甲醇营养型酵母表达系统

Pichia酵母表达系统使用心得甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。

虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。

不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。

其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。

甲醇酵母部分优点：1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达；2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，表达产物可以达到每升数克的水平；3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产；4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化；5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源，生产成本低。

产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。

巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。

毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。

甲醇诱导酵母表达是一种基因工程技术，它的原理是利用受体与配体相结合的原理，通过添加甲醇到培养基中，从而诱导酵母表达特定的外源基因。

这里的“受体”是一种称为Mxr1的转录因子，它不含甲醇时处于非活性状态，加入甲醇后与其配体Met4结合形成活性形式。

而Met4是Mxr1的配体，等待激活Mxr1转录因子的信号来自于甲醇的代谢产物-甲醛。

当酵母中有外源基因需要表达时，可以将该基因与Mxr1和Met4组成的启动子串联起来，在培养基中添加甲醇后，促使Mxr1与Met4相结合，使得启动子被活化，从而使外源基因得以表达。

基于此原理，甲醇诱导酵母表达技术可以实现高效和可控的外源基因表达。

甲醇的使用量可以在一定范围内调节外源基因表达水平，使得表达能够满足研究或应用的需求。

该技术不仅应用于科学研究，如蛋白质的产生与纯化等，还在药物和生物燃料等领域有广泛应用。

一、菌种1.大肠杆菌一种克隆感受态（JM109，DH5α，TG1，TOP10）2.毕赤酵母菌.GS115,甲醇利用正表型(Mu+)。

培养基含有甲醇时，菌正常生长，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子中，Mu+和Muts两种表型都有，需要在MM 和MD培养基上鉴定表型，转化整合效率高。

KM71H, 甲醇利用慢表型(Muts)。

培养基含有甲醇时，菌生长比野生株缓慢，组表达载体转化KM71H后，长出的转化子中，都是Muts表型，不需Mu表型鉴定。

SMD1168(Mu+)，蛋白酶缺陷型宿主菌，降低了目的蛋白被蛋白水解酶降解的风险。

二、毕赤酵母菌分泌表达载体诱导型启动子：pPIC9K，采用α因子信号序列，含卡那抗性基因，可用遗传霉素筛选外源基因多拷贝转化子。

（无标签）pPICZαA，采用α因子信号序列，具有博来霉素抗性基因，易于筛选阳性多拷贝转化子。

（有标签）组成型启动子：pGAPZα，采用α因子信号序列，具有博来霉素抗性基因，易于筛选阳性多拷贝转化子。

（有标签）另外，大肠杆菌表达载体pCold也可以进行诱导分泌表达蛋白。

三、实验试剂限制性内切酶EcoRI，NotI，NcoI，Sac I，T4DNA连接酶，Takara公司G418（遗传霉素），葡萄糖，生物素，甲醇，山梨醇，甲醛，咪唑，Na2S203，酵母氮源(YNB)，含His的补充培养基，酵母基因组DNA纯化试剂盒，大肠杆菌质粒提取试剂盒，0.2μm无菌滤膜。

四、实验简要计划用软件对pET28a-重组人胰岛素质粒进行EcoRI，NotI，NcoI酶切位点分析发现，NotI 在NcoI位点的上游，并且都是单酶切位点。

所以可以通过EcoRI和NotI对重组大肠杆菌质粒双酶切获取目的基因，这对目的基因的阅读框无影响。

通过EcoRI和NotI对酵母表达载体双酶切，可以获得载体片段。

将获得的载体片段与目的基因用T4 DNA连接酶4摄氏度连接过夜，并转化到大肠杆菌克隆感受态中，在抗生素培养基中培养，提取质粒进行酶切及PCR鉴定正确后，送去测序。

甲醇营养型毕赤酵母表达系统介绍巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是近几年发展起来的较为完善的、
被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统。

目前通过毕赤
酵母表达了很多种性质不同的蛋白，越来越多的实验室及公司开始搭
建毕赤酵母表达系统的平台，相信随着对毕赤酵母表达系统的研究越
来越深入，会有更多成功表达并进行商业化应用的案例出现。

1.其优点主要为：
1) 具有强有力的乙醇氧化酶(Alochol Oxidase，AOX1)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；
2) 作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，
从而使表达出的蛋白具有生物活性；
3) 营养要求低、生长快、培养基廉价，便于工业化生产； 4) 可高密度发酵培养，在发酵罐中细胞干重甚至可达120g/L以上； 5) 表达量高，许多蛋白可达到g/L以上水平；
6) 在P. pastoris中表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外，
自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化；
7) 糖基化程度低，与S. cerevisiae相比，P. pastoris不产生过度的糖基化。

P. pastoris表达的糖蛋白的糖链长度为8-14个甘露糖，而S. cerevisiae 糖链中甘露糖多达50-150个；S. cerevisiae分泌的糖蛋白的核心寡聚糖具有终端α-1，3糖苷连接，使分泌的糖蛋白的抗原性明
显增强，而P.pastoris的糖基化位点与哺乳类细胞的相同，其所分泌
的糖蛋白的免疫原性较低，更利于临床应用。

酵母表达系统研究概述田晓娟【摘要】目前常用的外源基因表达系统主要分为两类:原核表达系统和真核表达系统.前者主要包括大肠杆菌表达系统和枯草杆菌表达系统,后者一般包括酵母表达系统、昆虫/杆状病毒表达系统、哺乳动物细胞表达系统以及新兴的转基因植物表达系统等.在这众多的表达系统中酵母表达系统因其培养比较方便、简单、价格低廉、外源蛋白表达量高、表达的蛋白活性好、能进行翻译后修饰等诸多优点脱颖而出,成为目前最主要的外源基因表达系统.概述了常见的几种酵母表达系统的特点,并对发酵过程中影响外源蛋白表达量的因素做了探讨,以期为人们表达重组蛋白时选择合适的表达系统和获得高效的表达产物提供帮助.【期刊名称】《陇东学院学报》【年(卷),期】2018(029)001【总页数】5页(P72-76)【关键词】酵母表达系统;外源基因;蛋白表达【作者】田晓娟【作者单位】陇东学院岐伯医学院,甘肃庆阳 745000【正文语种】中文【中图分类】R379.9;Q93-33酵母常被广泛地用于生产医用或有工业前景的重组蛋白。

为了高效获得某种单一的蛋白产物，首先必须考虑目的蛋白本身的特点、宿主菌的特性等问题，以确定和优化它的最适表达系统。

酵母表达系统有众多品质优良的宿主菌株，包括酿酒酵母、毕赤酵母、多形汉逊酵母、乳酸克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母和Arxula adeninivorans等。

与多数复杂的真核生物不同，酵母表达系统比较经济节约，能快速地达到较高的细胞密度，产生高浓度的蛋白，并且不含有致热源、病原体和病毒夹杂物；具有良好的耐热性；能利用一些罕见的不易被其他生物利用的碳源；有些菌株还进行了一些更具优势的加工，例如人源化的糖基化、缺失一些蛋白酶等。

此外，它们使用各种各样的载体、启动子和选择性标记以供选择。

酵母因其单细胞生物的这种优势和独特的翻译后修饰的能力，使得它们已经广泛地用于生产工业化的重组蛋白(如核糖体蛋白)。

随着工业化发酵工艺知识的积累和目前基因工程技术的发展，有望设计出更符合成本效益的表达系统，以满足日益增长的对重组蛋白和糖蛋白的需求。

甲醇营养型酵母表达系统甲醇营养型酵母包括汉森酵母属(Hansenula)，毕赤酵母属(Pichia)，球拟酵母属(Torulopsis)等，能在以甲醇为唯一能源和碳源的培养基上生长，甲醇可以诱导它们表达甲醇代谢所需的酶，如醇氧化酶I(AOX1)，二羟丙酮合成酶(DHAS)、甲酸脱氢酶(FMD)等。

AOX1的甲醇诱导表达量可占胞内总蛋白质的20％~30％，表明AOX1的合成受转录水平的调控。

AOX1启动子(PAox )具有较高的调控功能，可用于外源基因的表达调控。

甲醇营养型酵母表达系统以巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统最为常用，它由野生型石油酵母Y11430突变而来，常用的3株宿主菌是GS115，KM71 和MC1o0-3。

GS115和KM71是Y1 1430的组氨醇脱氢酶基因(histidinol dehydrogenase gene，h/s 4)缺失突变体，不能合成H/s4，因此质粒载体需携带h/s4，转染后的阳性重组子可以用h/s4缺陷(h /s4-)平板进行筛选，但是GS115和KM71存在一定的低频率自发回变，即重新变为h/s正常菌株，致使h/s4’平板筛选阳性重组子存在假阳性情况。

GS115的启动子为P，在含甲醇的培养基中可以快速生长。

KM71的启动子为P，除了h/s4-外，其精氨酰琥珀酸裂解酶基因(argininosuccinate lyase gene，arg4)也被缺失突变，不能在缺乏Arg的培养基上生长。

KM71的基因型为h/s4 argaox1：：ARG4，由于野生型ARG4基因插入截断了AOX1，KM71只有依赖较弱的AOX2基因进行甲醇代谢，生长速度较为缓慢。

MCIO0-3的两个AOX基因都被剔除，其基因型为his4 arg4 aox1：：SARG4 OX2：：Phis4，完全不能在含甲醇的培养基上生长。

Pichia.pastoris酵母菌体内无天然质粒，所以表达载体需与宿主染色体发生同源重组，将外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达。

重组毕赤酵母产木聚糖酶摇瓶培养实验毕赤酵母简介甲醇营养型毕赤酵母(Pichia pastoris) 表达系统是80年代初被开发和研制的一种新型酵母表达系统。

40年前，Ogata等人首次发现有些酵母能够利用甲醇作为唯一的碳源和能源进行生长。

随后，甲醇营养酵母作为潜在的单细胞蛋白(single cell protein, SCP) 来源立即引起广泛关注，最初将其作为高蛋白的动物饲料在市场上销售。

在20世纪70年代，Phillips Petroleum公司开发出毕赤酵母利用甲醇生长的培养基、发酵操作手册和高密度连续培养生产工艺。

70年代的石油危机导致了甲烷价格的急剧上升，与此同时，动物饲料蛋白的主要替代源——大豆价格的下降，导致利用甲醇生产SCP在经济上已不再合适。

在以后的10年中，PhiLLips PetroLeum公司与SIBIA公司合作开发利用毕赤酵母作为生物体表达外源蛋白的研究，研究人员分离了醇氧化酶(alcohol oxidase, AOX) 的基因和启动子，构建了表达载体和菌株，开发了毕赤酵母基因操作相关技术。

成熟的SCP发酵方法的开发，加上醇氧化酶强启动子的可调控表达特性，极大地影响着外源蛋白在毕赤酵母中的高水平表达。

1993年，Phillips Petroleum公司委托Invitrogen公司代理毕赤酵母表达系统产品。

毕赤酵母能在以甲醇为唯一碳源的培养基中快速生长，其中醇氧化酶AOX ——甲醇代谢途径的关键酶可达细胞可溶性蛋白的30％。

而在葡萄糖、甘油或乙醇作为碳源的培养细胞中则检测不到AOX。

AOX的合成是在转录水平调控的。

其基因启动子具有明显的调控功能，可用于调控外源基因的表达。

此调控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊诱导机制控制的。

外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达。

巴斯德毕赤酵母中存在着一种称为微体的细胞器，其中大量合成过氧化物酶，因此也称为过氧化物酶体。

酵母菌对外源基因的表达也和外源基因密码子的选用有关。

了解表达系统宿主在密码子使用上的偏爱性对从翻译水平分析基因表达的规律有重要意义，也可为改造外源基因或改造宿主细胞提供依据。

如果外源基因密码子中存在过多的宿主低利用密码子，位于起始密码子附近的低利用密码子对基因的表达就会产生很大影响。

解决这一问题的方法有2种：一是通过点突变的方法用同义高利用率密码子替代低利用密码子而不改变氨基酸序列；另一方法是截取基因中影响其生物活性的部分。

目前，这些方法在甲醇酵母表达系统中都能提高表达水平。

外源蛋白的空间构象、糖基化位点、水溶特性、氨基酸组成以及其他的理化特点都会影响毕赤酵母对其分泌，所以应根据外源蛋白自身的理化特点来选择胞内表达或分泌型表达方式。

外源基因在酵母基因组中的整合数也可以影响外源基因的表达水平，应该选用高拷贝整合来提高外源基因的表达水平。

2、表达框的染色体整合位点和方式虽然相对于自主复制载体来讲，整合性载体的转化率较低，但由于Pp没有天然质粒，所以设计表达载体偏向于染色体整合，通过同源重组，载体整合到细胞染色体中间。

整合性载体具有表达框稳定和可控制整合位点等优越性，并且能够发生多位点整合而获得多拷贝。

AOX1和组氨酸脱氢酶(histidinol dehydrogenase，HIS4)基因位点都已被成功用于表达外源蛋白。

Sreekrishna等注意到his基因座的lacZ表达框偶有缺失。

这种缺失源于表达框中his4染色体突变拷贝与完好的his4基因的基因转换。

因此，看起来aox1位点是较为理想的位点。

3、宿主的甲基营养表型：Mut+或Muts用末端与aox1基因5'和3'端同源的线性DNA转化Pp HIS4菌株可导致Mx1结构基因的特异性剔除。

aox1基因缺失的酵母在甲醇限制性培养基上生长缓慢(methanol utilization slow , MutＳ或Mut-)，它们只能利用弱的aox2基因启动合成aox2基因启动合成AOX；而aox1基因完整的酵母则生长正常(Mut＋)。

服务简介酵母具有与其他真核生物类似的蛋白质分泌途径，外源基因的分泌表达, 不仅方便了表达产物的分离纯化, 同时也和表达产物的翻译后加工有关, 很有意义。

酵母表达系统是研究真核蛋白质表达和分析的有力工具，酵母外源基因分泌表达系统（简称酵母外泌表达系统）采用的宿主是巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris），该表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统。

服务原理甲醇酵母系统分泌表达载体巴氏毕赤酵母（Pichia pastoris）是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（Alcohol oxidase, AOX）编码基因AOX1和AOX2，两种序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。

当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。

服务优势1. 含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达。

2. 培养成本低，产物易分离，毕赤酵母所用发酵培养基成本合理，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化。

3. 外源蛋白基因遗传稳定，外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，不易丢失并能得到高表达菌株。

4. 作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。

酵母外泌表达系统的优势1. 具备完备的毕赤酵母表达平台，可以根据蛋白特性或客户的需求设计不同的实验方案；2. 具有高通量的筛选平台，可以快速有效的得到最佳表达条件；3. 具有大规模发酵生产能力服务内容科研人员建立了成熟的酵母表达纯化服务平台，提供优质的重组蛋白在毕赤酵母中的表达与纯化服务。

酵母外泌表达系统服务项目:1.重组酵母表达质粒构建；2.重组质粒电转化；3.重组表达子筛选；4.小规模蛋白表达和纯化（2L培养基培养产物）；南京瑞源生物技术有限公司坐落于南京市栖霞区生命科技园，专注于基因组高通量研究领域，致力于生物高科技研发，目前产品的技术水平已达到省级实验水平，瑞源生物立足于生命科学，为基础研究领域科学工作者提供生物学技术服务，自2019年创立以来，全体员工致力于利用酵母系统研发新药物靶点，专注于生物学研究，长期与全国各大农林/医药院校在大型科研技术研发上紧密合作。