磷脂转运蛋白在毕赤酵母中的高效表达

毕赤酵母高效表达外源蛋白的分子水平策略
张欣然;凌焱;杨英
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2022(48)17
【摘要】毕赤酵母表达系统具有许多优异特性,并且是目前最成功的外源蛋白表达系统之一。

通过近几十年的快速发展,该系统已引起各界的广泛关注,并产生了巨大的经济和社会价值。

与其他现有表达系统相比,毕赤酵母在目的蛋白翻译后修饰上有着极大优势,已被广泛应用于表达外源蛋白。

但是另一方面,由于该系统受包括外源基因的特性、菌种、表达环境和发酵技术等多种因素的影响,,其在不同外源蛋白的表达上也表现出很大差异。

该文着眼于分子水平上的基因转录、蛋白质加工、蛋白质降解以及转运分泌4个模块,介绍了利用毕赤酵母表达系统通过优化密码子、高拷贝数外源基因、引导肽筛选、敲除蛋白酶基因、共表达促折叠因子等途径提高外源蛋白表达效率的相关策略,并简要展望了该系统的发展前景,以期为构建高效毕赤酵母细胞工厂提供指导。

【总页数】8页(P321-328)
【作者】张欣然;凌焱;杨英
【作者单位】军事医学研究院辐射医学研究所;河北大学生命科学学院
【正文语种】中文
【中图分类】TS2
【相关文献】
1.外源蛋白在毕赤酵母中的高效表达策略
2.巴斯德毕赤酵母高效表达外源蛋白的策略
3.外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略
4.影响毕赤酵母高效表达外源蛋白的因素
5.基于提高蛋白在内质网中折叠效率的策略促进外源蛋白在毕赤酵母中表达水平的研究进展
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第22卷 第3期 吉首大学学报(自然科学版)Vol.22 No.3 2001年9月J ournal of J ishou University(Natural Science Edi ti on)Sept.2001文章编号:1007-2985(2001)03-0040-05外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略聂东宋,梁宋平,李 敏(湖南师范大学生命科学院,湖南长沙 410081)摘 要:高效表达外源蛋白,在理论和实践上特别是在生物制药中具有重要意义,巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)是表达外源蛋白最理想的真核表达系统之一.影响外源蛋白在P.pas toris中表达的因素很多,主要包括外源基因自身的特性、载体、宿主细胞几个方面,了解和灵活运用它们的联系,有助于获得外源基因在P.pastoris中的高效表达.关键词:巴氏毕赤酵母;外源蛋白;高效表达中图分类号:Q75 文献标识码:A巴氏毕赤酵母(P.pastoris)是一种单细胞真核生物,基因工程菌近年来已被广泛用于商业化生产外源蛋白.与其它表达系统比较,该系统具有以下优点:(1)高表达.该表达系统利用醇氧化酶基因启动子很强,细胞生长速度快,所以该表达系统表达的外源蛋白产量很高,如破伤风毒素蛋白的产量高达12g/L[1],其它表达系统一般为毫克级.(2)高稳定.由于该表达系统的表达载体不是以自主复制的质粒形式存在,而是整合到酵母染色体上,所以构建的菌株十分稳定.(3)高分泌.P.pastoris中一些分泌信号和先导序列如a-因子的分子生物特性已研究得十分清楚,加之它身体的生物学特性,其分泌表达可达10g/L,这在已知的分泌表达系统中是十分罕见的.虽然已有许多蛋白在P.pastoris中实现了高效表达,但仍有一些蛋白表达量相对较低,如 -cryptogein表达量级为1~5mg/L[2],AFP在摇瓶中表达时最高水平不超过5mg/L[3],有些甚至不能表达,如HIV表面糖蛋白[4].此外,酵母表达系统的局限性还在于分泌表达产物的不均一性,如信号肽加工不完全,表达产物内部降解等现象[5] 其次,当利用该系统的载体将外源基因通过双交换整合到宿主体中AOX1基因位置时,AOX1基因被破坏,这样使细胞利用甲醇能力大大降低.从而大大延长了细胞培养发酵时间.这种外源蛋白表达的差异,一方面是由于外源基因本身的特性而引起的,另一方面,表达条件也对表达量起了极其重要的作用.笔者综述了影响甲醇酵母中外源基因高效表达的各种因素,并阐述了优化外源蛋白在P.pastoris中高效表达的策略.1 外源基因本身的特性对表达的影响1 1外源基因的A+T组成外源基因本身的4种核苷酸的组成对基因的表达起重要作用.许多高A+T含量的基因通常会由于提前终止而不能有效转录,共有序列ATTATTTTATAAA就是一个转录提前终止信号 Caro1A Scorer[6]在表达人免疫缺损病毒(HI V)包膜糖蛋白gp120时,这个信号造成了gp120的转录提前终止.提前终止被认为是一种具有种族特异性的现象,如在P.pastoris中不能表达的HIVE NV蛋白在酿酒酵母中表达良好.[4]因此,可以通过调整高A+T含量区的核苷酸的组成来避免提前终止的发生,使其A+T含量在30%~50%收稿日期:2001-08-05基金项目:国家自然科学基金资助项目(39670392)作者简介:聂东宋(1967-),男,湖南省衡阳县人,湖南师范大学硕士研究生,主要从事基因结构与功能研究.范围内,CareJJ [1]用这种方法使破伤风毒素C 片段得到高效表达.1 2密码子的选择在不改变氨基酸组成的前提下,通过修饰密码子序列也可以提高表达水平.目前公认的观点是:通过优化基因的密码子序列,可以适应tRNA 的同工受体及宿主的反义密码子摇摆位置处被修饰的核苷酸的丰度,同时也有利于翻译的二级结构的形成.在酵母中表达较高的基因往往是采用酵母本身所偏爱的密码子,研究也表明在所有61个密码子中有25个是酵母所偏爱的[7].赵翔[8]通过对Pichia pastoris 的28个蛋白编码基因的同义密码子的使用情况的分析,确定了P.pastoris 的19个高表达优先密码子.这些结果与已知的Saccharomyles Cervisiae 及Kluyveromyles lactis 的密码子基本相似,但在谷氨酸的密码选择上截然相反.谷氨酸以GAG 为高表达优越密码而不是以S.cerevisiae 和ctis 所偏爱的GAA 为优越密码.姚斌等[9]在P.Pastoris 中表达植酸酶时,把在酵母中使用频率为0的精氨酸的密码子突变为使用频率较高的密码子时,表达水平提高了37倍.1 3mRNA5 非翻译区(5 -UTR)核苷酸的序列和长度5 -UTR 的核苷的序列和长度影响外源基因的表达.由于UTR 太长或太短都会造成核糖体40S 亚基识别障碍,因此,一个适当长度的5 -UTR 有助于mRNA 进行有效的翻译.Aox1基因5 -UTR 长为114nt 且富余A+ ,因此,为了获得最佳蛋白表达量,维持外源基因mRNA5 -UTR 尽可能与Aox1mRNA5 -UTR 相似是十分必须的,最好二者保持一致.Sreekrishna 等[10]通过调整人体血清白蛋白的(HSA)的mRNA5 非翻译区使之与醇氧化酶Aox1的非翻译区保持一致后,HSA 的表达量提高50倍以上,肠组织蛋白酶E (C TSE)的表达水平通过5 -UTR 的调整亦极大地增加[11].此外5 -UTR 应避免AUG 序列,以确保mRNA 从实际翻译起始位点开始翻译,起始密码AUG 周围不应形成二级结构,可通过密码子的替换来达到目的.2 外源蛋白在P.pastoris 中的高效表达策略2 1优化表达载体系统1)载体的选择.应用甲醇酵母表达异源蛋白时有多种载体可供选择,既有胞内表达载体(如pPIC3),又有分泌表达载体,如pPIC9,PHI L-D,PA0804,Pa0815,Ppsc3K 等.一般而言,对于非分泌蛋白采用胞内表达方式,而对于正常分泌蛋白则选择分泌型载体,这样更有利于表达产物的分离纯化.2)选择强启动子.P.pastoris 载体中最常用的启动子为Aox1启动子(Aox1promoter P Aox1),它的甲醇诱导性很强,因此,由它控制的外源基因通常能得到高效表达.也有人曾用P Aox2和P DAS 启动子,但二者的强度大大低于PAox1.如果带有外源基因的载体通过双交换整合起P.pastoris 的Aox1基因位置时,Aox1基因将被破坏.虽然Aox2和Aox1基因的序列同源性高达97%,但Aox1基因表达产物在正常细胞中仅占总酶量的5%.这样就使细胞利用甲醇的能力大大下降,从而使表达量下降且延长了细胞发酵时间(150~200h).为了克服这一缺点,戴秀玉[12]等通过分离选择恢复利用甲醇能力的自发突变体,从Aox1基因缺陷菌株中分离得到Mut +的自发突变体.他们对突变体的Aox2基因上游区域经PCR 护增产物测序,确定了该突变体在-255和-529两个位置的碱基发生了改变,而这两个位置为阻遏蛋白结合区域.该区域发生点突变后阻遏蛋白便不能很好地与之结合,通过去阻遏作用使得转录效率增强,从而提高表达量和缩短发酵时间.最近一种无需甲醇诱导而能组成性表达外源基因的毕赤酵母载体pGAPB 和pGAPB 已经构建成功,这些载体利用了三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因启动子P GAP ,在它的控制下B-1acz 基因表达率比甲醇诱导下的以P Aox1启动子的产量更高[13].由于该组成型启动子不需甲醇诱导,发酵工艺更为简单,而且产量更高,所以成为替代PAox1的最强有力的启动子.Doring 等[14]分别用pGAPZB 和pPICZB 来生产兔肾肽载运蛋白(rPE PTZ)和小人肠肽转运蛋白(hpEPTZ),前者表达的这两种蛋白的产量均比后者高4倍,看来在生产哺乳动物膜转运蛋白时pGAP 比PAox1更理想.3)信号肽的选择.分泌表达是一种理想的蛋白质生产方式,既可以减轻宿主细胞代谢负荷,又可减少宿主细胞蛋白酶对外源蛋白的降解.利用外源蛋白自身信号肽与酵母信号肽表达外源蛋白均有成功报道.用自身信号肽在P.pastoris 中表达成功的例子如人血清白蛋白和牛凝血酶等.但如果自身的信号肽序列效41第3期 聂东宋,等:外源蛋白在巴氏毕赤酵母中的高效表达42吉首大学学报(自然科学版)第22卷果不佳则可尝试用甲醇酵母的信号肽.这些信号肽主要有酸性磷酸酶基因PHO1的信号肽、蔗糖酶基因SUC2的信号肽、间质金属蛋白酶(MMP)的信号肽及转化酶(invertase)的信号肽等.其中a-因子信号肽使用最广,尤其对于小分子物质如抑肽酶、表皮生长因子、凝血固子X 等[10].杨晟[15]等采用a-因子信号肽比利用人血清白蛋白天然前导肽作为分泌信号肽可使重组人血清白蛋白表达量高出10%左右.另外如果外源基因产物不能分泌到体外,还可将产物连上一个定向肽(peroxisome targeting singal,P TS),使其定向运输到过氧化物酶体中,以免产物积累对宿主细胞造成毒害,同时产物自身的稳定性会大大增强.Water-ham[16]等利用定向肽在P.pastoris中成功地将P GAP启动下的 -半乳糖苷酶定向运输到过氧物酶体中.但用P.pastoris表达基因工程产物的另一问题是信号肽加工不完全,其表达的外源基因产物常比设计的多几个氨基酸残基,这可能是酵母自身调节机制对外源基因高表达的应答反应[5].Singh[17]等通过定向缺失诱变MF a1和干扰素基因连接处寡核苷酸导致了含有天然N端的成熟干扰素的正确释放,可以成为解决这一问题的好办法.2 2 增加外源基因整合拷贝数巴氏毕赤酵母载体在宿主染色体上大多数为单拷贝整合,但由于P Aox1在甲醇诱导下的强启动性以及整合后常常稳定,所以即使单拷贝也能获得较高的产量.如乙肝表面抗原在P.pastoris中单拷贝产率可达0 4g/L(酿酒酵因至少需50拷贝才能达到此水平)[18].但在另一些例子中,提高拷贝数可大大增加表达水平,如鼠表皮生长因子(E GF)、人肿瘤坏死因子(TNF)和破伤风毒素片段C[10].目前提高整合拷贝数的方法主要有:(1)通过不同的转化方法提高拷贝数.P.pastoris的转化方法有电激法、原生质体法、氯化锂法等,其中以原生质法转化使细胞群中产生多拷贝转化子频率相对较高.但若使用G418检测拷贝数,则配合电激法转化的效果更好[19].(2)在体外载体上多次插入目的基因片段.但这种多拷贝整合不太稳定且拷贝数有限.(3)将载体中目的基因两端连上来自宿主或其它非必需高重复的基因片段,通过同源重组而达到高拷贝整合的目的.由于rDNA在酵母基因组中有100~200个重复单元,所以这是一种提高拷贝的理想方式.该策略已在酿酒酵母[20]、乳酸克鲁维酵母[21](K lactis)中得到成功应用,可惜在P.pastoris中尚未见实验报道.目前要快速高效地筛选高拷贝的转化子,传统方法有SDS-PAGE、免疫印迹、southern blotting 等,但这些方法费时费力.通过PC R法检测拷贝数既方便又快捷,另外还可通过提高G418的浓度来筛选高拷贝转化子.但是个别情况下,拷贝数增加对产量也会产生负效应[22],这可能是由于分泌效率低的蛋白在过高表达的情况下会对分泌途径形成负反馈抑制,因此基因拷贝数对表达量的影响是无法预测的.高表达菌株的筛选应以表达蛋白量为唯一标准.Jeffrey[23]等建立了一种双筛选膜筛选方法:首先将菌转至醋酸纤维素膜上,再与硝酸纤维素膜叠放在酵母固体培养基上,经过一段时间培养后分泌蛋白就印在硝酸纤维素膜上,接着用此蛋白的抗体检测,即可挑出最高蛋白量对应的克隆.用这种方法,每套滤膜可筛选出100 ~1000个克隆,从而快速地从大量重组子中筛选出高表达克隆.2 3优化发酵条件1)通过提高菌株的生物量来提高外源蛋白表达量.采用不同的培养基配方和不同的发酵参数,通过提高细胞的绝对总数来提高外源蛋白的产量.影响P.pastoris生长的外界因素主要包括:(1)培养基组成.目前主要有MGY/mm、B MG/Bmm、B MGY/B mmy3种培养基可用于培养P.pastoris.但由于BMGY/Bmmy既含有磷酸缓冲液又含蛋白胨和酵母提取物,因而菌株生长更好,大大增加了生物量,使表达量也相应大大提高.如在表达mEGF时,在B mmy培养基中单拷贝转化子表达量为20 g/L,而在不含蛋白胨和酵母提取物的基本培养基中表达量少于1 g/L[24].蛋白胨和酵母提取物中几乎不含大分子蛋白质,只有分子量低于3000Da的小分子多肽,因此对于大分子外源蛋白的分离纯化不会造成不便.(2)诱导前菌体OD值.P. pastoris中蛋白表达分2个阶段:一是生长阶段,在含甘油的培养基中生长菌体,待OD600达到2~6时再离心收集菌体;二是诱导表达阶段,将收集的菌体转入含甲醇的培养基中诱导表达.理论上而言,OD600值越高,生物量越大,则总的表达量亦应该越高.但是OD600值越高培养基中氧和营养供给越受限制,而且外源蛋白的溶解性、稳定性、毒性都会对菌体产生影响.因此,高密度并不一定意味着高表达.鉴于发酵罐培养较之摇瓶培养在溶解量、pH值、通气量营养补给方面的优越性,有人建议在筛选高表达菌种时,经初筛后的菌株应立即用发酵罐进行发酵条件的研究,从而大大提高表达量.如在表达mEGF时,发酵罐较之摇瓶培养提高10倍,从48mg/L 到447mg/L;在表达破伤风肠毒素C 片段时,发酵罐也提高表达量10~20倍.2)防止目的蛋白降解.外源蛋白的稳定性直接影响到基因表达的产量.几乎没有一种高表达蛋白是特别稳定的,宿主菌内蛋白酶水平决定着表达产物的降解速度.高密度培养酵母固然可以大大提高培养基上清中分泌外源蛋白的含量,但随着重组蛋白的分泌增加,其它一些细胞内物质如蛋白酶亦会分泌增多,在培养基中积累从而造成对重组蛋白的降解.此外酵母细胞膜上有一种KEX-2样蛋白水解酶,能专一性水解 -因子前体中羧基端的肽键,即连续的2个碱性氨基酸(如lysAry,lyslys,Arglys),从而使目的蛋白降解.为了提高外源蛋白在发酵液中的稳定性,免受蛋白酶降解,可采有以下几种方法:一是改造P.pastoris 表达宿主菌株,缺失基因组中主要蛋白水解酶的基因,使目的基因稳定.或使用已有的蛋白酶缺陷菌株如SMD1168(his4pep4)、SMD1165(his4,prb1)和SMD1163(his4,pep4,prb1)亦可避免产物降解的发生[10].二是在培养液中补加一些富含氨基酸的组分和酪蛋白水解物、胃蛋白水解物,提供给酵母细胞蛋白酶过量的底物,以减少目的蛋白的降解.三是由于P.Pastoris 能忍耐较宽的pH 范围(pH 3.0~7.0),因此可调节溶液pH 值抑制蛋白水解酶活性,防止目的蛋白降解.四是降低甲醇诱导表达时的培养温度,Mei M 等[25]通过将诱导表达时的温度由30 降至25 ,半乳糖氧化酶表达量提高4倍.总之,P.pastoris 表达系统由于具有表达量高、本身遗传稳定、具翻译后加工能力、产物可分泌发酵、工艺成熟、分离纯化简单、蛋白质产物糖基化方式更接近高等生物等优点,已成为目前国内外倍受青睐的真核表达系统.目前用该系统表达的外源基因已上百种,很多医药制品如人血清白蛋白、人白介素-2、乙肝表面抗原、水蛭素等在该系统中都已成功表达,有些即将进入市场[26].但影响外源基因在P.pastoris 中表达的因素非常复杂,建立稳定的高效表达外源蛋白的表达体系并非易事.笔者着重探讨了与遗传因素及发酵方面有关的因素,这些策略的灵活运用将不同程度改善外源蛋白在P pastoris 中的表达水平.外源蛋白在P.pastoris 的高效表达是一个涉及多学科的问题,尚需其它研究领域的共同合作探讨.参考文献:[1] CLARE J J,RAYMENT F B,B ALLANTINE S P,et al.Hihg-level Expression of T etanus Toxin Fragment C in Pichia Pastoris StrainsContaining Multiple T andem Integration of the Gene[J].Bio/Technology,1991,(9):455-460.[2] MIC HAEL J D.Over Expressi on in Pichia Pastoris and Crystallization of an Elicitor Protein Secreted by the Phytopathogenic Fungus[J].Protein expression and Purification,1996,(8):254-261.[3] LOEVEN M C.Biosyn thetic Production of Type Fi sh Anti freeze Protein:Fermen tation by Pichia Pastris[J].Appl Microbiol Bi tech -nol,1997,(48):480-486.[4] CLARE J,SCORERC,BUC KHOLZ R E xpression of EGF and HIV Envelope Glycoprotein[J].Methods Mol 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专利名称：一种利用毕赤酵母PGAPZaA载体高效表达目的蛋白的方法
专利类型：发明专利
发明人：华权高,李昆鹏,沈鹤霄
申请号：CN201410400496.1
申请日：20140814
公开号：CN104195164A
公开日：
20141210
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种利用毕赤酵母PGAPZaA载体高产表达目的蛋白的方法，包括如下步骤：(1)构建含有目的蛋白基因的毕赤酵母PGAPZaA载体；(2)将步骤(1)中所述含有目的蛋白基因的毕赤酵母PGAPZaA载体转化毕赤酵母，筛选出成功转化的毕赤酵母；(3)将步骤(2)中筛选出的成功转化的毕赤酵母在氯化钠浓度为1-8％、碳源为浓度1％-3％的甘油的酵母培养基中培养，表达目的蛋白。

解决了现有技术中PGAPZaA载体中GAP启动子的下游目的基因表达产量低的问题。

申请人：华权高
地址：430206 湖北省武汉市东湖开发区高新大道818号高科医疗器械园B11号
国籍：CN
代理机构：北京华沛德权律师事务所
代理人：刘杰
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1.基因的内在特性主要包括mRNA 5’端非翻译区(5’2 U TR)、基因的A +T 组成和密码子的使用频率3 个方面。

由于巴斯德毕赤酵母中乙醇氧化酶的表达量极高(占胞内可溶蛋白的30% 以上) 因此为了有高的蛋白表达量,维持外源基因mRNA 5’－U TR。

尽可能和AOXlmRNA 5’－U TR 相似是必需的, 最好是保持两者一致。

A + T 含量高的基因在巴斯德毕赤酵母中表达时偶尔会造成转录提前终止,这是因为A T 丰富区可能存在转录提前终止信号。

因此对A T 含量丰富的基因最好是重新设计序列, 使其A + T 含量在30%～55% 范围内。

巴斯德毕赤酵母也有特殊的密码子偏好趋向。

（赵翔,霍克克,李育阳. 毕赤酵母的密码子用法分析[J ] . 生物工程学报,2000 ,16(3) :308 - 311.）外源蛋白自身的理化特点也影响其表达和分泌。

外源蛋白的加工修饰都会影响蛋白的表达量。

2．选择强启动子启动子在转录水平上调控基因的表达最常用的启动子是AOXI 启动子。

PGAG(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子) 是最近在巴斯德毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子,在它的控制下β- LabZ 基因表达率比甲醇诱导下的PAOX驱动的产量更高,由于该组成型启动子不需要甲醇诱导,发酵工艺应该更简单,同时其产量更高,所以成为代替PAOX1 最有潜力的启动子。

通过分离选择恢复利用甲醇能力的自发突变体, 从AOX1 基因缺陷菌株中分离M ut+ 的自发突变体，从中筛选提高表达量的突变体。

（戴秀玉, 王恂, 周坚1 毕赤氏酵母PAOX2 突变化序列分析〔J 〕1微生物学报, 1999, 39 (6) : 559～5611）3．增加外源基因整合拷贝数（1）Invitrogen 公司最新发展的质粒pPIC9K上带有G418 的抗性基因,可以通过转化子对G418抗性水平快速筛选高拷贝转化子（配合电激法转化的效果更好）。

（2）在体外载体上多次插入目的基因片段。

毕赤酵母表达蛋白步骤一、引言毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种常用的真菌表达系统，被广泛应用于蛋白质的表达和生物技术研究中。

其优势包括高表达水平、易于培养和操作、能够正确折叠复杂蛋白等。

本文将介绍毕赤酵母表达蛋白的步骤。

二、构建表达载体毕赤酵母表达系统的关键是表达载体的构建。

首先，需要选择适合的表达载体，常用的有pPIC6、pPICZα等。

然后，在载体上选择合适的启动子和信号序列，以确保蛋白质能够被正确表达和分泌。

同时，还需要在表达载体上加入选择标记，如His标签、FLAG标签等，以便后续的蛋白质纯化和检测。

三、转化毕赤酵母将构建好的表达载体转化入毕赤酵母中，使其成为表达宿主。

转化方法包括电击转化、化学转化等。

其中，电击转化是常用的方法，通过电击脉冲使毕赤酵母细胞膜发生破裂，使表达载体进入细胞内。

转化后，将细胞培养在选择性培养基上，筛选出带有表达载体的毕赤酵母克隆。

四、表达蛋白经过转化筛选后，得到含有目标蛋白表达载体的毕赤酵母克隆。

接下来，需要将克隆进行培养，在适当的条件下诱导蛋白的表达。

常用的诱导剂包括甲醇、巯基乙醇等，通过加入适量的诱导剂，可以使目标蛋白得到高效表达。

五、蛋白纯化在蛋白表达后，需要进行蛋白纯化，以获得纯度较高的目标蛋白。

常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。

在选择纯化方法时，需要根据目标蛋白的性质和需求进行合理选择。

同时，可以利用加入的选择标记，如His标签，通过亲和层析纯化进行快速高效的纯化。

六、蛋白鉴定和功能分析蛋白纯化后，需要进行蛋白的鉴定和功能分析。

常用的鉴定方法包括SDS-PAGE、Western blot等，可以确定蛋白的分子量和纯度。

功能分析则可以通过生物学实验来进行，如酶活测定、结合实验等，以验证目标蛋白的功能。

七、应用和展望毕赤酵母表达系统在生物技术和蛋白质研究领域有着广泛的应用。

通过该系统，可以高效表达各种蛋白，包括抗体、酶和重组蛋白等。

毕赤酵母表达系统原理《毕赤酵母表达系统那点事儿》嘿，朋友们！今天咱来唠唠毕赤酵母表达系统。

这玩意儿可有意思啦！你看啊，毕赤酵母就像是一个神奇的小工厂。

它呀，能把我们想要的东西给生产出来。

想象一下，它就像一个勤劳的小工匠，在自己的小天地里忙忙碌碌。

这个小工厂有自己的一套工作流程呢。

首先，我们得把我们需要表达的基因送进去，就好像给小工匠下达一个任务订单。

毕赤酵母接收到这个基因后，就开始开动啦。

它会利用自己身体里的各种零部件和原材料，一点一点地把这个基因表达出来，变成我们想要的蛋白质。

它可厉害了，能生产出各种各样的蛋白质。

就像一个万能的大厨，不管你要做什么菜，它都能给你做出来。

而且啊，它做出来的东西质量还挺高。

毕赤酵母还有个优点，就是它比较好养活。

不需要特别复杂的条件，给它点吃的喝的，它就能茁壮成长。

这就像咱家里养的小宠物，只要你稍微照顾一下它，它就能给你带来很多欢乐。

不过呢，毕赤酵母也不是完美的啦。

有时候它也会出点小差错，就像人一样，偶尔也会犯点小迷糊。

但这并不影响它的可爱和实用呀。

在实际应用中，毕赤酵母表达系统可是帮了大忙呢。

比如说在生物医药领域，很多药物的生产都离不开它。

它就像一个幕后英雄，默默地为我们的健康贡献着力量。

我记得有一次，我在实验室里研究一个项目，就是用毕赤酵母表达系统来生产一种蛋白质。

那时候真是费了不少心思，不断地调整各种条件，就盼着能得到高质量的产物。

经过一番努力，终于看到了成果，那一刻的心情真是无法用言语来形容。

总之呢，毕赤酵母表达系统是个很有趣也很有用的东西。

它虽然小小的，但却有着大大的能量。

它就像一颗闪亮的星星，在科学的天空中绽放着自己的光芒。

我们要好好利用它，让它为我们创造更多的价值呀！。

毕赤酵母内源蛋白表达系统发酵优化策略随着生物技术和生物医药行业的快速发展，蛋白表达成为了研究和生产领域中一个至关重要的环节。

毕赤酵母（Pichia pastoris）作为一种有效的真菌表达系统，被广泛应用于蛋白表达、酶制备等领域。

本文将从毕赤酵母内源蛋白表达系统的发酵优化策略进行探讨，以期为相关研究提供一定的参考和借鉴意义。

一、毕赤酵母内源蛋白表达系统简介毕赤酵母是一种酿酒酵母，具有真核生物和原核生物的特点，具有许多原核和真核表达系统的优点。

Pichia pastoris作为一种高效的真菌表达系统，广泛应用于蛋白质表达、酶制备、重组激素和疫苗生产、抗体工程等领域。

毕赤酵母在高密度、大规模表达的过程中具有许多优点，例如可以利用化石燃料产生的甲醇为碳源并利用氧化酶将甲醇作为能源，这使得它在蛋白质大规模表达中的应用有了很大的便利；其次methylotrophic yeast P.pastoris是一种易于操作的槽稠传播。

分泌蛋白在生成后由细胞外酶直接切割。

得到的目的蛋白质易纯化和分离。

由于其许多优点，毕赤酵母内源蛋白表达系统在生物技术和制药行业中受到极大的关注。

二、毕赤酵母内源蛋白表达系统的发酵优化策略（一）基础培养基的选择在毕赤酵母内源蛋白表达系统的发酵过程中，培养基的选择对于蛋白质的表达和纯化至关重要。

通常情况下，毕赤酵母内源蛋白表达系统常用的基础培养基包括YPG液体培养基、BMGY培养基和BMMY培养基。

其中，BMGY培养基在毕赤酵母的扩大培养和生长过程中被广泛应用，其主要成份包括酵母抽提物（yeast extract）、复合酵母粉（peptone）、甘油（glycerol）和缓冲盐溶液等。

而BMMY培养基主要用于毕赤酵母内源蛋白表达系统的诱导表达过程，其主要成份包括酵母醣（yeast extract）、蛋白胨（peptone）、抗泡剂（anti-foaming agent）以及甲醇（methanol）等。

毕赤酵母表达系统Mut+和Muts毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶一一AOX1及AOX2,细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物，甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。

AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。

简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。

为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。

注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。

AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。

AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。

在YPD（酵母膏、蛋白月东、葡萄糖）培养基中，不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h。

Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时。

菌株GS115、X-33、KM71和SMD1168的区别GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。

GS115、KM71、SMD1168在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。

这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8oGS115表型为Mut+,重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+,也可能是Muts（载体取代AXO1基因），可以在MM和MD培养基上鉴定表型。

毕赤酵母来源Kex2蛋白酶的高效表达及酶学性质研究Kex2蛋白酶是一种来源于酵母的前体加工蛋白酶,能识别并切割碱性氨基酸残基对中的羧基端肽键,在酵母的蛋白分泌途径中起关键作用,并且在真核细胞蛋白的研究中也应用广泛。

目前多用毕赤酵母（Pichia pastoris,P.pastoris）来表达Kex2蛋白酶,但有关毕赤酵母Kex2蛋白酶（PPKex2）的同源活性表达与酶学性质的研究还鲜有报道,并且Kex2蛋白酶较低的表达量导致其生产成本过高,不利于大规模的应用。

本课题利用毕赤酵母表达系统对PPKex2进行了同源表达,并研究其酶学性质,同时与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae,S.cerevisiae）Kex2蛋白酶（SCKex2）进行了比较。

并采用高密度扩大发酵、截短C端序列、更换启动子和伴侣蛋白共表达等方式提高PPKex2的表达量。

主要研究成果如下所述:（1）分别从毕赤酵母和酿酒酵母基因组中获得kex2基因,将其插入到表达载体pPIC9K中,并转化毕赤酵母GS115菌株。

重组菌株经甲醇诱导表达后,结果表明PPKex2的蛋白浓度达到0.42 mg·mL^-1,酶活达到30.2 U·L^-1,PPKex2的发酵上清比酶活是SCKex2的7倍。

Kex2蛋白酶使用Q-FF强阴离子交换柱进行纯化并研究酶学性质。

结果表明,PPKex2的最适反应pH是8.0-9.0,最适反应温度是37oC,与SCKex2性质相近。

在稳定性方面,PPKex2在pH 7.0时最稳定,在碱性条件下的稳定性高于SCKex2,在酸性条件下的稳定性低于SCKex2,另外PPKex2的温度稳定性略低于SCKex2。

酶促反应动力学研究表明,PPKex2的k_cat和k_cat/K_m值分别为SCKex2的4.8倍和3.3倍。

猪瘟病毒Erns蛋白在毕赤酵母中的表达及其单克隆抗体制备猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）是一种广泛存在于猪群中的重要病原体，能够引发猪瘟病，造成猪群的高度死亡率和经济损失。

在猪瘟病毒的感染过程中，Erns 蛋白是一种重要的病毒复制关键蛋白，参与了病毒的传播和感染过程。

因此，对Erns蛋白的表达以及单克隆抗体的制备具有重要的意义。

毕赤酵母（Pichia pastoris）由于其高效的蛋白表达系统而被广泛应用于蛋白的大规模表达和生产。

本研究旨在通过毕赤酵母表达系统，高效表达猪瘟病毒Erns蛋白，并制备该蛋白的单克隆抗体，为猪瘟病毒的研究和诊断提供有力的工具。

首先，我们设计并合成了Erns蛋白的基因序列，并将其插入到毕赤酵母的表达载体pPIC9K中。

随后，经过线性化的表达载体被转化到毕赤酵母GS115株中，并通过选择性培养基筛选获得了Erns蛋白表达的毕赤酵母克隆株。

接下来，我们通过过量表达和纯化的方法获得了Erns蛋白。

采用高效的毕赤酵母表达系统，Erns蛋白以可溶性形式大量表达，在组织细胞切碎后，通过负离子型交换层析、附着亲和层析和凝胶过滤层析等步骤得到了高纯度的Erns蛋白样品。

接下来，我们进行了Erns蛋白的功能鉴定。

通过Western blot技术，我们证实了纯化的Erns蛋白具有特异的免疫反应性，能够与猪瘟病毒感染过程中产生的抗Erns抗体结合。

此外，我们还进行了抗原性分析，并通过ELISA实验验证了Erns蛋白在猪瘟病毒感染期间的高免疫原性。

在制备Erns蛋白的过程中，为了获得高效表达的Erns蛋白并提高表达量，我们优化了表达条件和培养基成分，提高蛋白的纯度和产量。

同时，为了获得高效的单克隆抗体，我们采用了Erns蛋白作为抗原，免疫小鼠，并通过细胞融合技术制备Erns蛋白的单克隆抗体。

通过免疫小鼠、融合细胞和限制性稀释法，我们获得了高效、特异性的Erns单克隆抗体。

毕赤酵母组成型高效表达启动子的筛选鉴定石义超;王凤忠;江均平;朱利泉【摘要】为获得高产量、高活性的葡萄糖氧化酶(GOD)酵母表达菌株,优化了GOD的T132S/T56V双突变编码序列,将之克隆到表达载体pGAPk上得到表达载体pGAPk-h2-GOD,以pGAP启动GOD基因的表达.将pGAPk-h2-GOD上的pGAP启动子替换为pGCW14和pAOX1,并对pGCW14启动子进行改造,得到3种pGCW14的改造体,最终得到包括pGAPk-h2-GOD在内的6种不同启动子的重组表达载体.将这6种载体转化毕赤酵母GS115,建立了一种简便高效的筛选方法初步筛选出GOD重组菌株,再对筛选到的转化子进行发酵培养,测定发酵上清液的GOD酶活力,以此来比较各种启动子启动效率的强弱.结果显示:pGCW14的启动效率是pGAP的3～5倍,改造后的启动子pGCW14+ G20A/C-467T(0.767)和pGCW14-UA(0.689)的启动效率较原始的pGCW14(0.574)都有明显的提高,尤其pGCW14+ G20A/C-467T启动效率最高,比原始pGCW14提高了32.5％左右.与诱导型启动子pAOX1 (1.187)相比,pGCW14+ G20A/C-467T(1.109)的启动效率仅比其低6.6％左右.结论:改造后的启动子可望在毕赤酵母组成型高效表达的研究应用中具有一定的前景.【期刊名称】《食品工业科技》【年(卷),期】2018(039)013【总页数】7页(P110-116)【关键词】葡萄糖氧化酶;巴氏毕赤酵母;启动子pGCW14;组成型表达【作者】石义超;王凤忠;江均平;朱利泉【作者单位】西南大学农学与生物科技学院,重庆400715;中国农业科学院农产品加工研究所,北京100193;中国农业科学院农产品加工研究所,北京100193;西南大学农学与生物科技学院,重庆400715【正文语种】中文【中图分类】TS201.3随着基因工程技术和蛋白异源表达的飞速发展,越来越多的表达系统被建立并得到广泛应用。

毕氏酵母蛋白表达系统原理1.引言1.1 概述概述在生物科学研究中，表达外源蛋白是一个常见的实验手段，用以研究蛋白的结构和功能。

而毕氏酵母蛋白表达系统作为一种重要的表达系统之一，已经被广泛应用于各个领域，包括基因工程、药物研发和生物制药等。

本文将对毕氏酵母蛋白表达系统的基本原理和优势进行详细介绍。

毕氏酵母（Pichia pastoris）是一种单细胞真菌，具有高效的蛋白表达能力和较高的细胞密度。

毕氏酵母蛋白表达系统是基于毕氏酵母的遗传工程技术，通过将外源基因嵌入到毕氏酵母的基因组中，使其能够产生大量特定蛋白。

其主要原理是利用毕氏酵母的内源启动子和信号序列来调控外源基因的表达，并通过细胞代谢途径来实现对外源蛋白的正确折叠和修饰。

毕氏酵母蛋白表达系统相比其他表达系统具有许多优势。

首先，由于毕氏酵母的生长速度较快，表达时间相对较短，可以迅速得到目标蛋白。

其次，毕氏酵母能够产生大量的外源蛋白，产量可以达到克级甚至克拉级。

此外，毕氏酵母蛋白表达系统具有高选择性，外源基因在毕氏酵母中的稳定性较高，避免了外源基因的丢失或突变。

总之，毕氏酵母蛋白表达系统是一种广泛应用的表达系统，其基本原理和优势使其成为生物科学研究中重要的工具。

本文将进一步深入介绍毕氏酵母蛋白表达系统的基本原理和其在科学研究和应用中的潜力。

1.2 文章结构文章结构部分的内容如下：文章结构部分旨在介绍本文的整体框架和各个章节的内容安排，以便读者更好地理解和阅读本文。

本文包含引言、正文和结论三个主要部分。

1. 引言部分（Introduction）是文章的开篇，旨在引起读者的兴趣并提供对毕氏酵母蛋白表达系统原理的总体概述。

其中，1.1概述部分将简要介绍毕氏酵母蛋白表达系统的基本概念和背景信息；1.2文中结构部分（Article Structure）将详细介绍本文的整体结构安排，以便读者明确每个章节的内容；1.3目的部分（Objective）将说明本文的研究目的和意义，为后续内容提供背景和动机。

一、概述毕赤酵母是一种常见的真菌，它在生物技术和分子生物学领域有着广泛的应用。

在这些领域，研究人员经常需要对蛋白质进行糖基化修饰的研究，而毕赤酵母表达系统正是其中的一种重要工具。

本文将就毕赤酵母表达蛋白糖基化位点的方法进行介绍。

二、毕赤酵母表达系统简介1. 毕赤酵母表达系统的原理毕赤酵母表达系统是指利用毕赤酵母表达载体，将目标蛋白基因导入毕赤酵母中，使其在毕赤酵母中进行表达。

该系统具有高度的复制和表达效率，能够在较短的时间内高效地产生目标蛋白。

2. 毕赤酵母表达系统的优势和应用毕赤酵母表达系统具有许多优势，例如能够进行大规模的表达，提高了蛋白质的产量；同时也能够实现正常的翻译后修饰以及蛋白折叠功能。

在生物技术和分子生物学领域有着广泛的应用，如药物开发、生物能源等领域。

三、毕赤酵母表达蛋白糖基化位点的方法1. 利用质粒表达毕赤酵母表达载体中含有丰富的糖基化因子，对于糖基化位点的研究提供了便利。

研究人员可以将目标蛋白基因克隆至毕赤酵母表达载体中，通过大规模的表达筛选，筛选出糖基化位点进行研究。

2. 利用质粒诱导表达研究人员还可以通过对毕赤酵母进行质粒诱导，使其表达特定的糖基化酶，从而实现对特定蛋白质的糖基化位点的研究。

这种方法能够有效地降低研究成本，是当前常用的研究手段之一。

3. 基因敲除或过表达最近，基因敲除或过表达技术在毕赤酵母的研究中得到了广泛的应用。

研究人员可以通过敲除特定的糖基化酶基因或过表达其基因，从而实现对糖基化位点的研究。

这种方法能够帮助研究人员更深入地了解糖基化位点在蛋白质功能中的作用。

四、毕赤酵母表达蛋白糖基化位点研究的意义1. 为蛋白质功能研究提供重要依据研究糖基化位点能够帮助人们更深入地了解蛋白质的结构和功能。

糖基化位点通常与蛋白质的功能密切相关，通过研究糖基化位点，可以为蛋白质功能的研究提供重要的依据。

2. 为药物研发提供理论支持糖基化位点在药物研发中也有着重要的意义。

许多药物的研发过程中需要考虑蛋白质的糖基化修饰，因此对糖基化位点进行研究能够为药物研发提供理论支持。

巴斯德毕赤酵母及启动子1.1 毕赤酵母表达系统简介随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用。

酵母作为单细胞真核生物，因具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，仍表现出不可比拟的优势。

以甲醇营养型酵母（Methylotrophic yeast）-毕赤酵母为代表的第二代酵母表达系统，是近年来被公认的最有效的外源蛋白表达系统之一，已有多种外源蛋白在该宿主系统中获得了成功表达[1]。

作为生产外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各种不同功能的表达载体，已经得到广泛的应用。

表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等[2,3]。

毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真表达系统。

它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（alcohol oxidase，Aox）码基因AOX1和AOX2，两者序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。

当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢[4]。

含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的因的表达。

随着Invitrogen公司开发的一系列毕赤酵母表达试剂盒的应用，目前用该统已成功表达出了数以千计的来自细菌、真菌、原生动物、植物、无脊椎动物、包括人在内的脊椎动物以及病毒等的具有生物学功能的外源蛋白或蛋白结构[5,6]。

1.1.1 P.Pastoris表达载体及其元件由于毕赤酵母没有稳定的附加质粒，表达载体需与宿主染色体发生同源重组，外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。

典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5′AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或Zeocin)、3′AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。