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绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达与检测一、背景介绍1．绿色荧光蛋白1955年，Davenport和Nicol 在太平洋海里的一种发光生物—维多利亚水母(Aequorea victoria)中发现并发表了荧光蛋白的生物发光现象，但是对生物发光现象的机理并不了解。
1962年，日本科学家下村修在水母中纯化鉴定出了一种能催化化学发光的蛋白质分子并将其命名为aequorin，aequorin能将化学能转化为光能，从而产生出波长为470nm的蓝色光(lmax=470nm)，但是水母发出的光是独有的绿色，因此水母发光的蛋白质并非aequorin。
与此同时，发现和分离了一个受紫外线激发能发出绿色荧光的蛋白质—绿色荧光蛋白(GFP)。
1971年，Morin和Hastings提出了GFP这个名称。
1985到1992年间，科学家Douglas Prasher 测定完成了aequorin 和GFP的基因和蛋白质序列，并通过蛋白质序列分析和核磁共振分光术(NMR spectroscopy)确定了GFP发光位点。
1994年，美国科学家钱永健开始改造GFP，目前所用的大多数是钱永健实验室改造后的变种，有的荧光更强，有的可激活、变色。
1996年，解析得到了GFP的晶体结构，它的发光过程是也在日后的应用中得到了解答。
纵观整个过程，从1961年到1974年，下村修的研究遥遥领先，却很少有人注意。
在1974年以后，特别是八十年代后，绿色荧光蛋白的研究得到了广泛的重视和发展。
绿色荧光蛋白，分子质量约为28kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，经共价键连接而成对羟苯甲基咪唑烷酮，它可以被光激发产生荧光，是主要发光的位置。
绿色荧光蛋白分子的形状呈圆柱形，就像一个桶，发光的基团位于桶中央，因此，它可形象地比喻成一个装有色素的“油漆桶”。
其发光团的形成不具有物种专一性，发出的荧光稳定，且不需要依赖其他基质而发光。
绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆南方医科大学学院摘要本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。
本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。
关键词：绿色荧光蛋白克隆表达实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆2015- ~实验日期实验地点2015-合作者指导老师评分教师签名批改日期一、实验目的1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。
2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。
3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。
4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。
5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方法。
6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原理和方法。
7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤二、实验原理1.pEGFP-N1质粒2.T载体三、材料与方法：1.实验材料：质粒：pEGFP-N1T载体：pUCm-T菌种：DH5(克隆菌)PCR引物：F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGAR——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTCTm=56实验试剂：即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit）快速DNA连接试剂盒限制性内切酶：EcoR I（Fermentas）Axygen质粒提取试剂盒抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)X-gal、IPTG等实验仪器：超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等2.方法分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子四、实验具体流程1.获取外源基因1)碱裂解法提取质粒使用Axygen质粒提取试剂盒离心1300r pm,1min瞬时离心漩涡震荡颠倒数次悬浮沉淀颠倒数次离心放置3-5min 13000rpm,1min离心13000rpm,1min2)取0.2 ml PCR反应管一支，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)：H2O 6μl质粒DNA（pEGFP-N1）2μl引物GFP1 (10μM) 1μl引物GFP2 (10μM) 1μlPremix Taq 10μl总体积20μl加完试剂后，将PCR反应管放到PCR仪上。
大肠杆菌荧光染色方法1.引言1.1 概述大肠杆菌荧光染色方法是一种常用的实验技术，用于检测和观察大肠杆菌的存在和分布情况。
大肠杆菌作为一种常见的肠道细菌，对于人类和动物的健康具有重要的影响。
因此，快速、准确地检测大肠杆菌的存在是非常重要的。
荧光染色技术是一种基于分子生物学原理的方法，通过将荧光染料与目标菌株的特定成分或结构相互作用来实现细胞的染色。
相比传统的染色方法，荧光染色具有显著的优势，如高灵敏度、高特异性和直观的成像效果。
因此，荧光染色方法在大肠杆菌的检测中得到了广泛的应用。
本文的主要目的是介绍大肠杆菌荧光染色方法的原理、优点和应用前景。
首先，我们将详细阐述大肠杆菌的重要性，包括其在人类肠道和环境中的分布情况以及与人类健康相关的疾病。
接下来，我们将重点介绍荧光染色方法的原理，包括选择合适的荧光染料和适当的染色条件，以达到对大肠杆菌的准确和可靠的染色结果。
在结论部分，我们将总结荧光染色方法的优点，如高灵敏度可以提高大肠杆菌的检测效率，高特异性可避免误判，直观的成像效果方便观察和分析。
此外，我们还将展望这种方法在临床诊断、食品安全监测、环境卫生等领域的应用前景，希望能为相关研究提供参考和借鉴。
总之，本文将全面介绍大肠杆菌荧光染色方法，旨在推广和应用这一技术，在大肠杆菌相关领域的检测和研究中发挥重要作用，为保障人类健康和环境安全做出贡献。
1.2文章结构文章结构：本文主要分为引言、正文和结论三个部分。
引言部分包括概述、文章结构和目的三个小节。
在概述部分，我们将介绍大肠杆菌荧光染色方法的背景和意义。
随后，在文章结构部分，我们将详细介绍本文的组织结构和各节的内容。
最后，在目的部分，我们将阐述本文的主要目的和意义。
正文部分主要分为两个小节，分别是大肠杆菌的重要性和荧光染色的原理。
在大肠杆菌的重要性部分，我们将介绍大肠杆菌在生物学研究中的重要地位和广泛应用领域。
随后，在荧光染色的原理部分，我们将详细讲解大肠杆菌荧光染色方法的原理、步骤和关键技术。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取欧阳学文南方医科大学预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFPN3和质粒pET28a。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取目录1 前言32 实验目的43 实验设备44 材料及试剂55 实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1 质粒的培养65.2.2 质粒的DNA的碱提取法65.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1 双酶切85.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）8 5.3.3 连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1 LB（LuriaBertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法)95.4.3 转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达105.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ML）125.DN ASEFREE RN ASE A136.TE缓冲液（P H8.0）137.20×TBE138.G ENE F INDER溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFPN3质粒全图谱1310．P ET28A质粒全图谱141 前言绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
绿色荧光蛋白(GFP) 基因的克隆和表达背景知识绿色荧光蛋白(green fluoresce nt protein , GFP)是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。
它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。
GFP由3个外显子组成，长 2.6kb； GFP是由238个氨基酸所组成的单体蛋白，相对分子质量为 27. 0kMr，其蛋白性质十分稳定，能耐受60C处理。
1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm , 宽240 nm,由11个围绕中心a螺旋的反平行B折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly 自身环化和氧化形成.1996年GFP的晶体结构被解出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420 nm，宽240 nm,由11个围绕中心a螺旋的反平行B折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。
实验一质粒DNA 的分离与纯化一、实验目的掌握一种最常用的质粒DNA 提取方法：碱裂解法。
该法用于从小量培养物中抽提质粒DNA ，比较方便、省时，提取的质粒 DNA 质量较高，可用于 DNA 的酶切、 PCR 甚至测序。
二、基本原理质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。
迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链 DNA 分子，分子量范围从 1kb 到 200kb 。
质粒 DNA 可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
绿色荧光蛋白的基因克隆及表达姓名：吴欣竹林小芳专业：生物技术（生物制药）学号：12110904010 121109040211.摘要---------------------------------------------------------------------32.引言---------------------------------------------------------------------33.相关背景---------------------------------------------------------------44.实验原理---------------------------------------------------------------55.实验材料及试剂------------------------------------------------------76.实验流程---------------------------------------------------------------87.实验时间安排--------------------------------------------------------10目的：研究绿色荧光蛋白（green?fluorescent?protein，GFP）基因在大肠杆中的基因克隆与重组表达。
方法:通过对目的基因的提取，合适质粒的选取，构建基因工程所需的重组体，利用基因工程的方法，PCR技术，大量克隆目的基因，最后利用合适的技术又到基因表达，对产物检测后，确定目的基因是否达到克隆目的。
关键词：绿色荧光蛋白大肠杆菌基因工程PCR技术2.引言绿色萤光蛋白(green?fluorescent?protein)，简称GFP，是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
当受到紫外或蓝光激发时，GFP?发射绿色荧光。
分子生物学实验设计实验分子生物学实验设计实验题目：在大肠杆菌中表达绿色荧光基因（EGFP）学院：生命科学学院专业：生态学教师：吴传芳姓名/学号：余光辉/20方成/20一、实验目的在大肠杆菌中表达绿色荧光蛋白二、实验流程三、实验试剂、材料及步骤(一)质粒DNA的提取1.原理碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求2.试剂LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl5g，琼脂（固体培养基）15g，用1NNaOH调pH7.5。
溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na，25mmol/LTris-HCl(pH8.0)溶液Ⅱ：0.4mol/LNaOH，2%SDS临用前1：1配制。
溶液Ⅲ：5mol/L醋酸钾60ml冰醋酸11.5ml双蒸水28.5ml卡那霉素(20mg/mL)抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1）无水乙醇70%乙醇TE缓冲液或ddH2O培养含有pET28a质粒和pEGFP-N3质粒的大肠杆菌收集裂解细菌、分离纯化质粒DNApET-28a-EGFP的表达及观察重组DNA的转化及重组子的鉴定质粒DNA的限制性内切酶酶切及重组DNA琼脂糖凝胶电泳检测3.材料含质粒pET-28a和pEGFP-N3菌液1.5ml塑料离心管EP管架微量取液器和取液器吸头常用玻璃器皿4.实验步骤（1）将带有质粒pET-28a和pEGFP-N3的大肠杆菌接种在液体培养基中（加氨苄青霉素50g/mL），37℃培养过夜（2）取培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm2min，弃上清液（3）加入100L溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10min（4）加入200L新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5min（5）加入150L冰冷的溶液Ⅲ，加盖后温和颠倒数次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15min （6）10000rpm5min，取上清液于另一干净的离心管中（7）向上清液中加入等体积（约400L）酚/氯仿/异戊醇（25:24:1，v/v），振荡混匀，10000rpm10min，将上清液转移至新的离心管中（8）加入等体积（约370L）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，离心2min,取上清液于新离心管中（9）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-200C放置1h （10）12000rpm5min，倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体（11）加0.8mL70%乙醇，离心1min，倒去上清液，真空抽干或室温自然干燥30min（12）加30LddH2O，-200C保存备用5.注意（1）饱和酚（取下层）单独吸200L，氯仿：异戊醇（24：1）吸200L（2）制备质粒过程中，所有操作必须缓和，不要剧烈振荡（特别是加入溶液II和III），以避免机械剪切力对DNA的断裂作用(二)DNA琼脂糖凝胶电泳检测1.原理在质粒提取的过程中，由于操作原因，提取的质粒可能有三种：线性DNA、开环DNA、闭环超螺旋DNA。
石河子大学分子生物学实验结课论文绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析学生姓名学号专业年级、班级指导教师所在学院中国·新疆·石河子2016年1月绿色荧光蛋白(GFP)原核表达分析摘要：本实验主要探讨目的蛋白（GFP）在大肠杆菌中的表达的情况以及鉴定目的蛋白形成的是包涵体还是可溶性蛋白。
本实验先对菌液进行培养、活化、然后采用IPTG分别对其不同时间点的诱导，用SDS-PAGE来确定目的蛋白的可溶性及其分子量，掌握GFP 诱导不同时间的表达情况的检测方法。
关键词：绿色荧光蛋白；SDS-PAGE；原核表达1 前言1.1实验目的掌握聚合酶链式反应(PCR)的原理和操作方法；了解重组载体的构建方法；锻炼学生查阅文献资料、设计与优化实验的能力；加强学生对化学生物学中常用研究方法的认知。
1.2实验背景绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP) 是源于多管水母属等海洋无脊椎动物的发光蛋白，其在蓝光或紫外光下可发出明亮的绿色荧光，可以作为报告基因检测蛋白的特异性表达或进行细胞定位研究。
与以往lacZ、CAT 等报告基因相比，有很多无可比拟的优越性: GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；荧光强度高，稳定性高；不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光,尤其适用于体内的即时检测；另外GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害,安全可靠；并且通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。
正是由于GFP 检测具有高灵敏度，操作简单，无需使用同位素等优点，近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域。
绿色荧光蛋白还在监测目的基因表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着广泛应用。
采用GFP作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段。
绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。
方法：从 E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。
然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。
再用限制性内切酶BamHI和NotI 对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。
将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。
用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。
最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。
结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取1 前言 (3)2 实验目的 (4)3 实验设备 (4)4 材料及试剂 (5)5 实验操作步骤 (5)5.1操作流程 (5)5.2质粒DNA的分离与纯化 (6)5.2.1 质粒的培养 (6)5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 (6)5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 (7)5.3酶切及连接 (7)5.3.1 双酶切 (7)5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收） (8)5.3.3 连接 (9)5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 (9)5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录） (9)5.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法) (9)5.4.3 转化涂板 (10)5.5GFP蛋白的诱导表达 (10)5.6绿色荧光蛋白的粗提取 (11)参考文献 (11)附录 (12)1LB培养基的配制： (12)2.溶液Ⅰ (12)3.溶液Ⅱ (12)4.溶液Ⅲ（100ML） (12)5.DN ASE-FREE RN ASE A (12)6.TE缓冲液（P H8.0） (12)7.20×TBE (13)8.G ENE F INDER-溴酚蓝上样缓冲液 (13)9．PEGFP-N3质粒全图谱 (13)10．P ET-28A质粒全图谱 (14)绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。
题目：荧光蛋白基因的原核表达。
一．实验目的:1.学习细菌质粒的提取与检测的原理和方法。
2.学习制备感受态细胞并将质粒导入工程菌的原理和方法。
二．实验原理1.感受态细胞的制备：将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，同时Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞，细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。
联合其它的二价金属离子（如Mn、Co）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100～1000倍。
2.质粒的导入在冰上融化感受态细胞，经过42度短暂热激后，由于细胞膜处于液晶态产生裂缝，外源DNA黏附于细胞表面，而后立即冰浴，促使细胞膜愈合。
然后将菌体放入适宜的培养基中培养，以促进细胞的愈合恢复。
3.阳性转化的培养基筛选方法。
普通的大肠杆菌难以在含有Kana的LB培养基上存活繁殖，但由于载体质粒含有Kana霉素的抗性基因，所以成功导入载体质粒的大肠杆菌能够在含有Kana的LB培养基上形成菌落，即转化阳性，但是由于成功导入的质粒不一定携带了目的基因，所以可能会出现伪阳性，故需要进行PCR鉴定。
三．实验材料及设备1.实验材料：（1）已完成转化的GFP与RFP质粒阳性克隆DH5α大肠杆菌。
（2）冰冻的感受态DH5a大肠杆菌。
2.实验仪器：恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000μL取液器各一支，台式高速离心机，制冰机，漩涡器；3.实验试剂：（1）质粒的转化与转化导入a.溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ；c.卡那霉素(50mg/mL)；d.抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25:24:1）作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离。
平衡酚密度大，可是DNA在上清中。
异戊醇防止抽提液起泡。
e.无水乙醇作用：除去DNA 水化层，使DNA沉淀。
绿色荧光蛋白在大肠杆菌中的表达张历涵2013141241098彭千2013141241068一、质粒转化入感受态细胞并培养1、原理实验室提供的质粒首先要转入大肠杆菌进行培养与增殖，制备出感受态的细胞，我们就可以方便的将需克隆的质粒导入其中，使其繁殖，就能获得大量质粒。
所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
2、实验步骤2.1 DH-5α和BL-21感受态细胞的制备（1）将0~4 ℃保存的DH-5α和BL-21菌种分别接种在LB液体培养基中37 ℃下250 r/min过夜培养16 h 。
（2）将分别接种过夜菌：LB按1:50的比例接种于2 mL的LB液体培养基中，37 ℃活化培养2～3 h至OD=0.3～0.5 。
（3）取1.5 mL菌液转入EP管中，置于冰上10 min, 然后于4 ℃下5000 r/min 离心5 min。
弃上清液，沉淀加入0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2缓和悬菌。
冰上放置15-30 min后，4 ℃下5000 r/min离心10 min。
（4）弃上清液，沉淀用0.1 mL预冷的0.1 mol/L CaCl2（含15%甘油）缓和悬菌，放在－20 ℃冰箱内保存。
2.2 感受态细胞的转化（1）取制备好的感受态细胞100 μl，冰上解冻，均匀悬浮。
（2）加入2 μl酶连产物，轻轻混匀，冰上静置10-30 min。
（3）42 ℃水浴中热击70 sec后，冰上放置2 min。
（4）加入200 μl LB液体培养基，37 ℃，50-100 rpm振荡培养1 h。
绿色荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达与检测一、背景介绍1．绿色荧光蛋白1955年，Davenport和Nicol 在太平洋海里的一种发光生物—维多利亚水母(Aequorea victoria)中发现并发表了荧光蛋白的生物发光现象，但是对生物发光现象的机理并不了解。
1962年，日本科学家下村修在水母中纯化鉴定出了一种能催化化学发光的蛋白质分子并将其命名为aequorin，aequorin能将化学能转化为光能，从而产生出波长为470nm的蓝色光(lmax=470nm)，但是水母发出的光是独有的绿色，因此水母发光的蛋白质并非 aequorin。
与此同时，发现和分离了一个受紫外线激发能发出绿色荧光的蛋白质—绿色荧光蛋白(GFP)。
1971年，Morin和Hastings提出了GFP这个名称。
1985到1992年间，科学家 Douglas Prasher 测定完成了aequorin 和GFP 的基因和蛋白质序列，并通过蛋白质序列分析和核磁共振分光术(NMR spectroscopy)确定了GFP发光位点。
1994年，美国科学家钱永健开始改造GFP，目前所用的大多数是钱永健实验室改造后的变种，有的荧光更强，有的可激活、变色。
1996年，解析得到了GFP的晶体结构，它的发光过程是也在日后的应用中得到了解答。
纵观整个过程，从1961年到1974年，下村修的研究遥遥领先，却很少有人注意。
在1974年以后，特别是八十年代后，绿色荧光蛋白的研究得到了广泛的重视和发展。
绿色荧光蛋白，分子质量约为28kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，经共价键连接而成对羟苯甲基咪唑烷酮，它可以被光激发产生荧光，是主要发光的位置。
绿色荧光蛋白分子的形状呈圆柱形，就像一个桶，发光的基团位于桶中央，因此，它可形象地比喻成一个装有色素的“油漆桶”。
其发光团的形成不具有物种专一性，发出的荧光稳定，且不需要依赖其他基质而发光。
GFP的优点很多：首先，它本身稳定，不需要任何反应底物和辅助因子，且无种属限制，可在多种生物细胞中表达发出稳定荧光，在450～490nm 蓝光激发下,发光能保持 10min 以上。
其次，其分子量小，对目的基因的功能无任何影响，融合蛋白具有与GFP一样的荧光性质，对细胞没有毒性。
最后，GFP观察方便，利用激光扫描共聚焦显微镜，甚至普通显微镜都可以观察到活细胞内蛋白的变化、活动，用肉眼就可对辨别细胞是否表达及其表达水平。
作为一种新型的报告基因，绿色荧光蛋白在生命科学的各个领域得到广泛的应用：利用绿色荧光蛋白的特有发光机制，可将GFP作为蛋白标签。
就是利用 DNA 重组技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，转染或转化至合适的细胞进行表达，而后借助荧光显微镜观察细胞内活体中标记的蛋白质。
绿色荧光蛋白也可用于大规模药物筛选。
另外，由于绿色荧光蛋白独特的光信号传导机制及其在表达后易被周围化学环境和蛋白之间的相互作用影响的特性，极适用于成为活细胞体内的光学感受器。
近年来，由于融合抗体具有发射荧光和与抗原结合两种特性，所以将其用做免疫染色的检测试剂，直接用于流式细胞仪、免疫荧光的标记、肿瘤的检测等。
目前应用较多的是GFP的突变体—增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein，简称EGFP）。
EGFP将GFP 的第64位氨基酸苯丙氨酸突变成为亮氨酸，从而发射出的荧光强度比GFP大6倍以上。
所以，EGFP比GFP更适合作为报告基因来研究基因表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体内的定位和转运等EGFP (720bp)的基因片段: ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGA CGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCT ACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCC ACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACAT GAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCA TCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGAC ACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCT GGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGC AGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTG CAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCC CGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCG ATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAG CTGTACAAGTAA2.大肠杆菌表达载体及表达系统大肠杆菌质粒是一类独立于染色体外自主复制的双链、闭环DNA分子，大肠杆菌质粒可分为结合转移型和非结合转移型两种，非结合转移型质粒在通常培养条件下不在宿主间转移，整合到染色体上的频率也很低，具有遗传学上的稳定性和安全性。
又因其大小一般在2－50kb范围内，适合于制备和重组DNA的体外操作，因此几乎所有的大肠杆菌表达系统都选用非结合转移型质粒作为运载外源基因的载体，这些表达载体通过对天然质粒的改造获得。
理想的大肠杆菌表达载体要求具有以下特征：（1）稳定的遗传复制、传代能力，在无选择压力下能存在于大肠杆菌细胞内。
（2）具有显性的转化筛选标记。
（3）启动子的转录是可以调控的，抑制时本底转录水平较低。
（4）启动子的转录的mRNA能够在适当的位置终止，转录过程不影响表达载体的复制。
（5）具备适用于外源基因插入的酶切位点。
复制子、筛选标志、启动子、终止子和核糖体结合位点是构成表达载体的最基本元件。
大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早，目前应用最广泛的经典表达系统。
一个完整的大肠杆菌表达系统至少要有表达载体和宿主菌两部分构成。
为了改善表达系统的性能和对各类外源基因的适应能力，表达系统有时还需要有特定功能基因的质粒或溶源化噬箘体参与。
到目前为止已经成功发展了许多表达载体和相应的宿主菌。
由于大肠杆菌本身的蛋白质翻译后修饰加工体系相当不完善，因此不能对重组蛋白质进行修饰加工，这是大肠杆菌系统与其它表达系统相比存在的一个比较突出的缺陷。
大肠杆菌的表达系统包括：Lac和Tac 表达系统，这是最早建立并得到广泛应用的表达系统，它是以大肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统。
PL和PR表达系统，它是以λ噬箘体早期转录启动子PL、PR为核心构建的表达系统称为PL和PR表达系统。
T7表达系统，大肠杆菌T7噬箘体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。
此外还有其他表达系统，如营养调控型、糖原调控型、pH调控型等。
3．SDS-PAGE原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS，SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW 为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
SDS- 聚丙烯酰胺凝胶使用一种不连续的缓冲系统。
在这一系统中，一般凝胶分为低浓度的成层胶（浓缩胶）和较高浓度的分离胶。
在电泳时， SDS-多肽复合物向两胶界面迁移，在分离胶表面形成了一个极薄的层，极大地浓缩了样品的体积，使样品在分离之前处于同一起跑线。
一般来说，在被分析的蛋白质稳定的pH范围，凡是不与SDS发生相互作用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的选择对蛋白带的分离和电泳的速度是非常关键的。
Tris-甘氨酸系统是目前使用最多的缓冲系统。
如果要测定糖蛋白的分子量，最好采用Tris-硼酸盐缓冲系统，对于分子质量小于15kDa的蛋白样品，可以使用SDS-尿素系统，也可以采用Tris-tricine缓冲系统。
4.蛋白分离与检测蛋白质的分离方法很多，依据分子大小分离的方法包括：透析和超过滤，透析指利用蛋白质分子不能通过半透膜而与小分子分离；超滤是利用压力或离心力使小分子溶质通过半透膜而蛋白质被截留在膜上而分离。
密度梯度离心，蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，且每种蛋白质颗粒沉降到与其自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成不同的区带。
凝胶过滤，即分子排阻层析。
凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。
大分子最先流出层析柱。
根据溶解度分离的方法包括：盐溶和盐析，中性盐在低浓度时可增加蛋白质的溶解度，即盐溶。
原因是蛋白质分子吸附盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而与水分子相互作用加强；当离子强度增大到足够高时，此时与蛋白质疏水基团接触的自由水被移去以溶剂化盐离子，导致蛋白质疏水基团暴露，使蛋白质因疏水作用凝聚沉淀。
根据所带电荷分离的方法包括：电泳（净电荷、分子大小、形状），区带电泳、聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE）、毛细管电泳离子交换层析。
其余的方法还有吸附层析、亲和层析、高效液相层析（HPLC）,快速蛋白液相层析（FPLC）等。
蛋白质的检测方法包括：凯氏定氮法，它是样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
