PMA_qPCR定量检测畜禽肉类中沙门菌活菌的研究_於颖

PMA在活茵检测中的应用作者：朱延申来源：《畜牧兽医科学》 2018年第3期摘要：本文主要介绍一种活茵检测方法，即叠氮溴化丙锭( PMA)偶联荧光定量PCR的一种新的检测活菌的方法。

为相关研究者提供理论参考。

关键词：叠氮溴化丙锭；活菌检测；因素；应用中图分类号：R378. 2 文献标识码：B doi：10. 3969/j. i ssn. 2096-3637. 2018. 03. 0271叠氮溴化丙锭的介绍叠氮溴化丙锭( PMA)是一种光敏反应染料，它对DNA具有非常高的亲和力。

当细胞膜处于不完整状态或者细胞已经死亡，细胞膜对外界的物质的进出就没有了选择性，PMA就可以顺利进入细胞内，与DNA进行结合，在光照作用下发生交联反应。

交联后的DNA就不能作为模板进行扩增，残留在溶液中的未被结合的PMA在光照下与水分子形成羟胺化合物，从而阻止其与在提取过程中活菌产生的DNA结合，影响检测结果。

而对于活的细胞而言，细胞膜具有选择性，PMA便不能进入细胞内与DNA进行交联反应。

将PMA这种特性与荧光定量PCR技术进行偶联，便可以实现对活菌的检测。

2影响活菌检测的因素21采集的样品PMA偶联荧光PCR技术对样品的要求比较高。

有研究发现，环境中的样品，食品样品和临床上的病料中常常含有一些无机物质．有机物质。

这些物质的存在既可以降低PMA的有效浓度，也可以干扰PMA与核酸的交联反应。

详细的说，样品中的无机物和有机物会造成样品的浊度提高，样品越浑浊，光的透过性就越差，越影响PMA与样品在光照条件下的交联反应。

为了避免和减少因样品采集带来的误差，Luo等人在一项研究中提出，要严格规范浊度的阈值，这样对每一份样品检测具有更重要的意义和参考价值。

有研究表明，当样品的浊度达到10个散射浊度单位的时候，样品的浊度对于PMA交联DNA是没有影响的。

当样品的浊度高于10个散射浊度时，样品的浊度对于PMA交联DNA具有非常大的影响。

Real-time PCR方法检测肉品中的沙门氏菌方平;杨永莉;杨宝;王晓闻【摘要】应用SYBR Green I染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到沙门氏菌fimI基因特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,通过熔解曲线可知其熔点值约为85.6 ℃,而对其他非沙门氏菌则检测不到荧光信号.建立了一种肉品中的沙门氏菌Real-time PCR检测方法,用该方法检测市售牛肉、香肠中的沙门氏菌,其检测灵敏度分别为13,12 cfu/25 g,从样品的处理到得出检验结果可以在10 h内完成.该检测方法具有简便、快速、特异性强、敏感度高等特点.【期刊名称】《山西农业科学》【年(卷),期】2010(038)008【总页数】6页(P71-76)【关键词】沙门氏菌;Real-time PCR;快速检测;肉品【作者】方平;杨永莉;杨宝;王晓闻【作者单位】山西农业大学食品科学与工程学院,山西,太谷,030801;山西农业大学食品科学与工程学院,山西,太谷,030801;山西农业大学食品科学与工程学院,山西,太谷,030801;山西农业大学食品科学与工程学院,山西,太谷,030801【正文语种】中文【中图分类】TS207.4在我国，沙门氏菌污染引起的食物中毒占食源性疾病中细菌食物中毒病例的70%～80%[1]，且WHO已将沙门氏菌列入具有严重为害和中等为害的食物传播性病原[2]。

而沙门氏菌常规检测方法和普通PCR方法的灵敏度及检测所需要的时间还有待于进一步提高。

本研究用普通PCR方法检测引物对沙门氏菌的特异性，并用SYBR Green I作为荧光染料，拟用Real-time PCR方法检测熟制牛肉和香肠中沙门氏菌，以建立一种检测肉品中沙门氏菌速度快、灵敏度高的方法。

1 材料和方法1.1 主要材料与试剂试验样品：熟制牛肉（市售）、香肠（市售）。

试验菌株：沙门氏菌和非沙门氏菌标准菌株各10株（表1）。

SYBR Green I，dNTP，buffer，Taq 酶等均购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA Ladder购自天根生物（北京）有限公司。

利用荧光定量PCR检测方法对畜禽肉中沙门氏菌的污染调查曾艳兵;张莉;孙吉昌;严寒;谢智欣;尹德凤;罗林广【期刊名称】《农产品质量与安全》【年(卷),期】2012(000)0z1【摘要】为了解国内销售环节畜禽肉中沙门氏菌的污染状况,为我国畜禽肉中沙门氏菌的安全风险评估、预防控制食源性沙门氏菌疾病的爆发提供科学依据,2009-2011年,在东北、西北、华东地区各省区的农贸市场和超市随机抽取禽肉和猪肉样品共1779份采用荧光定量PCR的检测方法进行筛选,并对PCR阳性样品进行分离鉴定.结果发现在国内各省市抽取的畜禽肉产品中分别检测出沙门氏菌的污染率为5％～19.7％,平均污染率为12.5％.由此可见,畜禽肉中沙门氏菌对农产品质量安全存在隐患,给人们的食用安全带来极大威胁.【总页数】4页(P21-24)【作者】曾艳兵;张莉;孙吉昌;严寒;谢智欣;尹德凤;罗林广【作者单位】江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所,南昌 300200;江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所,南昌 300200;江西省疾病预防控制中心,南昌 330029;江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所,南昌 300200;江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所,南昌 300200;江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所,南昌 300200;江西省农业科学院农产品质量安全与标准研究所,南昌 300200【正文语种】中文【相关文献】1.利用荧光定量PCR技术鉴别畜禽肉中猪源性成分 [J], 陆俊贤;唐修君;樊艳凤;贾晓旭;葛庆联;顾荣;王珏;高玉时2.利用荧光定量PCR检测方法对畜禽肉中沙门氏菌的污染调查 [J], 曾艳兵;张莉;孙吉昌;严寒;谢智欣;尹德凤;罗林广;3.贝类中副溶血弧菌和沙门氏菌荧光定量PCR快速检测方法的建立 [J], 倪梦丽;杨冰;王春德;陈颖;孙善华4.牛乳中沙门氏菌的荧光定量PCR检测方法的建立 [J], 姚笛;徐磊;佐兆杭;侯婷婷;郭瑜5.实时荧光定量PCR技术在畜禽肉类检测中的应用 [J], 夏澜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

208肉鸡饲养加工过程中沙门菌污染环节的探讨与分析汲如芬1 程 瑞1 马金波1 史 林1 吴志勇1 柴卫华2（1.邯郸市畜牧技术推广站，河北邯郸 056001；2.邯郸市饲料工业办公室，河北邯郸 056001）摘 要：我国的禽肉生产能力位居世界前位，每年进行交易的禽肉数量也十分庞大，但是在肉鸡饲养加工过程中可能会受到沙门菌的污染，如果没有在这一环节对沙门菌进行有效的防治，沙门菌在人们食用肉鸡时就会对人的身体健康造成威胁，所以做好沙门菌污染防治工作非常有必要。

本文以此为基础，对肉鸡饲养加工过程中沙门菌污染环节做出探讨，并对相关数据进行分析，以此为相关工作提供建议。

关键词：肉鸡；饲养加工；沙门菌；污染环节沙门菌是一种肠道致病菌，常常因为误食不洁食物而引起，感染者出现会严重腹泻的现象。

鸡肉含有大量的蛋白质，可以给人们带来大量的营养。

而肉鸡则是沙门菌最常见的宿主，人们如果食用了带有沙门菌得鸡肉，可能会引发细菌性食物中毒和食原性疾病。

这就需要在肉鸡饲养加工过程中掌握消除沙门菌污染的方法，人们食用不含有沙门菌的肉鸡才可以提高人们的饮食健康以及身体健康。

所以，对肉鸡饲养加工过程中沙门菌污染环节进行探讨，具有十分重要的现实意义。

1 实验材料与相关手段1.1 样本的采取对于肉鸡样本的采取要分批次进行，以一个季度作为采取样本的一个时间点，将所采取到的样本全部运送至实验室并且使样本在合理的温度内进行保存，在运送过程中注意对每一个样本的保护，避免出现样本交叉感染的现象。

1.2 实验仪器与试剂整个实验要使用全自动微生物鉴定分析系统来进行，使用相关的VITEK系列仪器以及GNI测试卡对所采取的样本进行监测。

另外，还要采用相关的沙门菌鉴定生化套盒以及血清。

所有的仪器与试剂要在适用期内使用，按照相关说明规范的进行测试。

1.3 实验方法在对沙门菌进行检测之前，要先称取固态样本25g放入到225ml的沙门菌一步增菌液当中，然后分别在100ml和250ml的沙门菌一步增菌液中加入分割刀具和案板样本的涂抹拭子；再将用无菌海绵拭子涂抹过的活胚加入到10ml的沙门菌一步增菌液当中，最后在37°下培养24h。

PMA－qPCR 定量检测畜禽肉类中沙门菌活菌的研究於颖;王文静;陆晔【摘要】Objective To enumerate Salmonella in meat of livestock and poultry rapidly and accurately by using propidium monoazide( PMA) combined with real-time fluorescence quantitation polymerase chain reaction ( qPCR). Methods The light exposure time and the concentration of PMA were optimized to establish PMA-qPCR.The standard curve was established by standard plasmid.The sensitivity and specificity were investigated.This method was used for the quantitation determination of Salmonella in livestock and poultry meat.Results The amplification of DNA derived from Salmonella dead cells could be inhibited without affecting the viable cells when PMA was at a dose of 15 μg/mL and exposed for 5 min.The cycle threshold values(Ct) and standard plasmid model cell copy number presented the satisfactory linear, and the correlation coefficient r 2 approached 0.997 9.This method could detect as low as 10copies/reaction.The minimum detection level was 21 copies/μL by PMA-qPCR.In artificial chicken samples, PMA-qPCR could detect as low as 103 CFU/mL.Conclusions It was possible to quantify viable Salmonella in meat of livestock and poultry by PMA-qPCR.%目的：将叠氮溴化丙锭（PMA）与实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）相结合定量检测畜禽肉类中活的沙门菌。

PMA-qPCR方法快速检测活性E.coli O157：H7李聪聪;余以刚;邱杨;李美玲;肖性龙;吴晖【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2012(033)022【摘要】建立将叠氮溴化丙锭(PMA)与定量PCR(qPCR)技术结合，用于检测热灭活菌背景条件下的大肠杆菌活菌的方法。

结果表明：5min以上的强烈光照可以使PMA与DNA共价交联，同时完全钝化游离的PMA以避免“假阴性”结果；抑制死菌DNA扩增的最低PMA质量浓度为10μg/mL，不抑制活菌DNA扩增的最高PMA质量浓度为20μg/mL。

当活菌/总菌大于1%时，经PMA预处理，可以消除热灭活菌DNA的干扰，实现对活菌的定量检测。

【总页数】4页(P217-220)【作者】李聪聪;余以刚;邱杨;李美玲;肖性龙;吴晖【作者单位】华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640;华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640;东莞出入境检验检疫局，广东东莞 523072;华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640;华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640;华南理工大学轻工与食品学院，广东广州 510640【正文语种】中文【中图分类】TS207.4【相关文献】1.基于内参的大肠埃希氏菌O157:H7实时荧光定量PCR快速检测方法的建立 [J], 王建昌;王金凤;段永生;李静;陈志敏;陈瑞春2.E.coli O157:H7 LAMP检测方法的建立 [J], 朱海;吕敬章;范放;洪小柳;马淑棉;黄李华;刘慧玲3.福建省猪源E.coli O157∶H7和O157∶NM的药物敏感试验分析 [J], 徐海滨;郭维植;林杰;陈亢川4.IMSA技术快速检测肠出血大肠杆菌O157:H7方法的建立及应用 [J], 王琪;徐文娟;石盼盼5.Survey of O-islands in Escherichia coli O157 and Other Enteric Pathogens——O-islands of E.coli O157∶H7 [J], 徐建国;任志鸿;李新军;叶长芸;李振军;卢珊;逄波;白雪梅;吴龙飞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

不同方法检测鸡胴体中沙门菌结果的比较研究
卢行安;段莹;刘颜泓;孙海欧;崔秀云
【期刊名称】《中国微生态学杂志》
【年(卷),期】2007(19)3
【摘要】对鸡胴体淋洗液样品进行沙门菌检测,样品经过前增菌和选择性增菌后,分别采用4种不同的方法进行检测,即普通PCR方法、实时荧光PCR方法、免疫学方法(VIDAS)和传统的微生物检验方法。

共检测了56份样品,普通PCR检出阳性样品34份,实时荧光PCR阳性样品36份,VIDAS阳性样品28份;PCR和实时荧光定量PCR均无假阳性和假阴性结果。

结果显示该3种检测方法均可以用于鸡胴体中沙门菌的快速检测。

【总页数】3页(P259-260)
【关键词】鸡胴体;沙门氏菌;PCR;实时荧光PCR;VIDAS
【作者】卢行安;段莹;刘颜泓;孙海欧;崔秀云
【作者单位】大连医科大学;大连产品质量监督检验所;辽宁出入境检验检疫局【正文语种】中文
【中图分类】R378.22
【相关文献】
1.从家禽胴体不同部位取样进行沙门氏菌对比检测的试验初报 [J], 毛润梅;聂静
2.禽源沙门氏菌不同检测方法的比较及分型研究 [J], 程菡;王红宁;张安云;雷昌伟;刘必慧
3.DOT-ELISA检测牛胴体中的沙门氏菌 [J], 雷风;韩志辉;张红见
4.不同方法检测鸡白痢沙门氏菌抗体消长规律的比较研究 [J], 刘洋;李丹;王传彬;霍斯琪;刘玉良;顾小雪
5.鸡白痢沙门氏菌与其它致病性沙门氏菌的血清型特异性PCR鉴别检测方法的建立 [J], 张童利;王曼宇;曹俊;王忠星;刘思国;于申业
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肉及肉制品中沙门氏菌活细胞的PCR检测研究祝儒刚;宋立峰【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2012(033)016【摘要】将荧光染料叠氮溴化丙锭（propidium monoazide,PMA）与普通聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）结合,通过对PMA的曝光时间、浓度进行优化,确定PMA-PCR区别死活细胞的最佳条件,并制作活细胞定量标准曲线,建立肉及肉制品中沙门氏菌活细胞的PMA-PCR检测方法。

结果表明：使插入死细胞DNA中的PMA活化并且光解溶液中游离PMA的最佳曝光时间为15min;不抑制沙门氏菌活细胞DNA扩增的最大PMA质量浓度为10μg/mL;完全抑制热致死细胞DNA扩增的最小PMA质量浓度为4μg/mL。

经PMA处理,含有不同比例的沙门氏菌热致死细胞和活细胞的混合液中活的沙门氏菌能够通过PCR被选择性的检测,最小检测限为20CFU/PCR。

而且,经研究发现在20～2×105CFU/PCR 范围内,电泳条带相对荧光强度与活细胞数的对数具有线性关系。

采集30份肉及肉制品样品,利用PMA-PCR方法检测出两份生肉样品中存在沙门氏菌,经过6h的富集培养后的活菌浓度分别为2.5×103CFU/mL和3.4×103CFU/mL。

【总页数】5页(P199-203)【作者】祝儒刚;宋立峰【作者单位】辽宁大学轻型产业学院,辽宁省食品生物加工工程技术研究中心,沈阳市食品生物加工与质量控制技术重点实验室,辽宁沈阳110036;辽宁经济职业技术学院,辽宁沈阳110122【正文语种】中文【中图分类】TS201.6【相关文献】1.肉及肉制品中牦牛源性成分的PCR鉴别 [J], 段庆梓;尚柯;张彪;张玉;王巍;梁恒兴2.环介导等温扩增技术检测肉及肉制品中的沙门氏菌 [J], 王羽;王贞强;张伟3.应用二重PCR技术检测肉制品中的肉源性成分 [J], 李慧洁;蒋会敏;贾小同;李小艳;王利娜;尹皓月;李铀4.应用二重PCR技术检测肉制品中的肉源性成分 [J], 李慧洁;蒋会敏;贾小同;李小艳;王利娜;尹皓月;李铀5.肉及肉制品中6种致病菌的GeXP多重PCR检测 [J], 杨梦婕;徐玲丽;马学军;武桂珍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

猪肉中沙门氏菌的PCR检测杨永恒;樊明涛;李瑜;袁晖【期刊名称】《食品研究与开发》【年(卷),期】2009(030)005【摘要】选用合适的引物,利用PCR快速扩增反应检测猪肉中的沙门氏菌.根据沙门氏菌的Fimy基因设计一对引物,对不同血清型的沙门氏菌和非沙门氏菌进行PCR检测,沙门氏菌均能检测出特异条带,而非沙门氏菌无一能检测出特异条带.将沙门氏菌和非沙门氏菌混合培养,对混合培养物提取DNA模板进行检测,结果呈阳性,而不含沙门氏菌的混合培养物则没有特异条带;对模板进行梯度稀释后PCR扩增检测,当DNA含量只有0.045 ng/μL时仍能扩增出条带,将菌液进行梯度稀释后提取DNA模板,沙门氏菌含量在102cfu/mL时能被检测出来.【总页数】4页(P128-131)【作者】杨永恒;樊明涛;李瑜;袁晖【作者单位】西北农林科技大学,食品科学与工程学院,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,食品科学与工程学院,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,食品科学与工程学院,陕西,杨凌,712100;西北农林科技大学,食品科学与工程学院,陕西,杨凌,712100【正文语种】中文【中图分类】TS2【相关文献】1.生鲜猪肉中含扩增内标的沙门氏菌Real-time PCR检测方法的建立 [J], 姚大伟;叶可萍;江芸;徐幸莲;周光宏2.应用PCR技术检测猪肉中沙门氏菌的研究 [J], 刘胜贵;魏麟3.沙门氏菌检测中应用PCR法与传统细菌培养法检测的分析 [J], 刘莉莉4.不同非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒在检测猪肉及猪肉制品中的比较 [J], 韦莹;陈丽芸;刘闯;陈立军5.猪肉中沙门氏菌的分离鉴定及PCR快速检测分析 [J], 崔霞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

PMA—qPCR定量检测青枯菌活菌方法的建立作者：王帅徐进许景升来源：《植物保护》2018年第06期摘要本文将叠氮溴化丙锭（PMA）与荧光实时定量PCR技术相结合，建立了一种适于青枯菌不同小种菌株活细胞精准、快速检测的PMA-qPCR方法。

通过单因素变化试验对PMA预处理反应体系中的各参数进行优化，确立了PMA终浓度为15 ng/μL，黑暗孵育时间为10 min，曝光时间为5 min的PMA预处理体系。

试验结果表明，当活菌比例大于10%，PMA-qPCR的测定结果均在理论活菌数相对应的95%置信区间内。

检测灵敏度测试结果显示，该方法适用于活菌数在5.0×10.2～5.0×10.8 cfu/mL范围内菌悬液的检测。

本文建立的PMA-qPCR方法可在一定范围内有效去除青枯菌死菌的干扰，定量检测出活菌数量，研究结果可为植物细菌性青枯病的流行规律研究提供新的技术支撑。

关键词 PMA-qPCR；青枯菌；活菌检测中图分类号： S 435.32文献标识码： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2017483Abstract By combining propidium monoazide （PMA） with fluorogenic （TaqMan） PCR，we developed a novel method for specific detection of viable cells ofRalstonia solanacearum at species level. We optimized various parameters of PMA by single factor change test to establish the system of PMA pre-treatment. The optimal conditions for PMA-qPCR were： a final concentration of PMA of 15 ng/ mL， a dark incubation time of 10 min， and an exposure time of 5 min. The test results showed that， within the range of 50×10.2-5.0×10.8 cfu/mL， when the proportion of viable bacteria was greater than 10%， the results of PMA-qPCR were almost identical with the theoretical values. The method could effectively remove the interference of the dead cells ofR.solanacearum and quantitatively detect the number of viable cells， thereby providing a new technical support for the research of epidemiology of bacterial wilt caused byR.solanacearum.Key words PMA-qPCR； Ralstonia solanacearum； viable cell detection植物细菌性青枯病（bacterial wilt of plants）是由茄科雷尔氏菌Ralstonia solanacearum Yabuuchi（简称青枯菌）引起的一种世界性重大病害。

注：1-哈特福德沙门氏菌；2-大肠杆菌；3-印第安纳沙门氏菌；4-志贺氏菌；5-山夫登堡沙门氏菌；6-葡萄球菌；7-鼠伤寒沙门氏菌；8-柠檬酸杆菌；9-肠炎沙门氏菌；10-阴沟杆菌；11-德尔卑沙门氏菌。

图2　沙门氏菌和其他菌PCR扩增电泳图
2.2.2　实用性
用沙门氏菌与其他混菌、单菌对猪肉样品进行感染，经短期培养之后，提取DNA开展PCR扩增，其结果充分表明，
注：1-肠炎沙门氏菌；2-肠炎沙门氏菌和大肠杆菌；3-鼠伤寒沙门氏菌；4-鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌；5-大肠杆菌；6-志贺氏菌；7-大肠杆菌和志贺氏菌；8-大肠杆菌和葡萄球菌；9-志贺氏菌和葡萄球菌；10-葡萄球菌。

图3　混合培养物PCR扩增电泳图
在细菌浓度很高的情况下，全部的沙门氏菌阳性样品都可以扩增出特异性条带，混合培养物感染与纯菌感染的结果相同。

当细菌的浓度达到了103 cfu/mL的时候，纯菌感染样。

肉制品中沙门氏菌荧光定量PCR标准质粒的构建目的制备用于检测肉制品中沙门氏菌荧光定量PCR的标准质粒。

方法设计针对沙门氏菌invA基因的引物，扩增特异片段，转入质粒载体中构建重组质粒。

将构建的重组质粒作为标准品，进行优化后的实时荧光定量PCR，建立标准曲线，并考察该标准品灵敏性及稳定性。

结果成功构建含有沙门氏菌invA基因的质粒标准品，用其建立的标准曲线循环阈值（Ct值）与模板的拷贝数呈良好线性关系（r2=0.9979），最低可以检出10 拷贝/反应。

该标准质粒经验证具有良好的稳定性。

用该质粒标准品检测肉制品中的沙门氏菌，经2h增菌后，可在7h内完成对样本的检测。

结论所构建的质粒标准品可用于荧光定量PCR检测肉制品中的沙门氏菌，为考量实验质量提供参考依据。

标签：质粒标准品；荧光定量PCR；沙门氏菌；肉制品；当前，微生物污染引起的食源性疾病已引发人们的普遍关注和深入研究。

在各类食源性病原菌及危害因子中，沙门氏菌是主要致病因子[1]。

根据我国统计数据显示，由沙门氏菌导致的食源性疾病占总数的10.2%，且以肉制品受污染居多[2，3]。

建立有效手段快速检测肉制品中沙门氏菌，对防控和监测这类食源性疾病意义重大。

荧光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR）方法可快速并灵敏地对沙门氏菌进行检测，而拥有可靠的标准品保证了检测的稳定和可重复性[4]。

目前，获得荧光定量PCR标准品的方法有许多，包括菌液提取模板DNA、PCR扩增产物纯化、PCR扩增目的片段割胶纯化以及构建含与目的基因片段相同序列的重组质粒等，其中以质粒作为标准品最为稳定，且制备简单，使用方便。

本研究选择质粒作为荧光定量PCR的标准品，设计选取了沙门氏菌invA基因特异性片段，将其转入质粒载体中构建重组质粒，以此保证快速、准确检测肉制品中沙门氏菌，为快速检测该致病菌导致的食源性疾病提供技术依据。

用PCR技术检测动物产品中沙门氏菌的研究
沈孝民;涂书清
【期刊名称】《中国动物检疫》
【年(卷),期】1997(014)002
【摘要】用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术检测沙门氏菌，结果表明，对各种不同血清型的沙门氏菌和已知被该菌污染的鱼粉和动物产品的肉汤培养物均检出阳性，而其他的枸橼酸杆菌、奇异变形杆菌，大肠艾希氏杆菌、缓慢爱德华氏菌和嗜水气单胞菌等非沙门氏菌类，均为阴性。

证明本方法特异性高且有灵敏、快速等特点，适用于口岸检疫进出境动物产品快速、准确验放的需要。

【总页数】3页(P8-10)
【作者】沈孝民;涂书清
【作者单位】福州动植物检疫局;福建省计划生育科学技术研究所
【正文语种】中文
【中图分类】S852.612
【相关文献】
1.应用PCR技术同步检测动物产品中的4种致病菌 [J], 蒋鲁岩;陈光哲;段宏安;蔡宝亮;秦敏;张常印
2.肺炎支原体感染动物模型的建立以及PCR技术在感染检测中的应用与研究 [J], 辛德莉
3.肺炎支原体感染动物模型的建立以及PCR技术在感染检测中的应用与研究 [J], 辛德莉
4.多重PCR技术检测食用鱼类产品中β-溶血性嗜水气单胞菌毒性基因研究 [J], 余文杰
5.应用分子生物学技术检测布鲁氏菌抗原的研究——Ⅱ PCR技术在动物布鲁氏菌病早期诊断中的应用 [J], 唐浏英;邱海燕;李元凯
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PMA-qPCR快速检测畜禽肉类中沙门氏菌活菌方法的建立刘光富;马骉;付贤树;俞晓平【摘要】建立了一种将叠氮溴化丙锭(PMA)与实时荧光定量PCR(qPCR)技术相结合的检测方法,用于定量检测畜禽肉类中活的沙门氏菌.通过优化光反应时间、PMA 浓度等PMA作用条件,建立最优PMA-qPCR方法;同时构建重组质粒,并通过建立标准曲线考察该方法的灵敏度和特异性,然后将该方法用于定量检测未经增菌培养的畜禽肉类样品中的沙门氏菌.结果表明:在浓度12μg/mL、曝光时间6min的条件下,PMA的添加既不影响活菌的扩增,又能有效抑制死菌的扩增;采用PMA-qPCR 检测人工染菌猪肉样品,最低可检出10CFU/mL沙门氏菌.该方法可快速、定量地检测畜禽肉类样品中的沙门氏菌.【期刊名称】《中国计量大学学报》【年(卷),期】2018(029)004【总页数】6页(P362-366)【关键词】叠氮溴化丙锭;肠炎沙门氏菌;PMA-qPCR方法;活菌【作者】刘光富;马骉;付贤树;俞晓平【作者单位】[1]中国计量大学生命科学学院浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室,浙江杭州310018;[1]中国计量大学生命科学学院浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室,浙江杭州310018;[1]中国计量大学生命科学学院浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室,浙江杭州310018;[1]中国计量大学生命科学学院浙江省生物计量及检验检疫技术重点实验室,浙江杭州310018;【正文语种】中文【中图分类】R155.5沙门氏菌是一种常见的食源性致病菌,属于革兰氏阴性(Gram-negative)肠道杆菌.在大多数的沙门氏菌污染食品中毒事件中,肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)引起的占大部分.沙门氏菌会造成人类的各种疾病如伤寒、肠胃炎、感染性腹泻、发热及呕吐等.目前,对沙门氏菌的检测主要是按照国标规定进行,其检测程序复杂,检测周期较长,且对于疑似致病菌的菌落的筛选也存在不确定性.因此,为了保障食品行业的健康发展,满足食品安全检测的快速准确,亟需建立一种新的有效的快速检测方法,来检测和控制沙门氏菌的传播,维护人民群众的健康.叠氮溴化丙锭(Propidium monoazide,PMA)是一种对核酸具有高度结合能力的光敏染料[1],它能够与细胞壁或细胞膜不完整的死菌的DNA相结合,而不会与具有完整细胞壁或细胞膜的活菌细胞的DNA结合,从而可实现对食品中活菌的快速检测[2-3].本文利用PMA的活细胞筛选功能,将PMA与荧光定量PCR(qPCR)技术相结合,旨在建立能够快速定量检测沙门氏菌活菌的检测方法,并避免检测过程中的假阳性和假阴性的出现.通过将PMA-qPCR应用于畜禽肉类样品的定量检测,以获得我国肉类食品中沙门氏菌污染程度的准确定量监测数据,为开展食品安全风险评估提供重要的科学依据.1 材料与方法1.1 材料本文所用菌种为肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis CMCC 50335),PMA购于美国Biotium公司,二甲基亚砜、LB液体培养基和Taq酶购自Sangon Biotech公司,细菌DNA提取试剂盒购自Promega 公司,pMDTM18-T Vector Cloning Kit购自日本TaKaRa公司,荧光定量PCR仪购自BIO-RAD公司.1.2 沙门氏菌活菌和死菌悬液的制备取肠炎沙门菌标准菌株CMCC 50335接种于LB培养液,37 ℃,120 r/min下振荡培养至对数生长期,取适量菌液进行稀释,通过营养琼脂平皿培养计数得到含菌量为1.0×108 CFU/mL的活菌悬液.将活菌悬液90 ℃水浴处理10 min灭活,冰上冷却5 min,得到热致死菌悬液.1.3 PMA的配置1.3.1 PMA储存液及工作液配制将PMA溶解于20%的二甲基亚砜中,配制成质量浓度为5 mg/mL的PMA储存液,-20 ℃避光保存.将上述配好的储存液以二甲基亚砜稀释10倍即为工作液.1.3.2 最适PMA浓度的确定取200 μL制备好的活菌悬液和死菌悬液加入一定量的PMA工作液,使PMA最终浓度分别为0、3、6、12、15、20和25 μg/mL,避光10 min后将样品置于冰上,650 W卤素灯在距样品20 cm处照射10 min后,按照最佳曝光时间进行光反应,提取细菌DNA,进行PCR扩增和荧光定量PCR检测[4].1.3.3 混合菌液最适暗培育时间的确定取100 μL活菌/死菌混合菌悬液加入一定量的PMA工作液,使PMA终浓度为12 μg/mL,分别避光孵育5、10、15、20、25 min后置于冰上,650 W卤素灯在距样品20 cm处照射10 min,按照最佳曝光时间进行光反应,提取菌液DNA做模板,进行荧光定量PCR检测.1.3.4 最适PMA曝光时间的确定取活菌悬液及死菌悬液200 μL各5份,加入适量PMA工作液,使PMA终浓度为12 μg/mL,充分混匀,避光孵育10 min,使PMA与样品充分结合.然后置于冰上,650 W卤素灯下20 cm处分别照射2、4、6、8和10 min.将未经PMA处理的样品设为阳性对照.提取经PMA处理后的细菌DNA作为模板,进行荧光定量PCR检测,研究检测PMA处理的最佳曝光时间.1.3.5 活菌/热致死菌混合菌悬液的PMA处理分别按照活菌比例为0%、5%、10%、15%、30%、40%、60%、100%制备混合菌液,将未经任何处理的活菌悬液作为对照.向各组细菌悬液中加入适量PMA工作液,使PMA终质量浓度为12 μg/mL.用650 W的卤素灯在距样品20 cm处避光照射10 min,按照最佳曝光时间进行光反应,提取细菌DNA作模板,进行荧光定量PCR检测,观察PMA对死菌的影响.1.4 引物设计以沙门氏菌invA基因(GenBank:M90846.1)为特异性基因设计引物和探针,引物序列见表1.表1 引物序列Table 1 Primer sequence引物序列(5′-3′)用途SAL-FGTGAAGTTCTCGCCACGAACGGGCAASAL-RTACGCTGACCCGCTAAAGAGACCPCRQsal-FCGTTAAGGCAGTTTACTQsal-r CGCTTTAATGAGGGCGGTGCAAGCqPCR1.5 DNA提取取0.6 mL菌液,用细菌DNA提取试剂盒提取细菌DNA,将提取好的细菌DNA保存于-20 ℃备用.1.6 PCR反应体系常规PCR:PCR Master mix 10 μL,上下游引物各0.5 μL,DNA模板2 μL,加水补足20 μL;荧光定量PCR: SYBR Green Realtime 13 μL,上游引物0.5 μL,下游引物0.5 μL,菌液DNA 5 μL,超纯水6 μL.反应程序:94 ℃ 1 min,94 ℃ 30 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40个循环,每个样品重复3次,求出平均Ct值.1.7 PMA-qPCR灵敏度分析将含菌量为108 CFU/mL的沙门氏菌活菌悬液依次进行10倍稀释,分别得到107至101 CFU/mL 7个梯度的活菌悬液,利用上述获得的最适PMA浓度、最适曝光时间及最适暗孵育时间处理样品,然后将样品进行qPCR检测,分析PMA-qPCR检测方法的灵敏度.1.8 市售畜禽样品的人工污染取10 g市售猪肉(腿肉,约克夏猪),用FDA推荐的传统方法[9].证明不含沙门氏菌,研磨成无菌肉浆,分别加入上述含菌量为101～108 CFU/mL的沙门氏菌活菌液.染菌样品采用最适PMA处理条件处理后,按照说明书提取细菌DNA,以此为模板进行荧光定量PCR检测,利用标准曲线得到各组菌液的拷贝数,将此拷贝数与传统的计数法所得结果比较分析.1.9 数据处理数据采用“平均值±标准差”表示.运用SPSS18.0统计软件进行方差分析,各处理平均数之间用Duncan’s方法比较差异显著性,显著性水平设置为P<0.05.2 结果与分析2.1 最适PMA浓度的确定利用不同浓度PMA处理热致死菌悬液时,随着PMA浓度的增加,PMA对热致死菌悬液的扩增抑制率逐渐增大(图1),当PMA浓度为12 μg/mL时,扩增抑制率最大,达到97.5%;当PMA浓度低于15 μg/mL时,PMA对活菌的检出无影响,当PMA 浓度超过20 μg/mL时,活菌的检出率明显受到抑制(P<0.05),且随着PMA浓度的升高,活菌抑制效果越明显,提示利用浓度超过20 μg/mL的PMA处理菌液时,会出现假阴性.图1 最佳PMA浓度的选取Figure 1 Selection of the optimal concentration of PMA2.2 最适培育时间及最适曝光时间的确定利用12 μg/mL浓度PMA处理热致死菌悬液,设置不同的暗孵育时间与曝光时间,提取细菌DNA作模板,优化qPCR体系后进行荧光定量PCR扩增.从图2—3可以看出,当暗孵育时间为10 min时,PMA能与热致死菌DNA完全交联,扩增抑制率可达到98%(图2)；PMA对热致死菌悬液的抑制率随着曝光时间的延长而上升,当曝光时间大于6 min时,对热致死菌悬液的抑制率可达到99%(图3).结果提示,样品加入PMA后,暗孵育10 min、曝光7 min为区分沙门氏菌活菌/死菌的最佳实验条件.图2 不同暗孵育时间对PMA对菌悬液抑制率的影响Figure 2 Effect of dark incubation time on inhibition rate of PMA to bacterial suspension图3 不同曝光时间对PMA对菌悬液抑制率的影响Figure 3 Effect of exposure time on inhibition rate of PMA to bacterial suspension2.3 PMA-qPCR方法的灵敏度检测10倍梯度稀释沙门氏菌活菌悬液后,利用本文上述优化的PMA处理条件处理活菌悬液,然后进行荧光定量PCR检测,获得各个浓度菌液的Ct值,然后以Ct值为纵坐标,以各个菌液浓度的对数为横坐标绘制标准曲线(图4).结果显示,菌液拷贝数与Ct 值之间存在线性关系,回归方程为y=-3.964 3x+39.857,相关系数(R2)为0.993 9.最低检测限为10 CFU/mL.图4 PMA-qPCR灵敏度检测Figure 4 Detection of the sensitivity of PMA-qPCR2.4 活菌/热致死菌细胞混合样品的PMA处理效果结果显示(图5),当样品中全部为死菌时,未经PMA处理的样品仍能测得Ct值,说明样品中的死菌的扩增未被抑制,仍然有扩增信号;而经PMA处理的样品未测得Ct值,说明样品中死菌DNA被PMA交联,PCR扩增被抑制.Ct值随着活菌含菌量的增加逐渐降低,也即菌液经PMA处理后,用于扩增的细菌DNA模板数量变少.当样品中全部为活菌时,未经PMA处理的样品的Ct值与PMA处理的样品的Ct值比较,差异不显著(P>0.05),这表明PMA能有效抑制死菌的扩增而不影响活菌的检出.图5 不同比例菌悬液的PMA-qPCR检测结果Figure 5 Results of PMA-qPCR detection on the different proportion of live and dead bacteria2.5 市售畜禽样品中沙门氏菌的检测用不同含菌量的沙门氏菌液处理猪肉样品进行人工染菌,然后进行PMA-qPCR检测,利用所建立的标准曲线得到样品的拷贝数.结果显示,当菌液含菌量为101和102 CFU/mL时均没有扩增信号出现.当菌液含菌量分别为103、104、105、106、107和108 CFU/mL时可测得人工染菌样品的拷贝数.将PMA-qPCR结果与传统的培养计数法结果进行比较发现,在103～108 CFU/mL范围内,沙门氏菌活菌的定量检测结果与平皿计数法结果在统计学上无显著性差异(P>0.05)(表2).3 讨论如何有效的将样品中的致病活菌检测出来是当前食品安全快速检测工作中的关键.活细胞和死细胞以及细胞膜损伤细胞的区别在于:在扩增的过程中,由于细胞壁的屏障作用,活细胞不会受到PMA的影响,在裂解过程中也不会与失活的PMA反应.通过这种方法,最终使死亡细胞中的DNA在核酸纯化中被选择性的剔除[8].随着PMA染料在食品安全快速检测领域的应用越来越广泛,许多学者研究发现,PMA的作用效果受PMA的浓度、菌液含菌量、暗孵育与曝光时间及微生物致死方法的影响[5-6].活菌和死菌的最主要的区别在于细胞膜的完整性、通透性.死细胞和膜损伤细胞由于膜的完整性被破坏,PMA染料可以和其DNA结合,从而可以抑制这些细胞的检出,活细胞具有完整的细胞膜结构,PMA不能与其DNA结合从而被扩增.表2 人工染菌猪肉样品PMA-qPCR与平皿法计数检测结果比较Table 2 Comparitive detection of artificially infected pork by using PMA-qPCR and plate counting methods活菌菌液/(CFU·mL-1)PMA-qPCR方法/(拷贝·mL-1)PMA-qPCR方法(取对数)行业标准法/(CFU·mL-1)行业标准法取对数101未检出74102未检出3.70×1022.571036.43×1033.814.60×1033.661045.03×1044.703.40×1044.5 31054.25×1055.635.30×1055.721066.50×1066.817.30×1066.861077.42×10 77.876.80×1077.831088.03×1088.907.80×1088.89本文研究显示,在最适PMA浓度和最适培育时间确定的条件下,曝光6 min,PMA 就能够充分的与细菌DNA分子发生共价交联,不参与交联的PMA在光照下被钝化消解.结果显示,当PMA浓度≥12 μg/mL时,PMA可有效地与死菌或细胞膜损伤细胞的DNA结合,从而导致死菌或细胞膜损伤细胞的扩增被全面抑制.本研究进一步研究了可有效抑制死菌DNA扩增且对活菌DNA扩增不产生影响的PMA浓度,结果显示,当PMA浓度逐渐增加到20 μg/mL时,活菌细胞膜或细胞壁受到损伤,从而造成活菌数量的减少,影响扩增效果.因此,选取12 μg/mL的PMA浓度作为筛选活菌和死菌的最适浓度,可有效避免假阳性的干扰,同时也不影响活菌DNA的扩增.祝儒刚[10]推荐的PMA检测浓度为4 μg/mL,远低于本研究的12 μg/mL,但其需要的曝光时间为15 min,远远高于本研究曝光时间.本文研究结果也表明,曝光6 min 后PMA可完全抑制样品中死菌DNA的扩增,同时也确保游离的PMA被全部钝化.利用本研究优化的条件,也即PMA浓度为12 μg/mL、光照6 min时,可有效排除检测样品中死菌或细胞膜损伤细胞DNA对扩增的干扰,避免检测过程中出现“假阳性”的情况,从而实现通过PMA-qPCR技术对沙门氏菌活菌的快速检测.4 结语本研究所建立的PMA-qPCR方法既能有效地抑制死菌的扩增,又不需要复杂的仪器即能完成反应,而且灵敏度较高,对沙门菌活菌的检出限为10 CFU/mL.此方法可为食源性致病菌的检测提供一种新思路.【相关文献】[1] WANG S S, LEVIN, R E. 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专利名称：一种畜禽沙门氏菌活菌快速检测方法专利类型：发明专利
发明人：刘光富,王金君,俞晓平,张明洲
申请号：CN201811426324.6
申请日：20181127
公开号：CN109371112A
公开日：
20190222
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种畜禽沙门氏菌活菌快速检测方法，该方法利用PMA能与待检样品中死菌胞内DNA结合，而不与活菌细胞DNA结合的特性，通过荧光定量PCR检测样品中沙门氏菌活菌的活菌数。

本发明方法可以只检测出沙门氏菌活菌并进行计数。

将此方法运用到畜禽制品中的沙门氏菌的检测，并与传统的细菌培养计数方法进行比较，结果证明本发明灵敏快速、污染率低、成本低，能准确地对沙门氏菌活菌进行定性和定量检测，可用于对畜禽制品沙门氏菌污染的监测。

申请人：中国计量大学
地址：310018 浙江省杭州市江干经济开发区学源街258号
国籍：CN
代理机构：杭州求是专利事务所有限公司
代理人：郑海峰
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