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太湖水体中藻蓝蛋白的紫外可见 吸收光谱特征分析

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藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度

藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度

藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度谭一心一、实验目的学习并掌握提取、纯化藻蓝蛋白及紫外可见光谱仪检测纯度的方法。

二、实验原理1冻融法：将细胞置低温下冰冻一定时间，然后取出置室温下（或40℃左右）迅速融化。

如此反复冻融多次，细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时，发生溶胀破碎。

2盐析法：蛋白质在稀盐溶液中，溶解度会随盐浓度的增高而上升（盐溶），但当盐浓度增高到一定数值时，其溶解度又逐渐下降，直至蛋白质析出（盐析）。

盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化膜逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集，并从溶液中析出。

3DEAE—纤维素：二乙基胺乙基纤维素，总交换量0.9meq/g功能基：二乙基胺乙基，弱碱性阴离子交换剂。

原理：含有某些功能基团，可以进行离子交换，性能比一般离子交换树脂温和，适用于分离具有生物活性的大分子，可以将性质相近的大分子物质分开。

1.装柱：装柱前先将层析柱垂直固定在支架上。

装柱的方法分干装和湿装两种。

干装是直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂，此法不易将气泡排尽。

湿装法是先加适量溶剂到柱中，排走其中的空气，然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀，随即将此悬浮液连续倾入柱中，打开柱下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱上端悬浮液缓缓下降到需要的高度，吸附剂表面要平整，应使其一直浸没在溶剂中，以防气泡产生。

2.加样：经过平衡的层析柱当平衡液流到与固定相表面一致位置时，用滴管轻轻把分离样品的溶液加到固定相表面，要尽量避免冲动基质。

加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2（体积越小越有利于提高分辨率）。

3.洗脱：待样品液的液面流到固定相表面时，用滴管加入洗脱剂（5cm），并在柱上端与装有洗脱剂的储液瓶连接开始洗脱。

同时在柱下端与部分收集器接通，立即进行分级收集（按体积或时间分管收集）。

4.测定：随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。

太湖梅梁湾水体悬浮颗粒物和CDOM的吸收特性

太湖梅梁湾水体悬浮颗粒物和CDOM的吸收特性

第26卷第12期2006年12月生 态 学 报AC TA ECOLOGIC A SI NICAVol.26,No.12Dec.,2006太湖梅梁湾水体悬浮颗粒物和CDOM 的吸收特性张运林,秦伯强*,杨龙元(中国科学院南京地理与湖泊研究所,江苏南京 210008)基金项目:中国科学院知识创新工程资助项目(KZCX3-SW -334,KZCX3-SW -350);国家自然科学基金资助项目(40601099,40501064)收稿日期:2005-07-26;修订日期:2006-01-22作者简介:张运林(1976~),男,湖南邵阳人,博士,主要从事水光学、水生态学和水质遥感研究.E -mail:ylzhang@ *通讯作者Correspondi ng author.E_mail:qinbq@ni glas.ac.c nFoundation item :This work was fi nanciall y s upported by the Key Knowledge -Initiated Proj ect from Chi nese Academy of Sciences (No.KZCX3-SW -334,KZCX3-SW -350)and National Natural Science Foundation of China (No.40601099,40501064)Received date :2005-07-26;Accepted date :2006-01-22B iography :Z HANG Yun -Lin.Ph.D.,mainly engaged in water optics,water ecology and water quality remote sens ing.E -mail:ylz hang@ni 摘要:通过测定滤膜上悬浮颗粒物和过滤液中CDOM 吸光度的方法计算得到太湖梅梁湾总颗粒物和CDOM 的光谱吸收系数,并计算了各吸收组份的贡献份额以及吸收与P AR 衰减的比值。

藻胆蛋白的生物合成与光谱分析

藻胆蛋白的生物合成与光谱分析

藻胆蛋白生物合成与光谱分析Biosynthesis and Spectral Analysis ofPhycobiliprotein藻胆蛋白生物合成与光谱分析摘要：藻胆蛋白(Phycobiliprotein)是存在于蓝藻、红藻和隐藻中的一类捕光色素蛋白，可分为藻红蛋白(简称PE)，藻蓝蛋白(简称PC)，别藻蓝蛋白(简称APC)和藻红蓝蛋白(简称PEC)。

重组有藻胆蛋白（本实验只做藻蓝蛋白）基因的E. coli BL21，在含有kana（24 µg/ml）和氯霉素（40.8µg/ml）的LB培养基中培养。

当OD600达到0.5-0.6时，用终浓度为1 mmol/L的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养2.5小时。

加超声缓冲液后用超声破壁离心取上清，得到藻蓝蛋白粗提液。

通过镍-亲和层析对起进行纯化。

关键词：藻胆蛋白生物合成光谱分析Biosynthesis and Spectral Analysis of Phycobiliprotein Abstract：Phycobiliprotein is a kind of light-harvesting chromoprotein existing in blue-green gae, red alga and cryptophyta, which includes phycoarythrin(short form PE), phycocyanin(short form PC), allphycocyanin(short formAPC), phycoerythrocyanin(short form PEC). E. coli BL21 which containsrecombinant phycobiliprotein（only phycocyanin was required in thisexperiment）gene was grown in LB medium containing kanamycin (Finalconcentration: 24μg/mL) and `chloromycetin(Final concentration:40.8μg/mL). When absorbance at 600 nm value was between 0.5 with 0.6,isopropyl β-D-thiogalactopyranoside was added to 1mM（Finalconcentration）and the incubation was continued an addition 2.5 h. Thecell was broken and centrifugated, then the crude cell extract( supernatant)was harvested. Furthermore it was purified by Ni-affinity chromatography. Key words：phycobiliprotein biosynthesis spectral analysis主要符号对照表PE 藻红蛋白PEC 藻红蓝蛋白APC 别藻蓝蛋白PC 藻蓝蛋白PCB 藻蓝胆素PEB 藻红胆素PUB 藻尿胆素PVB 藻紫胆素E.coli 大肠杆菌OD 光吸收值IPTG 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷KPP 磷酸钾缓冲液min 分钟h 小时藻胆蛋白生物合成与光谱分析1引言1.1藻胆蛋白藻胆蛋白(Phycobiliprotein)是存在于蓝藻、红藻和隐藻中的一类捕光色素蛋白，可分为藻红蛋白(简称PE)，藻蓝蛋白(简称PC)，别藻蓝蛋白(简称APC)和藻红蓝蛋白(简称PEC)。

藻胆蛋白的生物合成及光谱分析

藻胆蛋白的生物合成及光谱分析

藻胆蛋白的生物合成及光谱分析作者：邱容朱焱谢雪林作者单位：湖北师范学院生命科学学院0803班（邱容、朱焱）湖北师范学院生命科学学院0801班（谢雪林）摘要: 藻胆蛋白是红藻、蓝绿藻、隐藻中的捕光色素蛋白，主要成分为藻红蛋白(Phycoerythrin,PE)，藻红蓝蛋白(Phycoerythrocyanin,PEC),藻蓝蛋白(Phycocyanin,PC)和别藻蓝蛋白(Allophyxoxyanin,APC)。

本实验只是进行藻蓝蛋白的生物合成及光谱分析，通过将载有藻蓝蛋白基因的质粒导入E.coli中，从而构建能合成藻蓝蛋白的工程菌,通过对工程菌的扩大培养，诱导表达，进而从工程菌中通过亲和层析法提取所需的藻蓝蛋白。

提取的藻蓝蛋白通过紫外可见光谱仪进行光谱分析。

关键词：藻蓝蛋白生物合成光谱分析Abstract: Phycobilin , a kind of protein which can catch light ,exist in Red algae, blue-green algae, cryptomonad.It consists of Phycoerythrin(PE),Phycoerythrocyanin(PEC),Phycocyanin (PC) and Allophyxoxyanin (APC). This report presents the biosynthesis and spectral analysis of the PC, by sending the plasmids carrying the gene which can produce PC into E.coli, thus creating the engineering bacterium which can procuce PC.Through the expanding culture ,induction and the affinity chromatography，we can extract PC from the engeneering bacterium to obtain PC . Extraction of PCcan be spectral analysed by UV-visible spectrometer.Key words：Phycobilin biosynthesis spectral analysis 藻胆蛋白是一种水溶性色素蛋白，存在于红藻、蓝藻、隐藻和某些甲藻体内，是这些藻类特有的光合系统捕光色素，在光合作用中起捕集光能和传递能量的作用，根据结构和光谱特性可将藻胆蛋白分为藻红蛋白、藻蓝蛋白和别构藻蓝蛋白。

藻红蛋白含量可见光吸收光谱的测量

藻红蛋白含量可见光吸收光谱的测量
数 可 达 ０ ． ９ ９ ３ ，校 正 标 准 差 Ｒ ＭＳ Ｅ Ｃ与相对标准差 Ｒ Ｓ Ｄ 最 小 ，分 别 为 ５ ． ５ ７ ８ ３和 ３ ． ９ ２ ％。
关键词 ：藻红蛋 白；可见光吸收光谱；偏最 小二乘法 ；主成分 回归法
中图 分 类 号 ：０６ ５ ７ ． ３ 文 献 标 志 码 ：Ａ ｄ ｏ ｉ ：１ ０ ． ３ ９ ６ ９ ／ ｊ ． ｉ ｓ ｓ ｎ ． １ ０ ０ ３ — ５ ０ １ Ｘ． ２ ０ １ ５ ． ０ ２ ． ０ ０ ８
藻红蛋 白含 量可见光 吸收光谱 的测 量
毕 卫红 １ ， ２ ，高 明明 ，付 兴虎 １ ， ２ ，吴 国庆 ，陈俊 刚 ，于腾 飞
（１ ．燕 山大学 信 息科学与工程学院 ，河北 秦 皇岛 ０ ６ ６ ０ ０ ４ ；
２ ． 河 北 省特 种 光 纤 与 光 纤 传 感 重 点 实 验 室 ，河 北 秦 皇 岛 ０ ６ ６ ０ ０ ４ ）

２ ． Ｔ ｈ ｅ Ｋ ｅ ｙ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｆ ｏ ｒ Ｓ ｐ ｅ ｃ ｉ ａ ｌ Ｆ ｉ ｂ ｅ ｒ ａ ｎ ｄ Ｆｉ ｂ ｅ ｒ Ｓ ｅ ｎ ｓ ｏ ｒ ｏ ｆ Ｈｅ ｂ ｅ ｉ Ｐ ｒ ｏ ｖ ｉ ｎ ｃ ｅ ，
Ｑｉ ｎ ｈ ｕ ａ ｎ ｇ ｄ ａ ｏ ０ ６ ６ ０ ０ ４ ， Ｈｅ ｂ ｅ ｉ Ｐ ｒ ｏ ｖ ｉ ｎ ｃ ｅ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ）
ｐ ｒ ｏ ｐ ｏ ｓ ｅ ｄ ． Ｂ ａ ｓ ｅ ｄ ｏ ｎ ｔ ｈ ｅ ｓ ｔ ａ ｎ ｄ ａ ｒ ｄ ｓ ｏ ｌ ｕ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｐ ｈ ｙ ｃ ｏ ｅ ｒ ｙ ｔ ｈ ｒ ｉ ｎ ａ ｓ ｅ ｘ ｐ ｅ ｉ ｒ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｌ ｓ ｕ ｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｓ ， ｔ ｈ ｅ ｖ ｉ ｓ ｉ ｂ ｌ ｅ ａ ｂ ｓ ｏ ｐｔ ｒ ｉ ｏ ｎ ｓ ｐ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｍｅ ｔ ｒ ｙ

太湖蓝藻水华遥感监测方法

太湖蓝藻水华遥感监测方法

波段组合算法, 是本文研究的重点.
1.2 遥感数据及其处理方法
1.2.1 遥感数据 通过调查太湖蓝藻历史爆发时段, 分别选取部分蓝藻存在时段内的 EOS MODIS/Terra(空
间分辨率 250m、500m、1km)、CBERS-2 CCD(空间分辨率 19.5m)、Landsat ETM(空间分辨率 30m)、以
水是生命之源, 而湖泊是地球上最重要的淡水资源之一, 是湖泊流域地区经济可持续发展和人们赖 以生存的重要基础[1]. 目前, 我国内陆湖泊面临的一个主要问题是水体的富营养化[2], 其重要特征是藻类 物质, 特别是蓝藻大量繁殖. 蓝藻异常生长, 极易堆积、腐烂沉降, 形成水华, 在河口以及近岸淤积[3], 不 仅破坏水体景观和生态系统平衡, 而且由于蓝藻在生长过程中释放毒素, 消耗溶解氧, 引起水体生物大 量死亡, 湖泊水质恶化, 严重威胁了湖泊周围地区的饮水安全[4]. 如2007年5-6月, 由于太湖蓝藻爆发, 无锡重要水源地贡湖南泉水厂取水口遭受严重污染, 导致100多万人饮水困难. 因此, 快速、全面掌握蓝 藻分布信息, 对于控制蓝藻水华、评价蓝藻生态环境风险、研究蓝藻异40nm、680nm 反射率减小, 吸收峰增加; 藻华水体叶绿素 a 浓度与位于
700nm 附近的反射峰高度呈正相关关系, 也与 690-740nm 区间的荧光峰位置红移呈正相关关系[12-13]; 同
时, 近红外波段具有明显的植被特征“陡坡效应”, 反射率升高[6]. 因此, 基于这些显著光谱特征的波段或
aY
(1)
式中: RW 为水面反射率; bW、bS和bP分别为水、无机悬浮物质和藻类物质的后向散射系数; aW、aS、aP和 aY 分别为水、无机悬浮物质、藻类物质和黄色物质的吸收系数. 各物质的吸收、后向散射系数均可分别 写成比吸收系数、比后向散射系数和相应物质浓度的乘积[11].

太湖蓝藻藻蓝蛋白的提取及纯化


太 湖 蓝 藻 藻 蓝 蛋 白 的 提 取 及 纯 化
韩士群 李辉 东 ， 严 少华 夏 明珠 ， ，
（ ．江苏省农业科学 院农 业资源与环境研究所 ， １ 江苏 南京 ２０ １ １０４；２ 南京理工 大学 工业 化学研究 所 ， ． 江苏 南京 ２ ０ １ ） １０ ４
摘要 ： 为利 用太湖打捞蓝藻 的蛋 白质 资源 ， 用冻融 破壁 、 采 絮凝 、 析 、 析 、 水相萃取 等方 法制备荧光 试 盐 透 双
ＨＡＮ ｉｑ ， ＬＩＨｕ — ｏ ｇ ’ Ｓｈ ． ｕｎ ｉｄ ｎ ， ＹＡＮ ｈ ｏ ｈ ， ＸＩ Ｍｉ ｇ ｚ Ｓ ａ — ｕａ Ａ ｎ —ｈｕ
（ ．ｎｔｕ ｇｉ ｌ ｒｌ ｅ ｕｃ ｎ ｎｉ ｎ ｅｔｌ ｃ ｎｅ， ｉｎ ｓ Ａ ａ ｅ ｙｏＡ ｒ ｕｔｒｌ ｃ ｎｅ， ａｊ ｇ２ ０ １ ， ｈｎ １ Ｉｓｔｔ ｏ ｒ ｕｔ ａ Ｒ ｓ ｒ ａ ｄＥ ｖ ｏｍ ｎａ ｉ ｃｓ Ｊａ ｇｕ ｃｄｍ ｆ ｇｉ ｌ ａ ｉ ｃｓ Ｎ ｎｉ １０ ４ Ｃ ｉ ｉ ｅ ｆＡ ｃ ｕ ｏ ｅ ｒ Ｓｅ ｃ ｕ Ｓｅ ｎ ａ；２ Ｉｓ ｔｔｏ Ｉｄｓ ．ｎｔｕｅ ｎ ｕ－ ｉ ｆ ｔａ ｈｍｉｒ，Ｎ ｎｎ ｎｖｒｔ Ｓｉ ｃ Ｔｃｎｌｇ ， ａ ｎ １０４，Ｃ ｉ ｒ ｌ ｅ ｓｙ ａｊ ｇ Ｕ ｉ ｓｙｏ ｃ ｎｅ＆ ｅｈ ｏ ｙ Ｎ ｇ２ ０ １ ｉ Ｃ ｔ ｉ ｅｉ ｆ ｅ ｏ ｈｎ ａ）
ａ ｊｓ ｄｔ ０ ９ ％ ．Ａ ｅ ｏ ｃ ｌ ｉ ｙ７ ５ ｇ Ｌ ｐ ｌ ｒ ｌｍ ｎ ｍ ｃ ｌｒ ｅ ｔｅ ｐ ｙ ｏ ｙ ｎｎ ｗ ｔ ｔｅ ｐ ｒ ｙ（ ６ ／ ｄｕｔ ． ５ ｅ ｏ ｔ ｆ ｆ ｒ ｃ ｕ ｔ ｎ ｂ ． ／ ｏ ｍｅｉ ａ ｉｕ ｈｏｉ ， ｈ ｈ ｃｃ ａ ｉ ｉ ｈ ｕｉ Ａ ２ ｌ ａｏ ｙ ｃ ｕ ｄ ｈ ｔ ０

太湖蓝藻水华的遥感监测研究

太湖蓝藻水华的遥感监测研究一、内容简述太湖蓝藻水华是近年来我国太湖地区较为严重的环境问题之一，对太湖水质和生态环境造成了严重影响。

为了及时了解太湖蓝藻水华的分布、变化和严重程度，本文采用遥感技术对太湖蓝藻水华进行了监测研究。

本文首先介绍了太湖蓝藻水华的基本概念和形成原因，然后详细阐述了遥感技术在太湖蓝藻水华监测中的应用，包括卫星遥感、航空遥感和地面遥感等。

接着本文分析了太湖蓝藻水华的空间分布特征，包括大范围、高密度分布和季节性变化等特点。

本文结合实际数据，对太湖蓝藻水华的发展趋势进行了预测，并提出了相应的防治措施，以期为太湖地区的环境保护和生态修复提供科学依据。

A. 研究背景随着人类活动的不断增加，太湖地区面临着严重的水环境问题，其中蓝藻水华是最为突出的一种。

蓝藻水华是一种由蓝藻类植物引起的水体富营养化现象，其生长速度快、覆盖范围广，对水生生物和人类健康造成严重影响。

近年来太湖地区蓝藻水华的发生频率呈上升趋势，给水资源管理和环境保护带来了巨大挑战。

因此对太湖蓝藻水华的遥感监测研究具有重要的现实意义。

遥感技术作为一种非接触式的监测手段，具有实时、动态、高时空分辨率等特点，能够有效地反映地表生态环境的变化。

目前国内外学者已经开展了大量关于太湖蓝藻水华遥感监测的研究，但仍存在一定的局限性，如数据源单算法不够精确等问题。

因此开展太湖蓝藻水华遥感监测研究，对于提高太湖蓝藻水华监测的准确性和时效性具有重要意义。

B. 研究目的和意义随着人类活动的不断增加，太湖地区的水体污染问题日益严重，尤其是蓝藻水华的发生频率逐年上升，对太湖生态环境和周边居民的生活造成了严重影响。

因此开展太湖蓝藻水华的遥感监测研究具有重要的现实意义。

建立太湖蓝藻水华遥感监测模型，提高监测数据的准确性和时效性。

通过对太湖地区不同时间段的遥感影像进行分析，揭示蓝藻水华的发生规律，为政府部门制定针对性的防治策略提供依据。

探讨太湖地区蓝藻水华与气象、水文等环境因素的关系，为综合防治提供理论支持。

污染水体中蓝藻叶绿素的光谱特征分析

污染水体中蓝藻叶绿素的光谱特征分析作者：赵志敏， 洪小芹， 李鹏， 金小东， ZHAO Zhi-min， HONG Xiao-qin， LI Peng， JIN Xiao-dong作者单位：南京航空航天大学理学院,江苏,南京,210016刊名：光谱学与光谱分析英文刊名：SPECTROSCOPY AND SPECTRAL ANALYSIS年，卷(期)：2010，30(6)被引用次数：0次1.贺俊华.程永进.张昊查看详情 2007(5)2.马荣华.戴锦芳查看详情 2005(1)3.Iluz D.Yacobi Y Z.Gitelson A查看详情 2003(5)4.Michael Schagerl.Gabriela Künzl查看详情 2007(3)5.LI Zhen-guo.LU Jun.WANG Guo-xiang查看详情 2006(2)6.TANG Yao-ji.YOU Wen-wei.CHEN Ying查看详情 2004(3)7.ZHAO Zhi-min.XIN Yu-jun.WANG Le-xin查看详情 2008(1)8.ZHU Wei-hua.ZHAO Zhi-min.GUO Xin查看详情 2009(4)9.WANG Le-xin.ZHAO Zhi-min.XIN Yu-jun查看详情 2007(4)10.ZHU Wei-hua.ZHAO Zhi-min.GUO Xin查看详情 2008(1)lership J S.Parker C.Donnelly D查看详情 2005(4)12.Bebawy Loties I.Abbas Samah S.Fattah Laila A查看详情 2005(10)13.Wortmann A C.Froehlich P E.Pinto R B查看详情 2007(3)babpour Abdolmajid.Lee Choul-Gyun查看详情 2006(2)15.Stauffer Mark T.Hunter Leland J.Troncone Steven K查看详情 2007(3)16.Wu Nan.Zhu Yongqang.Browns查看详情 1009(23)17.Chawla H M.Mrig Sarika查看详情 2009(6)18.CHEN Ting.HUANG Zhi-yong.DAI Yu-lan查看详情 2008(6)19.Thongboonkerd Visith.Songtawee Napat.Kanlaya Rattiyaporn查看详情 2006(4)20.WANG Tianhu.ZHAO Zhimin.ZHANG Lin查看详情 2009(1-3)21.陈国珍紫外-可见光分光光度法 198322.LU Dong-yu.CUI Xin-tu.HUANG Jing-rong查看详情 2006(1)1.期刊论文李旭文.黎刚.缪蓓蓓.LI Xuwen.LI Gang.LIAO Pei-pei Google Earth和ArcGIS 9.2软件在太湖水污染及蓝藻监测数据展现中的应用-国土资源遥感2008,""(1)利用Google Earth和 ArcGIS 9.2软件对太湖水污染及蓝藻监测数据进行了集成和发布,为形象直观展示太湖生态环境,分析太湖水环境质量及蓝藻空间分布特征提供了很好的技术支持.2.会议论文汪松牟关于上海河道、湖泊开展水生态修复的建议──应对蓝藻暴发等水污染事件的长远措施2007 本文从今年东太湖发生蓝藻暴发的水污染事件说起,根据2006年全市河道、湖泊不容乐观的水质现状、上海面污染情况严重、太湖流域来水水质恶化的趋势和太湖流域等实际情况,强调了修复水生态系统的重要性和必要性。

DGGE指纹图谱分析太湖富营养化水体中细菌群落结构的变化

12富营养化的成因与危害随着城市化和工农业生产的发展大量富含氮磷等营养物质的城市污水工农业废水流入自然水域使水体中营养物质迅速富集导致某些藻类特别是蓝绿藻过度增殖水体透明度下降溶解氧含量降低水质恶化严重时发生水华水变腥变臭大量水生生物死亡这就是水域富营养化现象其经常发生在湖泊海湾等相对封闭水流缓慢的水体
II
上海交通大学硕士学位论文
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本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。 本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。
KEY WORDS ： bacterial community structure ， denaturing gradient gel
electrophoresis，16S rRNA，Lake Taihu，statistical analysis
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上海交通大学硕士学位论文
上海交通大学 学位论文原创性声明
关键词：
计学分析
细菌群落结构，变性梯度凝胶电泳，16S rRNA，太湖，统
V
上海交通大学硕士学位论文
CHANGES IN BACTERIAL COMMUNITY STRUCTURE OF A HYPERTROPHIC FRESHWATER LAKE TAIHU, DETERMINED BY DENATURING GRADIENT GEL ELECTROPHORESIS FINGERPRINT
本文采集太湖不同地点(梅梁湖、东太湖和南部沿岸区)、不同月份(06 年 4 至 9 月)的表层水样，提取细菌总 DNA，采用引物 357F-GC-clamp 和 518R 进行 PCR 扩增。实验结果表明，PCR 扩增产物的特异性会对 DGGE 实验产生至关重要的影响，包括选择适合的引物及其浓度、适当 的模板浓度，确定初始退火温度和总循环数。变性剂梯度被确定为 40%～ 55%。DGGE 图谱的初步分析结果表明，太湖水样中的菌种丰富度非常高， 并且不同取样时间和不同取样地点的 DGGE 带谱在条带的数量、位置及 条带的亮度上均存在较大的差异。Quantity One 软件包定量分析表明，太
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太湖藻蓝蛋白的主吸收峰出现在260nm附近，紫 外波段至蓝波段的吸光度值呈现衰减（图3），与 标准品（图1）和Bennett、abelson研究中的纯化 光谱不同。究其原因是受待测溶液中其他含苯丙 氨酸、色氨酸、酪氨酸的可溶性蛋白影响。蓝藻 细胞由众多可溶性蛋白构成，藻蓝蛋白、别藻蓝 蛋白等藻胆蛋白约占蓝藻可溶性蛋白的40％~60％ 。研究中使用的反复冻融法是水环境监测中常用 的藻蓝蛋白提取方法，能有效地破碎藻体细胞， 使藻胆体内的藻蓝蛋白溶出。但其分离、纯化能 力有限，不足以将藻蓝蛋白与其他可溶性蛋白分 离完全。
研究表明，在以反复冻融、超声波破碎、氯化钙自溶 等细胞破碎方法提取出极大螺旋藻、蓝隐藻、钝顶节旋 藻中的藻蓝蛋白时，位于类囊体膜上的叶绿素复合蛋白 也会随之脱落共存于待测液中，并对其300~450和 500~700nm谱带的吸收产生不同程度的干扰。图3（d） 中，双峰型光谱在670nm附近具有吸收峰，同时在 300~450nm出现吸收肩，谱型与上述研究类似，表明具 备双峰型光谱形态的藻蓝蛋白待测溶液中存在叶绿素复 合蛋白组分。
第二类为单峰型，620nm附近出现藻蓝蛋白的特征 吸收峰，光谱形态与标准品、铜绿微囊藻、鱼腥藻 接近。但是由于藻种差异和提取纯度的影响，吸收 峰的位置和峰值比与标准品、单一藻种不同。单峰 型光谱的主吸收峰出现在260nm附近，次吸收峰位 于330nm左右，260，330，620nm的平均峰值比约 为11:4:1。单峰型光谱300~450nm的吸收谱型与铜绿 微囊藻接近：300~350nm 出现吸收峰，300~450nm 的吸光度值递减。
藻蓝蛋白的分光光度法定量主要依据藻蓝蛋白在500~700nm 的吸收光谱特性。Bennett公式中藻蓝蛋白的特征波长为 615nm，别藻蓝蛋白为652nm；abelson公式中分别为620和 650nm。图3（a）和（b）中，无峰Ⅰ和无峰Ⅱ光谱在 500~700nm的吸收平缓，615与620nm和652与650nm的吸收 无可分性。显然，在此情况下使用上述公式对无峰型样品 进行定量具有局限性。图3（d）中，双峰型光谱620nm附近 的藻蓝蛋白吸收特征明显，但由于待测溶液中叶绿素复合 蛋白的影响，670nm附近还具有吸收峰，且该吸收峰与藻蓝 蛋白、别藻蓝蛋白的吸收峰重叠。因此，今后还需要开展 更多的对比实验工作来分析叶绿素复合蛋白对太湖藻蓝蛋 白浓度测定的影响，以进一步提高水体藻蓝蛋白浓度测定 的准确性。
根据水样的 CDOM 吸收数据(图4)，太湖藻蓝蛋白紫外波段至 蓝波段的吸收还可能受到CDOM 的影响.CDOM 是由富里酸、 腐殖酸、芳烃聚合物等一系列物质组成的水溶性物质，由藻类、 细菌、水生植物等有机体的降解产生，在紫外和蓝光区具有强吸 收。本研究采用滤膜过滤方式分离藻体，而CDOM 存在于过滤 除去的水样中。但是，反复冻融法属于机械破碎，在藻蓝蛋白提 取的同时会形成大量有机碎屑。这些有机碎屑在多次的反复冻融 提取中会慢慢腐烂分解，释放出CDOM 。图3(a)中,太湖无峰Ⅰ型 光谱在300~450nm未观测到蛋白中二硫键的吸收峰，250~800nm 的 吸 收 谱 型 与 标 准 品 不 同 而 接 近 于CDOM ,进一步说明反 复冻融法提取的藻蓝蛋白溶液中存在CDOM组分；并且对于无峰 Ⅰ而言，CDOM 的吸收可能掩盖了二硫键300~450nm的吸收信 息。
图2中，铜绿微囊藻、鱼腥藻藻蓝蛋白吸收光谱在与 标准品对应的三个谱带上有类似的吸收峰。由于藻种 差异和提取纯度的影响，单一藻种的吸收峰出现位置 和峰值比与标准品存在差异。铜绿微囊藻藻蓝蛋白的 三个吸收峰位于255，336，619nm，峰值比约为7:3:4 ；鱼腥藻则出现在259，340，614nm，峰值比约为5 ：1:3。此外，铜绿微囊藻和鱼腥藻300~450nm 的吸 收谱型不同。铜绿微囊藻300~350nm出现吸收峰， 350~450nm的吸光度值递减；鱼腥藻340nm峰两端的 吸光度值递减，但峰型不对称。
光谱特征
01
藻蓝蛋白标准品的吸收光谱特征
02Βιβλιοθήκη 单一藻种的藻蓝蛋白吸收光谱特征
03
太湖水体的藻蓝蛋白吸收光谱特征
由图１可知，藻蓝蛋白标准品250~800nm紫外-可 见光范围共有三个吸收谱带：250~300,300~450和 500~700。主吸收峰位于620nm，由藻蓝胆素中的 四吡咯环引起，为藻蓝蛋白的特有吸收特征。 250~300nm的吸收峰出现在278nm处，源于蛋白中 芳香族氨基酸苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸的吸收。 300~450nm的吸收峰位于345nm，主要由蛋白中二 硫键的吸收引起。标准品的278，345和620nm的峰 值比约为2:1:5。
由于藻蓝蛋白为胞内蛋白，提纯工艺复杂，当前 环境监测研究中藻蓝蛋白的提取多以反复冻融、超声 破碎、化学溶胀等细胞破碎方法为主，藻蓝蛋白浓度 的计算主要沿用Bennett、abelson等学者基于单一 藻种纯化光谱建立的经验公式。然而，反复冻融等提 取结果的纯化程度不高，获取的藻蓝蛋白吸收光谱常 常受到其他物质组分的影响而与经过硫酸铵盐析、柱 色谱层析分离的纯化光谱存在差异。吸收光谱是藻蓝 蛋白结构分析、浓度定量计算的基础，对内陆湖泊水 色遥感反演研究也具有重要意义。
由图2和图3可知，太湖水体藻蓝蛋白吸收光谱的次吸收 峰位于330nm左右，单一藻种则出现在620nm附近。产生 该差异的原因可能有以下两种：一是太湖水体中藻体多以 群体态形式聚集并形成包裹体，包裹体表面附有由果胶酸 、粘多糖等构成的群体胶鞘。群体胶鞘类似于藻体细胞外 壳，其存在会增加藻蓝蛋白提取的难度，使得太湖藻蓝蛋 白待测溶液的提取纯度低于单一藻种。第二种可能是受到 其他非蓝藻门藻种的影响。太湖是多藻种共存的湖泊水体 ，水体中除了蓝藻外，还会存在诸如斜生栅藻、梅尼小环 藻等的其他非蓝藻门藻种。这些非蓝藻门藻种虽不含藻蓝 蛋白，但其细胞体本身也由众多可溶性蛋白质构成；在反 复冻融提取过程中，它们也会发生降解并产生CDOM，致 使太湖藻蓝蛋白紫外波段至蓝波段的吸收增强。
根据待测溶液500~700的吸收峰个数，可将太湖水 体中藻蓝蛋白的吸收光谱划分为无峰型、单峰型 、双峰型三类（图３）。各吸收谱类型包括的样 点数量和日期见表１。
第一类是无峰型，即500~700nm间变化平缓， 620nm附近未检测到藻蓝蛋白的吸收特征。推测 其原因是该光谱形态的水样多采集于春、秋季（ 表1），水样中浮游藻类生物量小、蓝藻所占比 例低，致使待测溶液的藻蓝蛋白含量微少难以检 出。根据300~450nm的吸收差异，无峰型又可划 分为无峰Ⅰ和无峰Ⅱ两个亚类。无峰Ⅰ仅260nm 附近出现吸收峰，250~800nm的谱型更接近于水 样的CDOM吸收谱（图4）。无峰Ⅱ在260和 330nm处均具吸收峰，说明待测溶液中其他可溶 性蛋白的含量较高。
太湖水体中藻蓝蛋白的紫外-可见 吸收光谱特征分析
01
简述 实验部分 光谱特征
02
03
04
结论与讨论
简述
紫外- 可见分光光度法（UV-vis）是目前世界上 历史最悠、使用最多、覆盖面最广的分析方法之一。它 已在生命科学、材料科学、环境科学、农业科学、计量 科学、食品科学、医疗卫生、化学化工等各个领域的科 研、生产、教学等工作中得到了非常广泛的应用。它可 作定性定量分析、纯度分析、结构分析；特别在定量分 析和纯度检查方面，在许多领域更是必备的分析方法。
对于标准品的配置和测量，sigma公司生产的 藻蓝蛋白标准品0.5mg，加人25mL磷酸盐缓冲 液使其成为20mg· L-1的标准溶液贮备液，装入 棕色瓶中，于4℃保存。实验分析时将标准液取 出并配制为10mg· L-1的标准应用液。以磷酸盐 缓冲液作为空白对照测量吸光度。参照张运林 方法，通过 GF/F玻璃纤维滤膜过滤水样、测量 滤液吸光度，获取有色可溶性有机物（CDOM ）的吸收数据，对藻蓝蛋白吸收光谱特征进行 辅助分析。
第三类为双峰型，即在620nm 藻蓝蛋白特征吸收 峰的右侧约670nm处出现了另一个吸收峰，同时 在300~450nm出现吸收肩。按照吸光度的高低顺 序，双峰型光谱的主吸收峰出现在260nm附近， 次吸收峰位于330nm左右，三个吸收峰260，330 ，620nm的平均峰值比约为10:5:1。从图1来看， 双峰型光谱670nm附近的吸收谱带与藻蓝蛋白、 别藻蓝蛋白的吸收具有重叠。
方法 太湖水样和铜绿微囊藻、鱼腥藻的藻蓝蛋白提 取使用反复冻融法。首先用GF/C玻璃纤维滤膜 过滤样品，将附着藻体的滤膜放入冻存管中， 同时加入0.05mol· L-1磷酸盐缓冲液于低温冰箱 冷冻，然后室温避光解冻，如此反复冻融７次 。解冻的样品以12000r· min-1速度离心10min ，取离心后的上清液作为待测液。以磷酸盐缓 冲液作为空白对照，使用岛津 UV 2450/UV 2550分光光度计测量吸光度。
实验部分
样品采集
1
实验方法
2
样品采集 于2011年5月19日、7月30日、8月20日、9月3日 、11月12日在太湖布设采样点位开展野外调查，共采 集75个水样用于实验分析。 铜绿微囊藻、鱼腥藻藻种来源于中国科学院水生生 物研究所，在江苏省环境演变与生态建设重点实验室 的无菌实验室进行培养。取对数生长期的铜绿微囊藻 、鱼腥藻样品进行实验。 藻蓝蛋白标准品（p6161）购自美国sigma公司， 提纯于螺旋藻。
结
论
根据500~700nm的吸收峰个数，太湖水体中 藻蓝蛋白的吸收光谱形态可划分为无峰型、 单峰型、双峰型三类。 （1）无峰型光谱620nm附近无藻蓝蛋白的特 征吸收峰出现。根据300~450nm的吸收差异 ，又可分为无峰Ⅰ和无峰Ⅱ两个亚类。 （2）单峰型光谱具有明显的藻蓝蛋白吸收特 征。受藻种差异和提取纯度的影响，各吸收 峰的出现位置和峰值比与标准品、单一藻种 不同。 （3）双峰型光谱兼具藻蓝蛋白和叶绿素复合 蛋白的吸收特征。
藻蓝蛋白（phycocyanin，PC）是藻类进行光 合作用的重要辅光色素蛋白之一，由藻蓝胆素（ PCB）和脱辅基蛋白中保守性半胱氨酸残基的巯 基构成，主要存在于蓝藻、隐藻，以及部分红藻的 藻胆体中。在环境监测中，特别是蓝藻水华频发的 水域，藻蓝蛋白浓度能较好地表征蓝藻生物量，是 水体富营养化及蓝藻水华监测重点关注的指标。紫 外-可见分光光度法是藻蓝蛋白浓度定量分析的常 用方法，其主要依据是藻蓝蛋白500~700nm的吸 收光谱特性。