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纯化及鉴定实验报告
1. 实验目的
本实验旨在提取、纯化和鉴定人类血浆中的抗体IgG。
2. 实验步骤
1. 血浆样本制备：
- 收集人类血浆样本，并离心去除细胞成分。
2. 抗体IgG的提取：
- 使用亲和层析技术，将血浆样本加入与IgG特异性结合的柱中，洗脱非特异性蛋白质。
3. 抗体IgG的纯化：
- 将柱中特异性结合的IgG洗脱并收集。
4. 抗体IgG的鉴定：
- 使用免疫学技术（如ELISA或免疫印迹），检测提取的IgG 的纯度和特异性。
3. 实验结果
经过上述步骤，实验成功提取和纯化了人类血浆中的抗体IgG。
通过免疫学技术的鉴定，确定提取得到的IgG具有较高的纯度和特
异性。
具体的实验结果表明人类血浆中存在丰富的抗体IgG。
4. 结论
本实验成功地提取、纯化和鉴定了人类血浆中的抗体IgG。
这
对于进一步研究和应用抗体在医学和生物学领域具有重要意义。
5. 讨论和展望
本实验采用了亲和层析技术和免疫学技术，成功实现了对人类
血浆中抗体IgG的提取、纯化和鉴定。
然而，未来的研究可以探索
更有效的提取和纯化方法，以及进一步验证抗体的功能和应用，扩
展该实验研究的深度和广度。
参考文献
[1] 张三, 李四. 血浆抗体IgG的提取与纯化[J]. 实验生物学杂志, 20XX, XX(X): 123-456.。
纯化抗体IgG使用说明
Purification Antibody
规格：1mg/5mg/10mg
保存-20℃保存，有效期一年以上
产品说明:
纯化抗体IgG采用Protein A/G亲和层析纯化，制成高纯度（﹥95%）和高活性的纯化羊或兔IgG抗体。
纯化抗体IgG为PBS溶液，可根据用户要求，配成不同浓度，用前最好-20℃存放，可根据使用方法采用不同浓度稀释。
通常不同使用目的可分别用下列缓冲液稀释，注意完全溶解后充分混匀。
冻存过久会产生少量聚合体，用前最好低温高速离心，去除冷聚合球蛋白及变性蛋白后重新定量。
抗体标记：500ug～20mg/ml，ELISA包板：10～20ug/ml，层析金条对照线：2mg/ml等。
胶体金标记：用pH9.0硼酸缓冲液稀释。
HRP标记：用0.01mol/L pH9.0CB或用包被液CB稀释。
荧光素标记：用0.5mol/L pH9.5CB（碳酸盐缓冲液）稀释。
生物素标记：用0.1mol/L NaHCO3稀释。
其它方法：如免疫扩散可用0.01mol/L pH7.2PBS稀释。
浓度：
一般情况10mg/ml，具体信息见标签。
相关试剂：
SP034兔IgG免疫球蛋白抗原
SA134羊抗兔IgG(免疫血清)
SF134羊抗兔IgG-FITC
SE237兔抗猪IgG-HRP
A1820HRP标记的抗体稀释液。
亲和层析纯化亲和层析纯化是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，它基于目标分子与特定配体之间的亲和作用，通过选择性地捕获、洗脱和回收目标分子。
本文将从亲和层析纯化的原理、步骤和应用方面进行阐述。
一、亲和层析纯化的原理亲和层析纯化是基于生物大分子之间特异的相互作用原理进行的。
在该方法中，目标分子与具有亲和性的配体发生结合，形成稳定的复合物。
这种特异的结合使得目标分子能够在混合溶液中被选择性地捕获和富集。
亲和作用可以是多种形式，如氢键、离子键、疏水作用等。
根据目标分子和配体之间的亲和性，可以选择不同类型的亲和层析介质，例如亲和树脂、亲和膜等。
亲和层析纯化通常包括以下几个步骤：样品预处理、柱填充与平衡、样品加载、洗脱和目标分子回收。
1. 样品预处理：首先需要将样品进行预处理，如细胞破碎、蛋白质去除等，以获得目标分子的纯化样品。
2. 柱填充与平衡：将选择的亲和层析介质填充到柱子中，并通过流动缓冲液进行平衡，使介质充分湿润。
3. 样品加载：将样品加入到柱子中，目标分子与配体发生亲和结合，被捕获在柱子内。
4. 洗脱：通过改变流动缓冲液的组成、pH值或离子强度等条件，使非特异性结合的杂质分子被洗脱，而目标分子仍保持与配体的结合。
5. 目标分子回收：通过改变条件，使目标分子与配体的结合解除，从而使目标分子得以回收。
这可以通过改变pH、离子强度、温度等来实现。
三、亲和层析纯化的应用亲和层析纯化在生物技术、生物医药等领域得到了广泛应用。
1. 蛋白质纯化：亲和层析纯化可用于从复杂的混合物中纯化目标蛋白质。
例如，通过选择性地捕获具有特定亲和性的标签蛋白质，如His标签、GST标签等，实现目标蛋白质的高效纯化。
2. 抗体纯化：亲和层析纯化也被广泛用于抗体的纯化。
通过使用抗体与特定抗原之间的亲和作用，可以高效地纯化特定抗体。
3. 生物药物纯化：亲和层析纯化在生物药物制造中起着重要的作用。
通过选择性地捕获和富集目标生物药物，可以实现高纯度和高产量的生物药物生产。
亲和层析法离纯化蛋白质的方法亲和层析法是一种利用特定配体与目标蛋白质间的亲和作用来分离和纯化目标蛋白质的方法。
该方法简单、高效、选择性强，并且适用于分离和纯化各种规模和属性的蛋白质，因此被广泛应用于生物化学、分子生物学等领域。
亲和层析法的实验步骤如下：1. 配制亲和柱：将特定的配体化合物固定到柱载体上，例如：Ni2+、Protein A/G、抗体等。
固定过程要注意化合物与柱载体的适应性、配位化合物的浓度和固定条件的优化。
2. 样品制备：将待纯化蛋白质与适当的缓冲液混合，如含有余量目标蛋白质竞争配位位点的化合物、pH、离子强度和结构安定剂等。
3. 样品加载：将样品加入亲和柱顶部，让其通过固定的配体和柱内质子、离子等的相互作用与目标蛋白质结合。
样品通过后，用缓冲液淋洗一段时间以去除无关的物质，并测定逐步洗出的蛋白质含量。
4. 洗脱蛋白质：通过改变洗脱缓冲液的pH值，鸟嘌呤核苷酸、纳米微粒、配体等离子强度和竞争配位位点的化合物，剥离蛋白质与配体的相互作用，释放出目标蛋白质。
蛋白质最终会在柱底部被洗出，收集洗脱后的纯化蛋白质即可。
亲和层析法具有一些优点：1. 选择性强，可用于纯化特定蛋白质。
2. 纯化步骤简单，样品不需预备过多。
3. 取得的蛋白质纯度高。
4. 在蛋白质分子中较不会引起构象或孔洞变化，使分离后蛋白质结构相对完整。
1. 需要合适的配体化合物，且有些化合物不易制备或使用方便性较差。
2. 某些特殊的蛋白质可能无相应亲和层析柱，或需要进行配体修饰。
3. 无法分离某些蛋白质互作产物，因为这些产物与配体的亲和性可能相同或更好。
抗体的提取与纯化精制免疫球蛋白的方法很多。
一般采用综合技术，避免蛋白变性。
如分离IgG时，多结合使用盐析法与离子交换法，以求纯化。
提取IgM的方法也很多，如应用凝胶过滤与制备电泳法，或离子交换与凝胶过滤等。
一、盐析法1.取x ml血清加x ml生理盐水，于搅拌下逐滴加入2x ml饱和硫酸铵，硫酸铵的终饱和度为50%。
4℃，3h以上，使其充分沉淀。
2.离心（3000rpm）,20min,充上清，以x ml生理盐水溶解沉淀，再逐滴加饱和硫酸铵x/2ml。
置4℃3h以上（此时硫酸铵的饱和度为33%）。
3.重复上述第二步过程1～2次。
末次离心后所得沉淀物为γ-球蛋白，以 pH7.4 PBS溶解至x ml装入透析袋。
4.对PBS充分透析、换液3次，至萘氏试剂测透析外液无黄色，即无NH4+为止。
5.取透析袋内样品少许作适当倍数稀释后，以751型紫外分光光度计测定蛋白含量。
影响盐析的因素很多，如蛋白质的浓度，盐的浓度，饱和度和pH，温度等都可影响盐析的结果，操作时要充分注意。
（1）蛋白质的浓度盐析时，溶液中蛋白质的浓度对沉淀有双重影响，既可影响蛋白质沉淀极限，又可影响蛋白质的共沉作用。
蛋白质浓度愈高，所需盐的饱和度极限愈低，但杂蛋白的共沉作用也随之增加，从而影响蛋白质的纯化。
故常将血清以生理盐水作对倍稀释后再盐析。
（2）离子强度各种蛋白质的沉淀要求不同的离子强度。
例如当硫酸铵饱和度不同，析出的成分就不同，饱和度为50％时，少量白蛋白及大多数拟球蛋白析出；饱和度为33％时γ球蛋白析出。
（3）盐的性质最有效的盐是多电荷阴离子。
（4）PH值一般说来，蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度越大。
改变PH改变蛋白质的带电性质，也就改变了蛋白质的溶解度。
（5）温度盐析时温度要求并不严格，一般可在室温下操作。
血清蛋白于25℃时较0℃更易析出。
但对温度敏感的蛋白质，则应于低温下盐析。
（6）蛋白质沉淀后宜在4℃放3小时以上或过夜，以形成较大沉淀而易于分离。
抗核抗体谱(IgG)检测标准操作规程1.目的规范抗核抗体谱(IgG)检测，保证结果的准确性。
2.适用范围检验科免疫组工作人员。
3.试剂规格名称与组成型号名称：ANA 谱 1靶抗原：nRNP/Sm，Sm，SS-A，Ro-52，SS-B，Scl-70，Jo-1，CENP B，dsDNA，核小体，组蛋白，核糖体 P 蛋白类型：IgG基质：抗原包被的检测膜条规格：16×01(16)4.预期用途：用于体外定性检测人血清或血浆中的抗 nRNP、Sm、SS-A（天然 SS-A 和 Ro-52）、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENP B、PCNA、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体P 蛋白和 AMA M2 共 14 种不同抗原 IgG 类抗体。
5.适应症：夏普综合征（MCTD），系统性红斑狼疮（SLE），干燥综合征，进行性系统性硬化症，多肌炎皮肌炎、重叠综合征、局限型进行性系统性硬化症（CREST 综合征），原发性胆汁性肝硬化。
6.临床意义：抗核抗体识别是各种细胞核组分（细胞核的生化成份）[1,2]，包含核酸、细胞核蛋白及核糖蛋白。
可特征性地出现于许多疾病中，尤其是风湿性疾病[3,4,5]。
在炎症性风湿性疾病中，这些抗核抗体的阳性率在 20%到 100%之间，以风湿性关节炎的阳性率最低，在 20%至40%之间。
因此，ANA 鉴别诊断在对个别风湿疾病的确认十分必要，而且对自身免疫性疾病的进一步诊断也很有价值。
[3,6,7,8,9,10,11]风湿疾病—夏普综合征（混合结缔组织病＝MCTD)[8]—系统性红斑狼疮（SLE)[8, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22]—干燥综合征（原发性干燥综合征）[5],—系统性硬化症（系统性硬皮病,SSc)[1, 23],—局限型系统性硬化症（CREST 综合征） [28]—多肌炎/皮肌炎[12,15]—类风湿性关节炎[5]7.主要组成成分：8.储存条件及有效期： 2-8°C 保存，不要冷冻。
IgG片段纯化的实验方法制备IgG的片段，Fab和Fc二、材料检测仪，记录仪，沉析柱，Sephadex G-100,木瓜酶, PH7.0,0.1M的PB缓冲液（含有0.01mol/L半胱氨酸、2mmol的EDTA），PH4.6，0.01M乙酸盐缓冲液, PH4.6，0.2、0.5、0.8M乙酸盐缓冲液，0.075M、PH7.0、含0.075M氯化钠PB缓冲液三、操作步骤1、木瓜酶对IgG的裂解木瓜酶，分子量为21KD，为SH-基蛋白酶，在半胱氨酸存在时才显示活性，水溶液PH为5.2-5.8，最适PH为6.5，无激活剂在水中失活很快，在75℃，PH7.2时，活力降低一半用的时间为56分钟.激活剂有：0.5%焦亚硫酸钠，2.0%半胱氨酸盐酸盐，0.1%EDTA钠盐. 抑制剂有：抑没酶醛肽，胱蛋白酶抑制剂等. 将1毫克的木瓜酶溶解在0.1M的PB缓冲液，立即将酶液加入IgG中，温和混匀37℃反应过夜（16H）2、酶解液的初步纯化（凝胶过滤层析）（一）选用葡聚糖凝胶G-100过滤。
（二）将葡聚糖凝胶G-100在蒸馏水中泡胀24小时，或100度水浴煮胀2小时，倾去上层漂浮颗粒。
（三）用0.075M、PH7.0、含0.075M氯化钠PB缓冲液平衡，然后装柱.（四）选择合适层析柱，样品浓度10-20毫克每毫升为宜，样品体积应为柱床体积的5%左右，但不能少于柱床体积的2%。
（五）以0.5ml/min流速收集。
（六）在洗脱峰中，若IgG未完全裂解，则可洗脱三个峰，第一峰是未消化的IgG，第二峰为Fc和Fab的混合物，第三峰为小分子肽；.若IgG完全裂解，则只有两个峰了.当然，第一峰为Fc和Fab的混合物，且峰最大。
（七）收集峰值，浓缩。
3、离子交换层析（一）凝胶选择：选用强阳离子葡聚糖凝胶。
（二）凝胶预处理：用0.2M NaOH洗，过量的碱用水反复洗涤除去，然后用0.2M HCL洗，过量的酸用水反复洗涤除去。
（三）平衡：用PH4.6，0.01M乙酸盐缓冲液为初始缓冲液平衡。
