录组测序从关岭牛各组织中筛选出16个与肌肉生长发育相关的DEGs，主要在生物调节、代谢过程、细胞成分、催化和转录调节等方面发挥功能作用，可作为开展关岭牛肌肉生长发育遗传机制研究的候选基因。
第52卷 第4期2024年4月西北农林科技大学学报(自然科学版)J o u r n a l o f N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y(N a t .S c i .E d .)V o l .52N o .4A pr .2024网络出版时间:2023-09-18 16:01 D O I :10.13207/j .c n k i .jn w a f u .2024.04.001网络出版地址:h t t ps ://l i n k .c n k i .n e t /u r l i d /61.1390.S .20230914.1712.016牦牛M Y L 3基因的克隆及组织表达分析[收稿日期] 2023-01-12[基金项目] 现代肉牛牦牛产业技术体系项目(C A R S -37);甘肃省基础研究创新群体项目(20J R 5R A 580);中国农业科学院创新工程项目(25-L I H P S -01);甘肃省科技重大专项(21Z D 10N A 001,G Z G G -2021-1);合作市牦牛种质提升及提质增效项目 [作者简介] 张梦帆(2000-),女,河北沙河人,在读硕士,主要从事动物繁殖原理与技术研究㊂E -m a i l :z m f 136********@163.c o m [通信作者] 梁春年(1973-),男,甘肃武威人,研究员,博士,主要从事动物遗传育种与繁殖研究㊂E -m a i l :c h u n n i a n 2006@163.c o m张梦帆1,2,路建卫3,扎 老3,赵 雪4,梁春年1,2(1中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所,甘肃省牦牛繁育工程重点实验室,甘肃兰州730050;2农业农村部青藏高原畜禽遗传育种重点实验室,甘肃兰州730050;3合作市佐盖多玛乡畜牧站,甘肃合作747000;4合作市农畜产品质量安全检测检验中心,甘肃合作747000)[摘 要] ʌ目的ɔ研究牦牛M Y L 3基因的结构和表达特征,探究其生物学功能及影响牦牛肌肉生长发育的机制㊂ʌ方法ɔ以美仁牦牛c D N A 为模板,P C R 扩增M Y L 3基因编码区序列(C D S ),利用M E G A 11软件构建系统进化树,利用生物信息学软件对其编码蛋白进行分析㊂通过实时荧光定量P C R (R T -qP C R )检测M Y L 3基因在心脏㊁肝脏㊁脾脏㊁肺脏(参照)㊁睾丸㊁肌肉和脂肪组织中的相对表达量㊂ʌ结果ɔ牦牛M Y L 3基因C D S 区长600b p ,共编码199个氨基酸,存在1个碱基突变位点,位于第165位(A>T )㊂系统进化分析结果显示,牦牛与普通牛的亲缘关系最近,与单峰驼的亲缘关系最远㊂生物信息学分析结果显示,牦牛MY L 3蛋白为不稳定的亲水性蛋白,无信号肽,不存在跨膜结构,主要存在于细胞质内,有8个磷酸化位点和2个N -糖基化位点,蛋白的二级结构以α-螺旋为主,主要与调控肌肉生长发育的相关蛋白相互作用㊂R T -q P C R 结果表明,M Y L 3基因在心脏中的表达量最高,极显著高于其他组织;肌肉中次之,与除心脏外的其他组织存在极显著差异㊂ʌ结论ɔM Y L 3基因可能与牦牛心脏发育有关,对肌肉的生长发育和肉质有一定影响㊂[关键词] 牦牛;M Y L 3基因;肌肉生长发育;肌肉品质[中图分类号] S 823.8+5[文献标志码] A[文章编号] 1671-9387(2024)04-0001-09C l o n i n g a n d t i s s u e e x p r e s s i o n a n a l ys i s o f M Y L 3ge n e i n y a k (B o s g r u n n i e n s )Z H A N G M e n gf a n 1,2,L U J i a n w e i 3,Z H A L a o 3,Z H A O X u e 4,L I A N G C h u n n i a n 1,2(1K e y L a b o r a t o r y o f Y a k B r e e d i n g E n g i n e e r i n g G a n s u P r o v i n c e ,L a n z h o u I n s t i t u t e o f H u s b a n d r y an d P h a r m a c e u t i c a l S c i e n c e s ,C h i n e s e A c a d e m y o f A g r i c u l t u r a l S c i e n c e s ,L a n z h o u ,G a n s u 730050,C h i n a ;2K e y L a b o r a t o r y o f L i v e s t o c k a n d P o u l t r y Ge n e t i c s a n d B r e e d i n g o n t h e Q i n g h a i -T i b e t P l a t e a u ,M i n i s t r y of Ag r i c u l t u r e a n d R u r a l A f f a i r s ,L a n zh o u ,G a n s u 730050,C hi n a ;3A n i m a l H u s b a n d r yS t a t i o n o f Z u o g a i d u o m a T o w n s h i p ,H e z u o ,G a n s u 747000,C h i n a ;4Q u a l i t y a n d S a f e t y I n s p e c t i o n C e n t e r o f A gr i c u l t u r a l a n d L i v e s t o c k P r o d u c t s i n H e z u o ,H e z u o ,G a n s u 747000,C h i n a )A b s t r a c t :ʌO b j e c t i v e ɔT h i s s t u d y i n v e s t i g a t e d t h e s t r u c t u r e a n d e x pr e s s i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f M Y L 3g e n e i n y a k ,a n d e x p l o r e d i t s b i o l o g i c a l f u n c t i o n a n d t h e m e c h a n i s m s a f f e c t i n g t h e g r o w t h a n d d e v e l o pm e n t o f y a k m u s c l e s .ʌM e t h o d ɔM e i r e n y a k c D N A w a s u s e d a s t e m p l a t e ,a n d P C R a m p l i f i c a t i o n t e c h n o l o g y wa s u s e d t o ob t a i n t h ec od i n g re g i o n s e q u e n c e (C D S )of M Y L 3g e n e o f y a k .Th e p h y l o g e n e ti c t r e e w a s c o n -s t r u c t e d b y M E G A 11s o f t w a r e ,a n d t h e e n c o d e d p r o t e i n w a s a n a l y z e d b y bi o i n f o r m a t i c s s o f t w a r e .T h e r e l a -t i v e e x p r e s s i o n l e v e l s o f M Y L 3g e n e i n h e a r t ,l i v e r ,s p l e e n ,l u n g ,t e s t i s ,m u s c l e a n d a d i po s e t i s s u e s w e r e d e -t e c t e d b y q u a n t i t a t i v e r e a l -t i m e P C R (R T -q P C R ).ʌR e s u l t ɔT h e l e n gt h o f t h e C D S o f M Y L 3g e n e i n y a k w a s 600b p ,e n c o d i n g 199a m i n o a c i d s ,a n d t h e r e w a s 1b a s e m u t a t i o n s i t e a t p o s i t i o n 165(A>T ).T h ep h y l o g e n e t i c t r e e s h o w e d t h a t y a k h a d t h e c l o s e s t r e l a t i o n s h i p w i t h c o mm o n c a t t l e a n d t h e f a r t h e s t r e l a-t i o n s h i p w i t h C a m e l u s d r o m e d a r i u s.T h e b i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s s h o w e d t h a t MY L3p r o t e i n o f y a k w a s a n u n s t a b l e h y d r o p h i l i c p r o t e i n w i t h o u t s i g n a l p e p t i d e o r t r a n s m e m b r a n e s t r u c t u r e.I t m a i n l y e x i s t e d i n t h e c y t o p l a s m w i t h8p h o s p h o r y l a t i o n s i t e s a n d2N-g l y c o s y l a t i o n s i t e s.T h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n w a s m a i n l yα-h e l i x,w h i c h i n t e r a c t e d w i t h r e l a t e d p r o t e i n s r e g u l a t i n g m u s c l e g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t.R T-q P C R r e s u l t s s h o w e d t h a t t h e e x p r e s s i o n o f M Y L3g e n e i n h e a r t w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h a t i n o t h e r t i s s u e s,f o l l o w e d b y m u s c l e,w h i c h h a d h i g h l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e w i t h o t h e r t i s s u e s e x c e p t t h e h e a r t.ʌC o n c l u s i o nɔM Y L3g e n e m a y b e r e l a t e d t o t h e h e a r t d e v e l o p m e n t o f y a k,a n d h a d c e r t a i n i m p a c t s o n t h e g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t o f m u s c l e a n d m e a t q u a l i t y.K e y w o r d s:y a k;M Y L3g e n e;g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t o f m u s c l e;m u s c l e q u a l i t y牦牛(B o s g r u n n i e n s)多集中在青藏高原,位于地球之巅的高寒之地,其能够适应低温㊁低气压㊁高海拔等恶劣环境,因此有着 高原之舟 的美称㊂牦牛是有着原始野性的珍稀动物,通常采用半放牧的方式养殖㊂牦牛肉富含硒㊁铁㊁锌等微量元素以及必需氨基酸和非必需氨基酸[1],但牦牛肌肉纤维较粗,脂肪沉积率低,肉质粗糙,且肌肉生长缓慢,这限制了牦牛肉类产品的发展㊂优化牦牛肉的品质有助于牦牛肉的推广,促进消费者接纳,同时促进青藏高原牧区的经济发展㊂动物脂肪的生成受脂肪细胞分化㊁脂质代谢等生物学过程的共同影响[2],而动物肌肉发育也受多方面的协同作用,出生前肌纤维数量的增长是影响肌肉发育的主要因素,出生后肌纤维长度和直径增加是肌肉发育的主要动力[3]㊂肌纤维的生长发育与动物的产肉量及肉质密切相关[4]㊂肌球蛋白(m y o s i n)是骨骼肌中重要的结构蛋白和收缩蛋白,是K u e h n e于1864年研究骨骼肌收缩时首次发现并命名的[5]㊂肌球蛋白具有三磷酸腺苷(a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e,A T P)酶活性,能够通过水解A T P来获得肌肉收缩所需的能量,所以也被称为肌球蛋白A T P酶[6]㊂肌球蛋白是由2条重链(m y o-s i n h e a v y c h a i n s,MH C)和2对轻链(m y o s i n l i g h t c h a i n s,MY L)组成的异六聚体[7-9]㊂MY L是肌节相关蛋白,参与肌肉收缩调节[10],包括2条必需轻链和2条调节轻链㊂根据MY L分离所需条件的不同,B a r t o n等[11]将其分为碱性轻链(MY L1㊁MY L3)和磷酸化轻链(MY L2)2类,碱性轻链需在高p H条件下分离,磷酸化轻链需在二硝基苯甲酸存在的条件下分离,由于M L Y2的磷酸化状态会影响MH C 头和肌动蛋白之间的相互作用,所以也被称为调节MY L[12]㊂H a i l s t o n e s等[13]证实,所有的MY L碱性轻链亚型具有不同的功能㊂肌球蛋白轻链3(m y o s i n l i g h t c h a i n3,MY L3)基因,是动物体内编码球蛋白的基因之一㊂MY L3是W n t信号通路(w n t s i g n a l i n g p a t h w a y,W n t)㊁扩张型心脏病信号通路(d i l a t e d c a r d i o m y o-p a t h y, D C M)和转化生长因子β信号通路(t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r-b e t a,T G F-β)中的成员[14-15],这些通路参与了肌细胞和肌肉组织的形成过程㊂因此M Y L3基因在肌肉生长发育中发挥着重要作用,其主要功能是参与肌纤维形成,结合钙离子调节肌肉收缩,参与平滑肌的收缩活动[16]㊂M Y L3基因在动物心脏中的表达量通常较高,可作为心脏坏死标志物[17]㊂现有研究表明,M Y L3m R N A的下调有利于肌内脂肪(i n t r a m u s c u l a r f a t,I M F)沉积[18],据此可推测M Y L3对于提高牦牛的肌内脂肪含量有一定的意义㊂因此探究M Y L3基因对肌肉生长发育及I M F沉积产生的影响对提高牦牛肉口感和经济效益具有重要意义[19],但目前还未见该基因在牦牛上的研究㊂本研究以美仁牦牛为对象,克隆其M Y L3基因,测序后进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量P C R(q u a n t i t a t i v e r e a l-t i m e P C R,R T-q P C R)测定M Y L3基因在牦牛不同组织中的相对表达量,旨在为研究M Y L3基因在牦牛肌肉中的调控机制奠定理论基础,为牦牛的遗传育种研究提供依据㊂1材料与方法1.1材料试验动物为来自于甘肃省合作市佐盖多玛乡的美仁牦牛,选取身体健康㊁状态良好的雄性牦牛3头,屠宰后采集其心脏㊁肝脏㊁脾脏㊁肺脏㊁睾丸㊁肌肉和脂肪组织,放置于液氮中,转移至实验室于-80ħ保存备用㊂T r i z o l购于赛默飞世尔科技公司(I n v i t r o g e n);2西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷R N A 反转录试剂盒㊁pM D 19-T 载体均购于宝生物工程有限公司(T a K a R a );大肠杆菌(E s c h e r i c h i ac o i l )T r a n s 5α感受态细胞购于北京全式金生物技术股份有限公司(T r a n s G e n B i o t e c h );2ˑP o w e r T a qP C R M a s t e r m i x ㊁琼脂糖凝胶D N A 回收试剂盒均购于天根生化科技有限公司(T I A N G E N );S Y B R G r e e n P r o T a q HS q P C R 酶购于艾科瑞生物工程有限公司㊂1.2 试验方法1.2.1 牦牛R N A 的提取及反转录 选取牦牛的肝脏组织为材料,利用T r i z o l 法提取总R N A ,提取的R N A 利用N a n o D r o p2000C 超微量分光光度计检测R N A 浓度,选取浓度合适的R N A 利用反转录试剂盒合成c D N A ,-20ħ保存备用㊂1.2.2 引物的设计及合成 参考牛M Y L 3基因序列(NM _001076501.2)以及G e n B a n k 所公布的内参基因G A P D H 序列,利用N C B I 在线工具设计上下游引物(表1)㊂引物由擎科生物技术有限公司(西安)合成㊂表1 本试验所用引物信息T a b l e 1 I n f o r m a t i o n o f p r i m e r s u s e d i n t h i s s t u d y引物名称P r i m e r n a m e引物序列(5'ң3')P r i m e r s e qu e n c e (5'ң3')退火温度/ħA n n e a l i n g t e m pe r a t u r e 片段长度/b pS e g m e n t l e n gt h 用途U s a ge MY L 3-F MY L 3-RA G G C T C A C C T A C C C T G T T C A G G T A G C C T G A T G G C A G T G A T63.3851基因克隆G e n e c l o n eq P C R -MY L 3-F qP C R -MY L 3-R C T T T G A C A C G T T C C T G C C C A TG C T T C T C C A C C T C G T C T T C T G T 63.3185实时荧光定量P C R Q u a n t i t a t i v e r e a l -t i m e P C RG A P D H -F G A P D H -RC T T T G A C A C G T T C C T G C C C A T G C T T C T C C A C C T C G T C T T C T G T63.3204实时荧光定量P C RQ u a n t i t a t i v e r e a l -t i m e P C R1.2.3 牦牛M Y L 3基因C D S 区的克隆 以牦牛肝脏组织的c D N A 为模板,P C R 扩增M Y L 3基因C D S 区序列㊂P C R 反应体系(总体积25μL )为:上下游引物(10μm o l /L )各2μL ,c D N A 3μL ,2ˑP o w e r T a q PC R M a s t e r m i x 12.5μL ,以R N a s e -f r e e d d H 2O 补足25μL ㊂P C R 扩增程序:95ħ预变性3m i n ;95ħ变性30s ,63.3ħ退火30s ,72ħ延伸3m i n ,35个循环;72ħ延伸10m i n ,4ħ保存㊂对扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳㊂选取电泳条带正确清晰㊁特异性良好的样品切胶回收产物,使用连接酶与p M D 19-T 载体连接过夜,转染至大肠杆菌(E s c h e r i c h i a c o i l )T r a n s 5α感受态细胞,均匀涂布于氨苄西林制备的L B 固体培养基上,37ħ恒温倒置培养12h 左右㊂挑取菌落振荡培养12h 后,对菌液进行P C R 鉴定,将阳性菌液送至擎科生物技术有限公司(西安)进行测序㊂所得序列利用M E G A 11进行拼接,B i o e d i t 对序列进行统计㊂利用O R F F i n d e r 在线软件(h t t ps ://w w w.n c b i .n l m.n i h .go v /o r f f i n d e r /)进行开放阅读框分析㊂1.2.4 牦牛M Y L 3基因及其编码蛋白相似性比对和进化树构建 利用D N A s t a r 软件中的M e g A l i g n 程序比较牦牛M Y L 3基因编码蛋白的氨基酸序列与其他物种的相似性㊂在M E G A 11软件中,采用邻接法(N e i g h b o r -j o i n i n g,N J )构建系统进化树,分析比较牦牛与部分物种的亲缘关系㊂1.2.5 牦牛MY L 3蛋白的生物信息学分析 利用P r o t P a r a m (h t t p s ://w w w.e x p a s y .o r g /r e s o u r c e s /p r o t pa r a m )分析MY L 3蛋白的理化性质,利用P r o t S c a l e (h t t p s ://w eb .e x p a s y .o r g /pr o t s c a l e /)分析蛋白质的亲疏水性,利用N e t P h o s (h t t p://w w w.c b s .d t u .d k /s e r v i c e s /N e t P h o s /)进行蛋白磷酸化位点和N e t N G l y c 1.0(h t t p ://w w w.c b s .d t u .d k /s e r v i c e s /N e t P h o s /)N -糖基化位点的预测,利用S i g-n a l P -5.0(h t t p ://w w w.c b s .d t u .d k /s e r v i c e s /S i g -n a l P /)软件预测蛋白信号肽剪切位点,利用T M -HMM -2.0(h t t ps ://s e r v i c e s .h e a l t h t e c h .d t u .d k /s e r v i c e s /T MHMM -2.0/)分析蛋白跨膜结构,利用WO L F P S O R T (h t t p s ://w w w.g e n s c r i pt .c o m /w o l f -ps o r t .h t m l )预测亚细胞定位,利用S O P MA (h t t p s ://n p s a -p r a b i .i b c p .f r /c g i _b i n /n ps a -a u t o -m a t .p l p a g e =n p s a _s o p m a .h t m l #o pe n n e w w i n -d o w )和S W I S S -MO D E L (h t t p://s w i s s m o d e l .e x -p a s y .o r g /w o r k s p a c e )预测蛋白质二级结构及三级结构,利用S T R I N G (h t t p s ://s t r i n g -d b .o r g/)预测蛋白质互作网络关系㊂1.2.6 牦牛M Y L 3基因的R T -qP C R 检测 选用G A P D H 作为内参基因,采用R T -qP C R 法检测M Y L 3基因在心脏㊁肝脏㊁脾脏㊁肺脏㊁睾丸㊁肌肉和脂肪组织中的表达水平㊂反应体系为10μL :S Y B R3第4期张梦帆,等:牦牛M Y L 3基因的克隆及组织表达分析G r e e n P r o T a q HS q P C R 酶5μL ,d d H 2O 3.4μL ,上下游引物(10μm o l /L )各0.4μL ,c D N A 0.8μL ㊂P C R 扩增程序:95ħ预变性30s ;95ħ变性5s,63.3ħ退火30s ,45个循环;95ħ5s ,65ħ60s㊂观察荧光信号㊂每个样品3次重复㊂1.3 数据统计分析以肺脏组织作为参照组,采用2-ΔΔC t方法计算并比较M Y L 3基因在其他组织中的相对表达量㊂采用A N O V A 进行单因素方差分析,利用G r a p h -P a d P r i m 8.0进行数据分析和制图㊂2 结果与分析2.1 牦牛M Y L 3基因C D S 区序列的克隆牦牛M Y L 3基因C D S 区扩增结果如图1所示,在851b p 处出现清晰明亮的特异性条带,与预期条带长度相符㊂将扩增结果良好的样品切胶回收,与pM D 19-T 载体连接进行克隆,得到的菌液送至擎科生物技术有限公司(西安)测序,确定牦牛M Y L 3基因C D S 区克隆成功㊂2.2 牦牛M Y L 3基因的C D S 区序列分析用B i o e d i t 对序列进行比对分析,结果表明,牦牛M Y L 3基因序列C D S 区长600b p (含起始密码子A T G ),共编码199个氨基酸㊂利用N C B I 中的序列分析工具寻找M Y L 3的开放阅读框(O R F ),结果显示共含5个O R F 区㊂序列分析结果显示,M Y L 3基因C D S 区A ㊁C ㊁T ㊁G 的碱基含量分别为25.17%,28.67%,30.50%和15.67%,G+C 含量(59.17%)高于A+T 含量(40.83%),表明该基因C D S 区D N A 双链结构较为稳定㊂将测序结果与G e n B a n k 中牛M Y L 3基因(G e n B a n k 登录号为:NM _001076501.2)进行比对,结果发现第165位碱基发生了A>T 突变(图2);蛋白序列比对发现,第55位氨基酸并未因突变发生变化(图3),因此推断该突变属于同义突变㊂M.D L 2000D N A M a r k e r ;1㊁2.M Y L 3基因P C R 产物M.D L 2000D N A M a r k e r ;1,2.P C R p r o d u c t i o n o f M Y L 3g e n e图1 牦牛M Y L 3基因的P C R 扩增F i g .1 P C R a m pl i f i c a t i o n o f M Y L 3g e n e i n y a k 图2 牦牛与牛M Y L 3基因的突变位点分析F i g .2 A n a l ys i s o f M Y L 3g e n e m u t a t i o n s i t e s i n y a k a n d c a t t le 图3 牦牛与牛M Y L 3基因编码蛋白的氨基酸序列对比F i g .3 C o m p a r i s o n o f a m i n o a c i d s e qu e n c e s o f M Y L 3g e n e i n y a k a n d c a t t l e 2.3 牦牛M Y L 3基因及其编码蛋白相似性比对和进化树构建2.3.1 M Y L 3基因及其编码蛋白相似性比对 利用D N A s t a r 将测序所得牦牛M Y L 3基因的核苷酸和氨基酸序列,与G e n B a n k 数据库中牛㊁犏牛㊁美洲野牛㊁山羊㊁绵羊㊁白尾鹿㊁欧洲马鹿㊁单峰驼等8个物种的序列进行相似性比对,结果(表2)显示,牦牛与普通牛M Y L 3基因C D S 区核苷酸序列的相似性4西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷高达99.9%,与其他物种的相似性均大于90.0%㊂氨基酸序列相似比对结果与此类似,其中牦牛与牛㊁犏牛和美洲野牛的氨基酸序列相似性高达100.0%,说明此基因保守程度较高㊂表2牦牛M Y L3基因核苷酸和氨基酸序列的相似性分析T a b l e2 S i m i l a r i t y a n a l y s i s o f n u c l e o t i d e a n d a m i n o a c i d s e q u e n c e s o f y a k M Y L3g e n e%物种S p e c i e s123456789 199.999.799.797.897.395.796.393.0 2100.099.599.597.797.195.596.292.8 3100.0100.099.396.996.595.195.691.8 4100.0100.099.697.096.895.095.792.2 597.597.595.795.398.794.896.192.2 696.596.596.596.599.094.596.293.1 797.097.095.795.396.697.597.390.5 897.097.096.195.796.196.598.792.0 993.093.093.093.093.593.095.095.0注:1.牦牛;2.牛;3.犏牛;4.美洲野牛;5.山羊;6.绵羊;7.白尾鹿;8.欧洲马鹿;9.单峰驼㊂右上三角表示核苷酸序列相似性,左下三角表示氨基酸序列相似性㊂N o t e:1.Y a k;2.B o s t a u r u s;3.B o s i n d i c u sˑB o s t a u r u s;4.B i s o n b i s o n b i s o n;5.C a p r a h i r c u s;6.O v i s a r i e s;7.O d o c o i l e u s v i r g i n i a m u s t e x-a n u s;8.C e r v u s e l a p h u s;9.C a m e l u s d r o m e d a r i u s.T h e u p p e r r i g h t t r i a n g l e r e p r e s e n t s n u c l e o t i d e s e q u e n c e a c i d s i m i l a r i t y,t h e l o w e rl e f t t r i a n g l e r e p r e s e n t s a m i n o s e q u e n c e s i m i l a r i t y. 2.3.2 M Y L3基因进化树构建结果将牦牛M Y L3基因核苷酸序列与上述8个物种的M Y L3核苷酸序列进行比对,利用M E G A11软件采用邻接法构建系统发育分析树㊂结果(图4)显示,牦牛与普通牛的亲缘关系最近,与单峰驼的亲缘关系最远㊂图4基于M Y L3基因序列的牦牛系统进化分析F i g.4 P h y l o g e n e t i c a n a l y s i s o f y a k b a s e d o n M Y L3g e n e s e q u e n c e2.4牦牛MY L3蛋白的生物信息学分析2.4.1理化性质分析由P r o t P a r a m软件预测结果可知,牦牛MY L3蛋白分子式为C970H1543N254O302S11,分子质量为3071u,所含氨基酸数目及比例见表3㊂MY L3的理论等电点为5.00,带负电残基(A s p+G l u)总数为35个,正电荷残基(A r g+L y s)总数为26个㊂牦牛MY L3的不稳定指数为49.17,大于40,其蛋白结构稳定性较差,为不稳定蛋白㊂表3牦牛MY L3蛋白中的氨基酸数量及其占比T a b l e3 N u m b e r a n d p r o p o r t i o n o f a m i n o a c i d s i n y a k MY L3p r o t e i n氨基酸A m i n o a c i d s数量N u m b e r比例/%P r o p o r t i o n氨基酸A m i n o a c i d s数量N u m b e r比例/%P r o p o r t i o n 丙氨酸A l a2010.1赖氨酸L y s2110.6精氨酸A r g52.5甲硫氨酸M e t84.0天冬酰胺A s n63.0苯丙氨酸P h e105.0天冬氨酸A s p126.0脯氨酸P r o189.0半胱氨酸C y s31.5丝氨酸S e r52.5谷氨酰胺G l n73.5苏氨酸T h r115.5谷氨酸G l u2311.6异亮氨酸I l e73.5甘氨酸G l y31.5酪氨酸T y r31.5组氨酸H i s71.5缬氨酸V a l94.55第4期张梦帆,等:牦牛M Y L3基因的克隆及组织表达分析2.4.2亲疏水性预测预测结果(图5)显示,牦牛MY L3蛋白的疏水性值在第87㊁88位最高(2.344),在第240㊁241位最低(-0.222),亲疏水性平均值为-0.617,小于0,因此推测牦牛MY L3蛋白为亲水性蛋白㊂2.4.3磷酸化位点和N-糖基化位点预测牦牛MY L3蛋白的磷酸化位点预测结果(图6)显示, MY L3蛋白存在8个潜在的磷酸化位点,其中包括2个丝氨酸磷酸化位点㊁5个苏氨酸磷酸化位点和1个酪氨酸磷酸化位点㊂N-糖基化位点预测显示,牦牛MY L3蛋白共存在2个N-糖基化位点,分别位于第90位与第149位㊂图5牦牛MY L3蛋白的亲疏水性预测F i g.5 H y d r o p h i l i c i t y p r e d i c t i o n o f MY L3p r o t e i n i n y ak图6牦牛MY L3蛋白的磷酸化位点预测F i g.6 P r e d i c t i o n o f p h o s p h o r y l a t i o n s i t e s o f MY L3p r o t e i n i n y a k2.4.4信号肽及跨膜结构预测信号肽是新合成多肽链中用于指导蛋白质跨膜转运的短肽序列[20]㊂S i g n a l P-5.0预测结果表明,牦牛MY L3蛋白不存在氨基酸的信号肽㊂T MHMM-2.0预测结果显示,牦牛MY L3蛋白不存在跨膜结构,因此该蛋白不属于分泌蛋白㊂2.4.5亚细胞定位亚细胞定位发现,牦牛MY L3蛋白主要在细胞质(39.1%)㊁细胞核(26.1%)㊁线粒体(26.1%)内分布㊂在液泡(4.3%)和分泌细胞的囊泡(4.3%)内也有少量分布㊂2.4.6二级结构和三级结构预测用S O P MA和S W I S S-MO D E L对牦牛MY L3蛋白进行二级和三级结构预测,其中二级结构预测结果显示,MY L3蛋白的二级结构主要由ɑ-螺旋(49.25%)㊁延伸链(7.04%)㊁β-转角(6.03%)和无规则卷曲(37.69%)组成㊂蛋白质三级结构预测结果显示,MY L3蛋白以α-螺旋为主,与预测的二级结构基本一致㊂2.4.7 互作网络预测和功能富集分析利用S T R I N G预测牦牛MY L3蛋白的互作网络,结果见图7㊂A C T C1.肌动蛋白α心肌1;MY L P F.快肌肌浆球蛋白可调节磷酸化轻链;T N N T2.肌钙蛋白T2(心脏型);MY H.肌球蛋白重链;MY L.肌球蛋白轻链A C T C1.A c t i n a l p h a c a r d i a c m u s c l e1;MY L P F.M y o s i n l i g h t c h a i n,p h o s p h o r y l a t a b l e,f a s t s k e l e t a l m u s c l e;T N N T2.T r o p o n i nt y p e2(c a r d i a c);MY H.M y o s i n h e a v y c h a i n;MY L.M y o s i n l i g h t c h a i n图7牦牛MY L3蛋白互作网络预测F i g.7 P r e d i c t i o n o f MY L3p r o t e i n i n t e r a c t i o nn e t w o r k i n y a k6西北农林科技大学学报(自然科学版)第52卷图7显示,与MY L 3具有互作关系的蛋白有MY L 2㊁MY L 4㊁MY L 7㊁快肌肌浆球蛋白可调节磷酸化轻链(m y o s i n l i g h t c h a i n ,p h o s p h o r yl a t a b l e ,f a s t s k e l e t a l m u s c l e ,MY L P F )㊁肌钙蛋白T 2(心脏型)(t r o p o n i n t y pe 2(c a r d i a c ),T N N T 2)㊁肌动蛋白α心肌1(a c t i n a l ph a c a r d i a c m u s c l e 1,A C T C 1)㊁肌球蛋白重链6(m y o s i n h e a v y ch a i n 6,MY H 6)等㊂G O 和K E G G 富集结果显示,其与骨骼肌的生长发育调控和心肌收缩密切相关,因MY L 3蛋白富集于A pe l i n 信号通路上[21],可推测其对血管收缩和扩张㊁血压和血流控制㊁心脏收缩力强弱等都有一定的影响㊂2.5 牦牛M Y L 3基因的组织表达模式R T -q P C R 分析结果(图8)显示,M Y L 3基因在牦牛心脏㊁肝脏㊁脾脏㊁肺脏㊁睾丸㊁肌肉和脂肪组织中均有表达,其中在心脏中的表达水平最高,极显著高于其他组织(P <0.01);其次是肌肉组织,表达水平极显著高于除心脏外的其他组织(P <0.01);肝脏和脾脏中的表达水平较低㊂图柱上标不同小写字母表示差异显著(P <0.05),标不同大写字母表示差异极显著(P <0.01)D i f f e r e n t l o w e r c a s e l e t t e r s i n d i c a t e s i gn i f i c a n t d i f f e r e n c e s (P <0.05)a n d d i f f e r e n t c a p i t a l l e t t e r s i n d i c a t e e x t r e m e l ys i gn i f i c a n t d i f f e r e n c e s (P <0.01)图8 牦牛M Y L 3基因的组织表达模式F i g .8 E x pr e s s i o n d i f f e r e n c e o f M Y L 3g e n e i n d i f f e r e n t t i s s u e s o f y a k3 讨 论牦牛肉富含矿物质,脂肪中含有胡萝卜素,但脂肪的含量较低[22]㊂与普通牛相比,牦牛的肌纤维更粗,脂肪沉积率低,嫩度较差,因此牦牛肉口感较为粗糙[23],同时牦牛肌肉生长较为缓慢,其肉质性状受多种与脂肪酸合成和代谢相关的基因调控[24]㊂在新疆褐牛与哈萨克牛的对比试验中,哈萨克牛M Y L 3基因的高表达会促进肌纤维的生长,但是会阻碍I M F 的沉积,因而导致肉质整体较粗糙,嫩度低;而新疆褐牛M Y L 3基因的低表达不仅促进I M F 的沉积,有助于肉品嫩度的提升,而且产肉速度优于哈萨克牛[25]㊂因此可以推测M Y L 3的下调有助于肌间脂肪的沉积,且对肌肉生长发育的影响较小㊂MY L 3作为能够调节肌肉生长发育的肌动蛋白,其基因表达水平对动物肉质存在一定影响㊂L ópe z -P e d r o u s o 等[26]研究发现,M Y L 3与鹿肉的嫩度和I M F 密切相关㊂X i e 等[27]研究证明,M Y L 3是山羊肌肉韧性的潜在分子标记㊂目前M Y L 3基因在普通牛[5]㊁绵羊[28]㊁北京鸭[29]等动物上也有研究,但在牦牛上还鲜有报道㊂本研究对牦牛与普通牛㊁犏牛㊁绵羊㊁非洲野牛㊁山羊等物种进行了同源性分析,牦牛与所选物种的核苷酸序列同源性均在90.0%以上㊂说明M Y L 3基因在进化过程中高度保守,符合生物进化特征㊂此外,M Y L 3基因C D S 区序列相似性与氨基酸序列分析结果基本一致,说明M Y L 3在多个物种间高度保守㊂这与在绵羊[30]㊁北京鸭[29]㊁布莱德黑牛[5]等物种上M Y L 3基因的研究结论相同㊂本研究得到牦牛M Y L 3基因C D S 区长600b p,共编码199个氨基酸㊂对牦牛MY L 3蛋白进行理化性质分析发现,其分子式为C 970H 1543N 254O 302S 11,分子质量为3071u ,理论等电点为5.00,为不稳定蛋白,水溶性蛋白,且具有良好的亲水性,与绵羊MY L 3蛋白性质[28,30]相近㊂牦牛与布莱德黑牛[5]的MY L 3蛋白二级结构相同,即以α-螺旋为主,较多无规则卷曲,β-转角较少,易形成球状蛋白,且水溶性较好,符合上述试验预测的平均亲水性强的特征[29]㊂牦牛MY L 3蛋白中不存在信号肽识别位点且不存在跨膜区,这与对北京鸭[29]和绵羊[30]的研究结论相同,不属于分泌蛋白㊂磷酸化位点预测结果表明,牦牛MY L 3蛋白存在8个潜在的磷酸化位点和2个潜在的N -糖基化位点,绵羊[30]和北京鸭[29]MY L 3蛋白也有2个潜在的N -糖基化位点㊂蛋白质磷酸化参与调节基因表达㊁信号转导㊁细胞分裂等多种生命活动[31]㊂MY L的磷酸化与肌球蛋白的活性相关,其中MY L 3蛋白磷酸化可影响心肌的收缩[32-34]㊂糖基化影响蛋白质的功能[35],但MY L 3蛋白存在的糖基化位点对于肌球蛋白功能的影响还有待研究㊂亚细胞定位显示,MY L 3主要位于细胞质内;蛋白质互作网络分析显示,MY L 3与MY L 2㊁MY L 4㊁7第4期张梦帆,等:牦牛M Y L 3基因的克隆及组织表达分析MY L7㊁MY L P F㊁T N N T2㊁A C T C1㊁MY H6等蛋白存在互作关系,这些互作蛋白对心脏收缩[36-37]㊁肌纤维生长[38]与脂肪沉积[39]有一定的影响,因此推测MY L3与心肌收缩和肌肉生长发育具有一定的关联性㊂C h e n等[40]证明,M Y L3基因在猪的背最长肌中表达,猪肌肉发育得益于M Y L3基因表达量的上调㊂M Y L3基因在小尾寒羊的心肌中表达量最高,其次为骨骼肌,在脾和卵巢组织中有少量表达,在血管㊁肺脏㊁胃㊁肝脏中均无表达[28]㊂M Y L3在肉牛的心脏和背最长肌中有较高表达,在肝脏㊁脾脏等组织中几乎不表达[5]㊂本研究结果显示,牦牛M Y L3基因在心脏中的表达量最高,其次是肌肉,在其他组织中表达量都很低,这与上述研究结果相似㊂说明M Y L3基因与心肌㊁肌肉的生长发育和肌内脂肪的沉积密切相关,推测降低M Y L3表达量可以达到丰富牦牛肌间脂肪的目的,但这还需进一步的试验验证;除此之外,还需研究M Y L3表达量下调对牦牛肌肉带来的影响㊂[参考文献][1]马志远.牦牛舍饲育肥的氨基酸和矿物质营养调控效应研究[D].兰州:兰州大学,2021.M a Z Y.R e s e a r c h o n t h e n u t r i t i o n a l r e g u l a t i o n e f f e c t s o f a m i n oa c i d a n d m i n e r a l s i n f e e d l o t y a k s[D].L a n z h o u:L a n z h o u U n i-v e r s i t y,2021.[2]冉宏标,王会,柴志欣,等.m i R-138靶向P G C-1α调控牦牛肌内前体脂肪细胞增殖及分化[J].畜牧兽医学报,2022,53(10):3434-3447.R a n H B,W a n g H,C h a i Z X,e t a l.m i R-138r e g u l a t e s p r o l i f e r a-t i o n a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f i n t r a m u s c u l a r p r e a d i p o c y t e b y t a r g e-t i n g P G C-1αi n y a k[J].A c t a V e t e r i n a r i a e t Z o o t e c h n i c a S i n i-c a,2022,53(10):3434-3447.[3] W i g m o r e P M,S t i c k l a n d N C.M u s c l e d e v e l o p m e n t i n l a r g e a n ds m a l l p i g f e t u s e s[J].J o u r n a l o f A n a t o m y,1983,137(P t2): 235-245.[4]周瑞雪,蒙涛,褚武英,等.鳜肌球蛋白轻链2基因c D N A的克隆及其发育表达分析[J].湖南师范大学自然科学学报, 2009,32(3):78-83.Z h o u R X,M e n g T,C h u W Y,e t a l.c D N A c 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