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1.1 DNA重组技术的基本工具精华篇

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1.1DNA重组技术的基本工具

1.1DNA重组技术的基本工具

1、下列黏性末端属于同种内切酶切割而成的 是 A ① T C G ② A A T T C
A G C T T A A
A G G T T C C A G
③
④
A G C T T C A G
A、①②
B、①③ C、①④ D、②③
2、下列哪一种酶是基因工程的工具酶 A、DNA连接酶 C、RNA酶 B、DNA酶 D、运载体
需要
是否需要模版
不需要
限制酶：磷酸二酯键
解旋酶：氢键
限制酶切割后有两种不同的结果，一种产 生黏性末端，一种产生平末端。那么恢复它们的 连接时，所用DNA连接酶是否可以不加选择？
E.coliDNA连接酶：连接黏性末端 T4DNA连接酶：连接黏性末端和平末端
3、基因的运输工具——运载体


作为载体没有切割位点将怎样？ 假如目的基因导入受体细胞后不能复制将 怎样？ 目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？ 如果载体对受体细胞有害将怎样？
理：基因重组
操作水平：DNA分子水平 结 果：定向地改造生物的遗传性状， 获得人类所需要的品种。
思考



在自然界中有一些生物的DNA可能进入另一 种生物的细胞中。我们有没有学过相关的实 例？ 现今存在的生物为什么没有在长期的进化过 程中被外源DNA的入侵而灭绝，仍能保持一 种稳定状态？ 怎样才能使外来的DNA失效从而保护自身？
限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不 同限制酶切割形成的DNA片段：
(1) …CTGCA
…G （4） …G …CTTAA (7) GT…
(2) …AC
(3) GC…
…TG CG… (5) G… (6) …GC ACGTC… …CG

1.1_DNA重组技术的基本工具

1.1_DNA重组技术的基本工具

三、“分子运输车” ——载体
1 2
载体需要的条件：
⑴ 有1~多个限制酶切点 ⑵对受体细胞无害 ⑶导入基因能在受体细胞中复制、表达 ⑷有某些标记基因，便于筛选
常用运载体：
⑴细菌的质粒 ⑵λ噬菌体衍生物或某些动植物病毒。
常用的载体：质粒
有标记基因的 存在，可用含 氨苄青霉素的 培养基鉴别
有切割位点 能复制并带着 插入的目的基 因一起复制
课堂练习：
3.以下说法正确的是
（C ）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的 核苷酸序列
B、质粒是基因工程中唯一的运载体
C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个 限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来
SmaⅠ EcoRⅠ
1. 作用特点——断开磷酸二酯键 磷酸二酯键
H
5 4
A
1
H
5 4
A
1
O
H
H
3HO
2
H2O +
3
2
H
5 4 3
T
1 2
H
5 4 3
T
1 2
H
H
1. 作用特点——断开磷酸二酯键 限制性内切酶与DNA解旋酶的区别 限制酶
区别
DNA解旋酶
切割特定的核苷酸序列 将DNA两条链的氢键 的磷酸二酯键 打开形成两条单链
想一想：完成抗虫棉的培育，需要哪些关键工作？
基因工程培育抗虫棉的简要过程：
苏云金芽孢杆菌
提取
普通棉花(无抗虫特性) 转基因棉花含抗虫基因 转基因棉花产生伴胞晶体 转基因棉花有抗虫特性
抗虫基因
通过运载体导入
思考：在以上过程中关键步骤或难点是什么？

DNA重组技术的基本工具

DNA重组技术的基本工具

游离的DNA片段
单个的脱氧核苷酸
形成完整的DNA分 子
基因工程
形成DNA的一条链
DNA复制
三、基因进入受体细胞的载体---“分子运输车”
• 1、常用载体类型： • 1）质粒 • 2）噬菌体或某些动植物病毒
•2、最常用的载体——质粒 •来源：质粒主要存在于细菌、酵母菌等生物 中。 •结构：是一种裸露的、结构简单、独立于细 菌拟核DNA之外，并且具有自我复制能力的 双链环状DNA分子， •如下图所示：
5.如图，就下列与核酸相关酶的作用机理填空：
①限制酶 ②解旋酶 ③DNA连接酶 ④DNA聚合酶 ⑤RNA聚合酶
b a
A.切断a处的酶为_______ ① B.连接a处的酶为_______ ③④ C.切断b处的酶为_______ ② D.连接b处的酶为_______ 无
已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因，现探讨 某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么？请设计实验、预 期实验结果，并得出相应的实验结论。 A 不添加抗 生素 B 添加一定浓 度的四环素 C 添加一定浓度 的氨苄青霉素 D 添加一定浓度 的两种抗生素
专题一 基因工程
1.1DNA重组技术的基本工具
• 回顾：
• 基因工程：又名DNA重组技术，就 是按照人们的意愿，把一种生物的 某种基因提取出来，加以修饰和改 造，然后放到另一种生物的细胞， 定向改造生物的遗传性状。
基因工程的别名 原理 操作环境
DNA重组技术 基因重组 生物体外
操作对象
操作水平
基因
DNA分子水平
基本过程
结果
剪切—拼接—导入—表 达
人类需要的新生物类型 产品
• 苏云金芽孢杆菌含有一种可以合成毒蛋白的基因， 如何让这种基因在棉花中表达，培育出抗虫棉？

课件6：1.1 DNA重组技术的基本工具

课件6：1.1 DNA重组技术的基本工具

1.1 DNA重组技术的基本工具（工欲善其事，必先利其器）
1、限制性核酸内切酶（限制酶）—“分子手术刀” （1）来源:主要从原核生物中分离出来。
1.1 DNA重组技术的基本工具（工欲善其事，必先利其器）
1、限制性核酸内切酶（限制酶）—“分子手术刀” （2）作用
识别双链DNA分子 的某种特定核苷酸 序列，并且使每一 条链中特定部位的 两个核苷酸之间的 磷酸二酯键断开。
六核苷酸，平端切口
1.1 DNA重组技术的基本工具（工欲善其事，必先利其器）
1、限制性核酸内切酶（限制酶）—“分子手术刀” （4）结果
1.1 DNA重组技术的基本工具（工欲善其事，必先利其器）
2、DNA连接酶—“分子缝合针”
与DNA有关的四种酶
酶的种类
作用底物
限制酶
DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA解旋酶
Alu I
‥ ‥A G C T ‥‥ ‥ ‥T C G A ‥ ‥
Bam H I
‥ ‥G G A T C C ‥‥ ‥ ‥C C T A G G ‥‥
四核苷酸，平端切口 六核苷酸，粘端切口
Bgl I Eco R I
‥ ‥A G A T C T ‥‥ ‥ ‥T C T A G A ‥‥
‥ ‥G A A T T C ‥‥ ‥ ‥C T T A A G ‥‥
形成单链DNA
1.1 DNA重组技术的基本工具（工欲善其事，必先利其器）
3、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
（1）载体的作用 （2）载体需要具备的 条件 （3）常见的载体
重组质粒
1.1 DNA重组技术的基本工具（工欲善其事，必先利其器）
3、基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
（1）载体的作用

1.1DNA重组技术的基本工具

1.1DNA重组技术的基本工具

1.1 DNA重组技术的基本工具
• 解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？ 关键步骤一的工具：分子手术刀—限制性内切酶
关键步骤二的工具： 分子缝合针—DNA连接酶
关键步骤三的工具： 分子运输车—运载体
１、基因的分子手术刀——限制性核酸内切酶 ①分布：主要在微生物中 ②功能特点：特异性——识别特定核苷酸序 列，切割特定切点（磷酸二酯键断开： 一段 （限制酶）
基因工程是指按照人们的意愿，进行严格 的设计，并通过DNA重组和转基因等技 术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造 出更符合人们需要的新的生物类型和生物 产品。由于基因工程是在分子水平上进行 设计和施工的,因此又叫做 DNA重组技术 或基因拼接技术 。
阅读P2-3
基因工程的诞生
基础理论 技术的发展
G
C T ห้องสมุดไป่ตู้ A A
A A T T C
G
①连接部位：磷酸二酯键——DNA的中磷酸与 (脱氧)核糖之间的连接 ②结果：两个相同的黏性末端或平末端连接 思考：用DNA连接酶“缝合”两个相同的黏性 末端要连接几个磷酸二酯键？ 两个
（3） DNA连接酶分类（根据来源）：
E· coliDNA连接酶 和T4DNA连接酶 两种酶的区别见P5 （4）DNA连接酶和DNA聚合酶的区别 都是形成磷酸二酯键，DNA连接酶是 在两个DNA片段之间，不是在单个核苷酸 与DNA片段之间；连接双链DNA的缺口， 不能连接单链DNA；不需要模板。 DNA 聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核 苷酸通过磷酸二酯键形成一条与DNA模板 链互补的DNA链。 二者都是蛋白质，但组成和性质各不 相同。
基因工程的工具
• 基因工程培育抗虫棉的简要过程：
苏云金芽孢杆菌

1.1DNA重组技术的基本工具

1.1DNA重组技术的基本工具

3、基因进入受体细胞的运载体


天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体 吗？为什么？ 作为运载体的条件： （1）必需有一个或多个限制酶的切割位点 ，以便目的基因可以插入到运载体上去，而 且这些位点所处的位置，还必须是在质粒本 身需要的基因片段之外，这样才不至于因目 的基因的插入而失活。 （2）必需具备自我复制的能力，或整合到 受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步 复制。
C
A
A T T C
T
T A A G
DNA重组技术的基本工具
“分子手术刀”——限制性核酸内切酶
黏性末端 黏性末端
DNA重组技术的基本工具
限制性核酸内切酶
1.特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，在特定 的切点切割。 2.结果：产生黏性末端（碱基互补配对）、平末端。 3.举例：大肠杆菌的一种限制酶（EcoRⅠ)能识别 GAATTC序列，并在G和A之间切开形成黏性末端， SmaⅠ能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切割形成平 末端 。 4.分布：主要在微生物中,特别在原核生物中迄今 从不同的微生物中分离出了约4000种限制酶。

DNA重组技术的基本工具
• 要想获得某个特定性状的基因必须要用限制 酶切几个切口？可产生几个黏性末端？ 要切两个切口，产生四个黏性末端。 • 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶 来切割，会怎样呢？ 会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性 末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA 分子了。
1、限制性核酸内切酶——“分子手术刀 ”

为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的 DNA？ 因为微生物在长期的进化过程中形 成了一套完善的防御机制，对于外源入 侵的DNA可以降解；含有某种限制酶的细 胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶 的识别切割序列，或者通过甲基化酶将 甲基转移到所识别序列的碱基上，使限 制酶不能将其切开。

1.1DNA重组技术的基本工具

1.1DNA重组技术的基本工具
质粒、 λ噬菌体衍生物 、动植物病毒
欢迎进入朱建标老师之《生命课堂》
练习
1.以下说法正确的是 （C ）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷 酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多 个限制酶切点，以便与外源基因连接 D 、 DNA 连接酶使黏性末段的碱基之间形 成氢键
8、在基因工程中，科学家所用的“分子手术 刀”“分子缝合针”“载体”分别是指（ D）
A.大肠杆菌病毒、质粒、DNA连接酶 B.噬菌体、质粒、DNA连接酶 C.DNA连接酶、RNA连接酶、质粒 D.DNA限制酶、DNA连接酶、质粒
欢迎进入朱建标老师之《生命课堂》
9、下列哪项不是基因工程中最基本的操作工 具（ C）
欢迎进入朱建标老师之《生命课堂》
思考题：
• 要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切口？可 产生几个黏性末端？一个目的基因有几个黏性末端？
要切两个切口，产生四个黏性末端，两个。
• 如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会 怎样呢？ 会产生相同的黏性末端。 • 是不是把两者的黏性末端黏合起来，这样就真的合成 重组的DNA分子了? 实际还不够,还需要DNA连接酶进行连接。
欢迎进入朱建标老师之《生命课堂》
什么叫平末端？ 平末端是如何形成的？
当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开 的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口 叫平末端。
欢迎进入朱建标老师之《生命课堂》
当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，产生的是黏性末端。 当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，产生的是平末端。
欢迎进入朱建标老师之《生命课堂》
6、作为基因的运输工具-运载体，必须具备的 条件及理由是( A )

1.1DNA重组技术的基本工具--精华版

1.1DNA重组技术的基本工具--精华版

2021/8/2
22
自主学习
阅读课本第5页“分子缝合针”——DNA连 接酶的相关内容，填写下表
类型
来源 相同点
功能
差别
E·coliDNA连接酶 大肠杆菌 恢复磷 只能连接黏性末端
T4DNA连接酶
T4噬菌体
酸二酯 键
能连接黏性末端和 平末端(效率较低)
2021/8/2
23
DNA连接酶的作用
把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将 脱氧核糖和磷酸连接起来催化形成磷酸二酯 键
2021/8/2
能被限制性内切酶特 异性识别的切割部位
都具有回文序列： 在切割部位，一条链 正向读的碱基顺序与 另一条链反向读的顺
序完全一致。
14
EcoRI限制酶的作用
大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能识别 GAATTC序列，并在G和A之间切开。
在G与A之 间切割
中轴线
2021/8/2
15
EcoRI限制酶的切割
的一类酶。
2.种类与命名： 约4000种
3.作用： 识别特定的核苷酸序列，断裂磷酸二酯键。
4.作用结果： 形成粘性末端或平末端
2021/8/2
9
自主学习
阅读课本4-5页“限制性核酸内切酶——分 子手术刀”的相关内容，填写下表
来源 主要从原核生物中分离纯化而来
种类 特点
已经分离出大约4000种
1、识别双链DNA分子的某种特定核 苷酸序列
关键步骤一： 抗虫基因从苏云金芽孢杆菌 细胞内提取出来
“分子手术刀”—— 限制性核酸内切酶
关键步骤二： 形成重组DNA
“分子缝合针”—— DNA连接酶
关键步骤三： 重组DNA导入受体(棉花)细胞

1.1DNA重组技术的基本工具

1.1DNA重组技术的基本工具

酸连接成链（形成磷酸二脂键）
真核 细胞 原核 细胞
A
G
C
T
T
G
C
A
解决培育抗虫棉的关键步骤需要哪些工具？
片段 ，要把相关的目的 基因是具有遗传效应的DNA______ 基因提取出来，首先需要什么工具？
关键步骤一的工具： 基因的剪刀——限制酶
一、 “分子手术刀” —— 限制性核酸内切酶（限制酶） 主要是从原核生物中分离纯化出来的一种 1.来源 酶。能将外来的DNA切断，由于这种切割 和种类：
据此分析,这两种限制性内切酶在该 DNA 分子上的限制酶切位 点数目分别是： Hind Ⅲ _____个， BamHⅠ_____个。
问题：为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？你能推 测这类酶存在于原核生物中的作用是什么吗？
这些细菌的DNA分子中
要么不具备这种限制酶的识别切割序列，
或者通过生化反应将所识别序列的碱基结构改变，使限制酶 不能将其切开。
例：在DNA测序工作中,需要将某些限制性内切酶的 限制酶切位点在DNA上定位,使其在成为 DNA 分子 中的物理参照点。这项工作叫做“限制酶图谱的构 建”。 假设有以下一项实验:用限制酶 Hind Ⅲ 、 BamHⅠ和二者的混合物分别降解一个4kb (1kb即 1千个碱基对)大小的线性 DNA 分子,降解产物分别 进行凝胶电泳,在电场的作用下,降解产 物分开,如下 图所示:
实例1
培育转基因大肠杆菌的简要过程：
人体组织细胞
（能分泌胰岛素）
提取
普通大肠杆菌
(不能分泌胰岛素) 大肠杆菌
(含胰岛素基因)
胰岛素基因
与运载体DNA拼接 导入
转基因大肠杆菌
(能分泌胰岛素)

1.1DNA重组技术的基本工具

1.1DNA重组技术的基本工具

（二）DNA重组技术的基本工具 DNA重组技术的基本工具
2.条件： 2.条件： 条件 A.能够在宿主细胞中复制并稳定地保存 A.能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 复制并稳定地保存。 B.具多个限制酶切点， B.具多个限制酶切点，以便与外源基因 连接。 连接。 C.具有某些标记基因，便于进行筛选 C.具有某些标记基因，便于进行筛选。 具有某些标记基因 筛选。 如抗菌素的抗性基因、 如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应 的基因等。 的基因等。
切断的DNA片段要与受体细胞的 片段要与受体细胞的 切断的 DNA连接，你觉得可以用什么酶？ 连接， 连接 你觉得可以用什么酶？
基因的针线──DNA 基因的针线──DNA连接酶 ──DNA连接酶
DNA聚合酶和 聚合酶和DNA连接酶有何 聚合酶和 连接酶有何 相同点和不同点？ 相同点和不同点？
DNA连接酶 连接酶 连接DNA链 连接部位 双链
基因片段
质粒DNA 质粒DNA
重组DNA 重组DNA
重组DNA技术基本原理： 重组DNA技术基本原理：切、接、转、筛 DNA技术基本原理
（二）DNA重组技术的基本工具 DNA重组技术的基本工具
基因工程培育抗虫棉的关键步骤 需要哪些工具？ 需要哪些工具？
分子手术刀—限制性内切酶 分子手术刀 限制性内切酶 分子缝合针—DNA连接酶 分子缝合针—DNA连接酶 分子运输车— 分子运输车—运载体
能复制并带着插 入的目的基因一 起复制
（二）DNA重组技术的基本工具 DNA重组技术的基本工具
大肠杆菌的质粒： 最常用的质粒是大 大肠杆菌的质粒：
肠杆菌的质粒， 肠杆菌的质粒，其 中常含有抗药基因， 中常含有抗药基因， 如四环素的标记基 因。质粒的存在与 否对宿主细胞生存 没有决定性作用， 没有决定性作用， 但复制只能在宿主 细胞内成。 细胞内成。

DNA重组技术的基本工具(很全)

DNA重组技术的基本工具(很全)

注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口， 但不能连接单链DNA！
DNA连接酶的缝合作用
T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来， 但效率较低
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？
DNA聚合酶的作用
A A T T G
T
T
A
A
C
DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶
第1 节
问题探讨
手术刀
培育抗虫棉 缝合针 需要哪些基 运输工具 本工具 ?
基因工程的概念
• 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的 设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋 予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们 需要的新的生物类型和生物产品。
基因工程的别名 操作环境 基因拼接技术或DNA重组技术 生物体外
都能催化形成磷酸二酯键
都是蛋白质 不需要 在两个DNA片 段之间形成磷 酸二酯键 需要
只能将单个核苷 酸连接到已有的 DNA片段上，形 成磷酸二酯键
作用结果
用途
形成完整的重 组DNA分子 基因工程
形成DNA的一条 链
DNA复制
小试身手
例：限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限 制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。在质粒上有 酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶Ⅱ的切点。 （1）请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。
通过长期的进化，一部分细菌细胞中含有某种限制酶， 其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者 通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限 制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶 也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA 的入侵。

DNA重组技术的基本工具

DNA重组技术的基本工具

特点：
（1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存
（2）具多种限制酶的单一切点，以便与外源基 因连接
（3）具有某种标记基因，便于进行筛选
• 常用的运载体：质粒
有标记基因的 存在，可用含 氨苄青霉素的 培养基鉴别
有切割位点 能复制并带着 插入的目的基 因一起复制
小结
限制酶
基因工程 DNA连 接酶
主要存在于原核生物中 具有专一性(识别序列) 切开DNA分子的磷酸二酯键 连接磷酸二酯键 E.coliDNA连接酶 种类 T4 DNA连接酶 结构简单,大小适中 能在宿主细胞中自 具备的 我复制并稳定存在 条件 具一个多个限制酶切位点 具标记基因
1.1 DNA重组技术的基本工具
呼 风 唤 雨
角似鹿、鼻似狮、目似虎、
腾 云 驾 雾
唇似牛、爪似鹰、髭似马、鳞似鱼、身似蛇
转鱼抗寒基 因的番茄
不会引起过敏的转基因大豆
乳汁中含有人生长激素的转基 因牛(阿根廷)
基因工程的概念
基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重 组技术。 通俗的说就是按照人们的意愿，把一种 生物的某种基因提取出来，加以修饰改 造，然后放到另一种生物的细胞里，定 向的改造生物的性状。
DNA连接酶的作用过程
点击播放
（二）“分子缝合针”——DNA连接 酶 ③类型：
类型 来源 功能 相同点 差别
E· coliDNA连接酶 大肠杆菌 恢复 只能连接黏性末端 磷酸 二酯键 能连接黏性末端和 T4DNA连接酶 T4噬菌体 平末端(效率较低)
E· coli DNA连接酶
或T4DNA连接酶
G
A A C T T A A G
P P
G A
T
T C
磷酸二酯键

1.1DNA重组技术的基本工具

1.1DNA重组技术的基本工具

运载体必须具备什么条件？
5、运载体DNA分子大小应适合，以便提取 和在体外进行操作，太大就不便操作。
P7：3、天然DNA分子可以直接 用作基因工程运载体吗？ 自然存在的质粒DNA分子并不完全具 备上述条件，往往都要进行人工改造 后才能用于基因工程操作。
运载体存在于许多细菌和酵母菌中，作为运载体几个条 件的具体表现： 最常用的是大肠杆菌的质粒。 独立于细菌拟核DNA之外 1、复制原点： 的一种可以自我复制、 说明能复制并能带着 双链闭环的裸露DNA分子
限制酶作用过程：
注意观察限制酶切割的部位
重播
限制酶的切点：

磷酸二酯键
磷酸和脱氧 核糖之间的 化学键
磷 酸 二 酯 键
根据限制酶作用特点分析：
P7：2、原核生物限制酶为什么不剪
切本身的DNA？
原核生物本身的DNA分子中一般不 具备这种限制酶的识别切割序列。
限制酶所识别的序列有什么特点
大多数由6个核苷酸组成，少数4、5或8个。 呈碱基互补对称，无论是奇数个还是偶数个碱 基，都可以找到一条中轴线，其两侧的双链 DNA上的碱基是反向对称重复排列的。
GAA TTC CTT AAG
CCAGG GGTCC
中轴线两侧分别切开
（大肠杆菌)
黏性末端
(粘质沙雷氏菌)
序列中轴线处切开
平末端
将切下来DNA片段拼接成新的DNA分子， 可用什么酶？
二、DNA连接酶——”分子缝合针 “
DNA连接酶的作用过程
探讨1：DNA连接酶连接的是什么部位？
限制酶切割后有两种结果：黏性末 端或平末端。恢复它们的连接时， 所用DNA连接酶是否可以不加选择？
”
一、限制酶——”分子手术刀 “

1.1DNA重组技术的基本工具

1.1DNA重组技术的基本工具

T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合” 起来，但效率较低
DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗▲？ 不同，DNA聚合酶是在复制过程中将一个 个游离的脱氧核苷酸连接在子链上。 相同点是都参与形成磷酸二酯键。
DNA连接酶
相同 点
模板
形成磷酸二脂键 不要
作用对象
不同 点 结果
DNA片断 完整DNA分子
(2)用 Taq DNA 聚合酶进行 PCR 扩增获得的目的基因片段，其两端各自带 有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体 P1 用酶处理，在两端各添加了一个碱基为 __________的脱氧核苷酸，形成 P2；P2 和目的基因片段在________酶作用下， 形成重组质粒 P3。
(3)为筛选出含有重组质粒 P3 的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛 选，得到 A、B、C 三类菌落，其生长情况如表(“＋”代表生长，“－”代表 不生长)。根据表中结果判断，应选择的菌落是________(填表中字母)类，另外 两类菌落质粒导入情况分别是____________、_______________。
(3)由题意可知，构建重组质粒时四环素抗性基因被破坏，所以导入目的基因的菌 落只能在没有抗生素或含有氨苄青霉素的培养基中存活，应该选 B 类菌落。A 类 菌落能在表中所示条件下存活，说明导入的是 P0 质粒。C 类菌落只能在无抗生素 的培养基中存活，说明 C 类菌落没有导入质粒。(4)据图分析，目的基因的外侧链 只能用丙作引物，内侧链可用甲、乙作引物，如果用甲、丙作引物，则无论目的 基因是否插入正确，都能通过 PCR 技术扩增大量目的基因；如果用乙、丙作为引 物，当目的基因插入不正确(反向插入)时，则乙、丙两引物都结合在外侧，PCR 不 能正常进行，无法进行扩增鉴定，因此只能选用乙、丙作为引物，通过 PCR 鉴定 目的基因是否插入正确。若扩增出的 DNA 片段为 400 bp，则正好是目的基因反向 连接后，外侧链用乙作引物，内侧链用甲作引物扩增出的片段。
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限制性核酸内切酶——“分子手术刀” 分子手术刀” 限制性核酸内切酶 分子手术刀
内切酶切割DNA后形成的末端—— 内切酶切割DNA后形成的末端 DNA后形成的末端 黏性末端、 黏性末端、平末端
EcoRⅠ EcoRⅠ
黏性末端
黏性末端
SmaⅠ SmaⅠ
平末端
平末端
切断的DNA片段要与受体细胞的 片段要与受体细胞的 切断的 DNA连接，你觉得可以用什么酶？ 连接， 连接 你觉得可以用什么酶？
基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、 基因的大小以纳米计算，要对它进行剪切、 拼接等操作，没有非常精细的工具是不行的。 拼接等操作，没有非常精细的工具是不行的。进 行基因操作最少需要以下三种工具： 行基因操作最少需要以下三种工具： • 准确切割DNA的工具（“分子手术刀”） 准确切割DNA的工具 的工具（ 分子手术刀” ——限制性内切酶 限制性内切酶 • DNA片段的连接工具（“分子缝合针”） 片段的连接工具（ 分子缝合针” 片段的连接工具 ——DNA连接酶 连接酶 • 基因转移工具（“分子运输车”） 基因转移工具（ 分子运输车” ——基因进入受体细胞的载体 基因进入受体细胞的载体
• 此转基因实验实现了哪种生物的哪 些性状在另外哪种生物中表达？ 些性状在另外哪种生物中表达？ • 性状的表达与我们从前学过的什么 过程有关？ 过程有关？ • 要实现药物基因在烟草中的表达， 要实现药物基因在烟草中的表达， 要提前做哪些关键工作? 要提前做哪些关键工作?
DNA重组技术的基本工具 重组技术的基本工具
作为载体的必要条件
• • • • 能自我复制 有切割位点 有遗传标记基因 对受体细胞无害、 对受体细胞无害、容易分离
3、基因的运输工具——运载体 基因的运输工具 运载体
有标记基因的存 在，将来可用含 青霉素的培养基 鉴别。 鉴别。
有切割位点
能复制并带着插 入的目的基因一 起复制
一、基因工程的概念
基因工程是指按照人们的愿望， 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格设 并通过体外DNA重组和转基因等技术， DNA重组和转基因等技术 计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生 物以新的遗传特性，从而创造出符合人们需要的 物以新的遗传特性， 新的生物类型和生物产品，又叫DNA DNA重组技术 新的生物类型和生物产品，又叫DNA重组技术 1、定向改造生物遗传性状 操作环境：体外环境 2、操作环境：体外环境 操作对象： 3、操作对象：基因 操作水平： 4、操作水平： 分子水平 DNA分子水平 DNA 5、实质： 基因重组 实质：
二、限制性核酸内切酶——“分子手术刀” 限制性核酸内切酶——“分子手术刀” ——
来源 特点 作用结果
三、DNA连接酶——“分子缝合针” DNA连接酶——“分子缝合针” 连接酶——
种类 作用结果
四、载体——“分子运输车” 载体——“分子运输车” ——
种类 特点 作用结果
基因的针线──DNA 基因的针线──DNA连接酶 ──DNA连接酶
DNA聚合酶和 DNA聚合酶和DNA连接酶有何 聚合酶和DNA连接酶有何 相同和不同点？ 相同和不同点？
阅读思考
限制酶切割后有两种不同的结果， 限制酶切割后有两种不同的结果， 一种产生黏性末端，一种产生平末端。 一种产生黏性末端，一种产生平末端。 那么恢复它们的连接时，所用DNA DNA连 那么恢复它们的连接时，所用DNA连 接酶是否可以不加选择？ 接酶是否可以不加选择？
基因进入受体细胞的载体
假如目的基因导入受体细胞后不能复制 将怎样？ 将怎样？ 作为载体没有切割位点将怎样？ 作为载体没有切割位点将怎样？ 目的基因是否进入受体细胞，你如何察 目的基因是否进入受体细胞， 觉？ 如果载体对受体细胞有害将怎样？ 如果载体对受体细胞有害将怎样？如果 不能分来的DNA 从哪里可以找到这种切割外来的DNA 而对自身不切割的物质？ 而对自身不切割的物质？ • 这种酶具有什么作用？ 这种酶具有什么作用？
限制性核酸内切酶的作用： 限制性核酸内切酶的作用： 1.能识别特定核苷酸序列； 能识别特定核苷酸序列； 能识别特定核苷酸序列 2.从特定部位的两个核苷酸之间切开。 从特定部位的两个核苷酸之间切开。 从特定部位的两个核苷酸之间切开
思考
• 在自然界中有一些生物的DNA可能进入另一 在自然界中有一些生物的DNA可能进入另一 DNA 种生物的细胞中。 种生物的细胞中。我们有没有学过相关的实 例？ • 现今存在的生物为什么没有在长期的进化过 程中被外源DNA的入侵而灭绝， DNA的入侵而灭绝 程中被外源DNA的入侵而灭绝，仍能保持一 种稳定状态？ 种稳定状态？ • 怎样才能使外来的DNA失效从而保护自身？ 怎样才能使外来的DNA失效从而保护自身？ DNA失效从而保护自身
1.1 DNA重组技术的基本工具 DNA重组技术的基本工具
资料分析
位于费城托马斯·杰斐逊大学的希拉 位于费城托马斯 杰斐逊大学的希拉 里和她的同事成功地将人体狂犬病抗体 DNA译码移入烟草作物中 译码移入烟草作物中。 的DNA译码移入烟草作物中。 转基因烟草作物可以产生一种人体 蛋白质， 蛋白质，而这种物质能抗击致命性的狂 犬病病毒。 犬病病毒。