下载文档原格式
•现代生化药学复习提要第一章 PCR1 PCR的英文全称：Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应2 PCR是发明者：Kary Mullis 美国科学家 1985申请专利。
Perkin-Elmer Cetus公司第一台PCR扩增仪。
3 PCR的基本原理是什么？以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照办保留复制到机制沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。
A．混合模板DNA，四种核糖的三磷酸盐和DNA聚合酶，加入过量的2种DNA引物，与模板中需要的序列的起始和结束区域结合。
B．加热反应液至94℃以使模板DNA的双链变成单链（变性）C．冷却至50℃，引物与模板DNA的单链结合（退火）D．升温至72℃，DNA聚合酶催化DNA复制以产生双螺旋DNA（延伸）E．重复步骤2-4至满意为止4 PCR反应的产物中一般会生成几种长度不同的产物？反应结束时他们的含量分别是怎样的？一种是与预期长度的片度，一种是比预期长度长的多的产物。
目的产物以指数级数2n增加；另一种产物以几何级数 2n增加，在总产物中所占的比重很小，可以忽略。
5 一般PCR反应中包括几种基本成份？它们的功能分别是什么？7种：模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子、石蜡油○1模板DNA：是待扩增序列的核酸,不能混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制剂、结合DNA的蛋白。
○2特异性引物：引物是靶DNA的3’端和5’端特异性结合的寡核苷酸片段，是决定PCR特异性的关键。
引物是决定PCR扩增片断的长度、位置和结果的关键。
引物设计的必要条件：与引物互补的靶DNA序列必须是已知的。
○3热稳定DNA聚合酶：○1聚合作用（5’→3’）、○23’→5’的外切酶活力、○35’→3’的外切酶活力○4脱氧核苷三磷酸（dNTP）：原料。
噬菌体展示技术筛选脑靶向功能肽及其修饰纳米粒的脑内递药研究一、概述在生物医学领域中，脑靶向递药系统一直是研究的热点和难点。
由于血脑屏障的存在，许多药物难以有效进入大脑，从而限制了其在中枢神经系统疾病治疗中的应用。
开发新型的脑靶向递药技术，对于提高药物在脑部的浓度和疗效，降低副作用具有重要意义。
噬菌体展示技术以其独特的优势在药物研发和生物医学领域得到广泛应用。
该技术通过将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面。
利用噬菌体展示技术，我们可以筛选到与特定靶标具有高亲和力的多肽或蛋白，为药物研发和疾病治疗提供新的候选分子。
本研究旨在利用噬菌体展示技术筛选具有脑靶向功能的多肽，并将其修饰到纳米粒表面，构建新型的脑靶向递药系统。
通过优化筛选条件和方式，我们成功获得了多个具有脑靶向功能的多肽序列，并通过实验验证了其脑靶向性。
我们还将这些多肽以共价连接的方式修饰到聚乙二醇聚乳酸羟基乙酸共聚物（PEGPLGA）纳米粒表面，以提高药物的稳定性和脑部递送效率。
本研究不仅为脑靶向递药系统的开发提供了新的思路和方法，还为中枢神经系统疾病的治疗提供了新的候选药物和递送策略。
通过进一步的研究和优化，我们相信这种新型的脑靶向递药系统将在未来为更多的患者带来福音。
1. 介绍脑靶向药物递送的重要性与挑战脑靶向药物递送是神经科学领域的一个关键研究方向，对于治疗脑部疾病具有重要意义。
由于血脑屏障的存在，许多药物难以有效穿透并进入脑组织，这使得脑内疾病的治疗面临着巨大的挑战。
开发高效的脑靶向药物递送系统成为当前研究的热点和难点。
脑靶向药物递送的重要性主要体现在以下几个方面：对于脑部疾病如阿尔茨海默病、帕金森病、脑肿瘤等，有效的药物递送能够显著提高治疗效果，改善患者的生存质量。
脑靶向递送系统能够实现药物的精准定位，减少对其他组织器官的副作用。
噬菌体展示技术第一篇：噬菌体展示技术介绍噬菌体作为一种针对细菌的病毒，与我们生活息息相关。
除了作为抗生素的发现者，噬菌体还可以被利用于噬菌体展示技术。
这种技术利用噬菌体表面展示的蛋白质，实现对目标蛋白质的快速筛选和鉴定。
本文将介绍噬菌体展示技术的原理、优缺点，以及在生命科学研究和工业生产中的应用。
一、原理噬菌体展示技术是将目的蛋白或肽插入噬菌体表面的一种方法。
噬菌体表面组分主要有三种：1）编码质粒的pIII蛋白质；2）编码细胞毒素E的pVIII蛋白质；3）编码专一结合的pV蛋白质。
它们在噬菌体的组成和结构上有不同的作用。
其中，pIII和pVIII蛋白质被广泛地应用于蛋白质展示，pV 蛋白质则被用于病毒特异性分离。
噬菌体展示技术的基本步骤为：首先，在噬菌体pIII或pVIII蛋白质基因的外侧区域中插入目的蛋白的DNA序列；然后使用这些噬菌体感染大肠杆菌。
噬菌体在感染过程中就会将目的蛋白展示在其表面。
最后，可使用具有亲和力的配体或抗体选择目的蛋白并纯化。
二、优缺点噬菌体展示技术的优点主要集中在以下几个方面：1）大容量：噬菌体可以在感染过程中表达众多的外表面蛋白，其中每个蛋白均可成为一个展示物，针对多种噬菌体展示技术。
2）直接鉴定：在已知多肽的情况下，可以使用特定的抗体直接鉴定噬菌体表面的展示蛋白。
3）高灵敏度：噬菌体展示技术对目标蛋白的识别灵敏，并且可以使用大量病毒颗粒进行检测。
4）高效率：噬菌体展示技术可将展示蛋白直接表达在噬菌体的表面，无需进行分离提纯，从而加快了蛋白纯化过程。
噬菌体展示技术的缺点主要有以下几方面：1）分子大小限制：目前仅适用于直径小于1/3噬菌体直径的蛋白分子。
2）生物安全：组装成噬菌体后，展示蛋白无法及时得到更新，可能会导致噬菌体的生物安全风险。
3）抗原性：由于目的蛋白常常被表达在噬菌体的表面，因此它们可能会被视为异物而引起免疫反应。
三、应用由于噬菌体表面蛋白质的展示，噬菌体展示技术已经被广泛应用于生物医学研究和工业生产中。
噬菌体展示技术的原理及应用将编码多肽的外源DNA片段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合（插入信号肽与衣壳蛋白基因间）后，以融合蛋白的形式呈现在噬菌体的表面，每个噬菌体只含1个外源基因，被展示的多肽或蛋白可保持相对的空间结构和生物活性，展示在噬菌体的表面。
导入了各种各样外源基因的一群噬菌体，就构成一个展示各种各样外源肽的噬菌体展示库。
当用一个蛋白质去筛查一个噬菌体展示库（展示文库为流动相，被筛蛋白为固定相）时，就会选择性地同与其有相互作用的某个外源肽相结合，从而分离出展示库里的某个特定的噬菌体，研究该噬菌体所含外源基因的生物学功能。
技术发展噬菌体展示优越性1、将蛋白与其遗传信息之间提供了直接的物理联系，可有效的对所需功能的克隆进行反复筛选并扩增。
2、被展示多肽或蛋白结构功能与天然状态接近，可简便快速筛选得到与靶分子高亲和力的被展示物。
3、筛选过程中，特定的噬菌体克隆由于对其配体的特意亲和性而不断的得到富集，从而使相对稀少的可以结合配体的克隆能够快速、有效地从一个大文库中被筛选出来。
4、与其它技术相比，容易对库容量较大的文库进行筛选。
噬菌体展示局限性：1、肽库容量受大肠杆菌转化效率影响，容量一般在109，高于此限制的较多基因将难以表达；2、编码多肽的基因带有一定的密码子偏爱性，限制了肽库的复杂度；3、噬菌体宿主大肠杆菌的生物合成系统有自身的限制因素，如缺乏氨基酸修饰、蛋白糖基化、不能合成D型氨基酸。
4、在噬菌体展示过程中必须经过细菌转化、噬菌体包装，有的展示系统还要经过跨膜分泌过程，这就限制了所建库的分子多样性。
5、不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需外加选择压力。
应用范围肿瘤研究及药物靶向治疗诊断用疫苗研发酶抑制剂筛选构建抗体/cDNA文库研究蛋白质与核酸相互作用的生物学过程研究新型的基因导向系统Eg1：从HBx（肝癌相关抗原）单抗细胞中克隆重链可变区基因，重组入M13噬菌体，验证表达产物具有活性，然后表达出单链抗体、单域抗体或嵌合抗体，为肝癌导向治疗研究提供基础。
噬菌体展示
简介
噬菌体是一种能够感染细菌并在其中繁殖的病毒。
它被广泛用于生物学研究和生物技术应用中，特别是在基因工程和基因治疗领域。
噬菌体展示技术是一种将特定蛋白质或肽段展示在噬菌体表面的方法。
通过选择与目标蛋白质相互作用的噬菌体克隆，可以筛选出具有特定功能的蛋白质或肽段。
本文将介绍噬菌体展示技术的原理、应用和优点。
原理
噬菌体展示技术依赖于噬菌体基因组中的一个外源基因，该基因编码目标蛋白质或肽段。
这个外源基因通常被插入到噬菌体的毒力因子基因中，例如毒力因子III基因。
插入后，目标蛋白质或肽段会与细菌细胞的表面结合。
噬菌体携带的基因信息会导致细菌细胞表面展示目标蛋白质或肽段。
通过这种方式，科研人员可以通过筛选和选择的方法找到与目标蛋白质或肽段相互作用的噬菌体克隆。
应用
噬菌体展示技术在生物学研究和生物技术应用中有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：
抗体库筛选
噬菌体展示技术可用于抗体库筛选，以寻找与特定抗原相互作用的抗体。
通过将抗原展示在噬菌体表面，科研人员可以筛选出具有高亲和力和特异性的抗体，用于治疗和诊断应用。
肽库筛选
噬菌体展示技术也可用于肽库筛选，以寻找具有特定功能的肽段。
通过将肽段展示在噬菌体表面，科研人员可以筛选出与特定靶点相互作用的肽段，用于药物开发和治疗应用。
蛋白质互作网络研究
噬菌体展示技术可以用于研究蛋白质互作网络。
通过将一种蛋白质展示在噬菌体表面，并将其用作识别其他与其相互作用的蛋白质的。
噬菌体（bacteriophage）是一种寄生于细菌的病毒，它可以感染并破坏细菌。
噬菌体展示技术是一种利用噬菌体来展示外源蛋白或肽的方法，使研究人员能够研究和利用噬菌体的寄生性质，以及利用其表面展示的能力。
噬菌体展示技术的概念包括以下几个方面：
1. 噬菌体结构：噬菌体的结构由头部、尾部和尾纤毛组成。
头部包含基因组，尾部用于附着并注入基因组到宿主细菌中。
噬菌体展示技术通过利用这些结构，使其能够在噬菌体表面展示外源蛋白或肽。
2. 插入式展示：这是一种常见的噬菌体展示技术，其中外源蛋白或肽的基因序列被插入到噬菌体的基因组中，通常是在噬菌体的尾部或头部。
这样，当噬菌体感染宿主细菌时，它会在其表面展示外源蛋白或肽。
3. 表面展示：通过噬菌体的表面展示外源蛋白或肽，研究人员可以利用这些病毒来模拟和研究宿主细菌的亲和性、结合性等特性。
这对于蛋白质工程、药物筛选、疫苗研发等方面具有潜在的应用。
4. 生物材料筛选：利用噬菌体展示技术，研究人员可以将噬菌体库用于生物材料的高通量筛选。
这可以加速对特定蛋白质、肽段或化合物的研究。
5. 疫苗研发：噬菌体展示技术还可应用于疫苗研发。
通过在噬菌体表面展示特定的抗原蛋白，可以激发免疫系统产生特异性抗体，从而产生免疫应答。
总的来说，噬菌体展示技术提供了一种独特的方法，可以利用噬菌体的自然寄生性质，将外源蛋白或肽有效地展示在噬菌体表面，从而用于各种生物学研究和应用领域。
噬菌体展示技术名词解释
《噬菌体展示技术》名词解释
《噬菌体展示技术》是一种用于筛选特定目标物的方法，通过利用噬菌体（一种能感染细菌的病毒）展示目标物的方式，实现了高效、快速、可靠的分析和筛选过程。
噬菌体是一种寄生于细菌体内的病毒，它能感染特定的细菌，并在其细胞内进行复制。
噬菌体表面有许多特定的蛋白质，可以与靶物质相互结合。
利用这种特性，科学家们发展了噬菌体展示技术，旨在将所需的特定目标物展示于噬菌体表面，使其能高效结合和筛选出理想的目标物。
在噬菌体展示技术中，首先需要构建一个基因工程噬菌体文库，该文库包含了大量的噬菌体克隆，每个克隆都带有一个外源或随机片段的DNA序列。
这里的DNA序列会与其相应的蛋白
质编码序列连接，从而在噬菌体表面展示目标蛋白。
然后，科学家们通过筛选和鉴定，找到能够与目标物相互结合的噬菌体克隆。
噬菌体展示技术具有许多优势。
首先，由于大量的噬菌体克隆可同时进行筛选，因此可实现高通量的目标物鉴定和筛选。
其次，由于利用噬菌体表面的蛋白质进行展示，所筛选出的目标物会拥有良好的结构和功能，较易于后续研究和开发应用。
此外，噬菌体展示技术还可以应用于抗体库的构建和筛选，可作为研究和开发新药的有力工具。
噬菌体展示技术已成功应用于许多领域，如药物筛选、蛋白质互作研究、抗体工程等。
它为科学家们提供了一个强大的工具，用于快速鉴定和筛选特定目标物，为相关研究和应用提供了有力支持。
总而言之，《噬菌体展示技术》是一种利用噬菌体表面蛋白质展示目标物的筛选方法。
它具有高通量、高效率、高精度等特点，已成为现代生物技术领域中不可或缺的重要工具。
噬菌体展示技术噬菌体展示技术是一种用来展示噬菌体和揭示其结构与功能的方法。
它可以帮助科学家们更好地了解噬菌体的特性，并为相关研究提供技术支持。
本文将详细介绍噬菌体展示技术的原理、应用以及未来的发展趋势。
噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，具有特异性感染宿主细菌的能力。
噬菌体展示技术利用噬菌体的这一特性，将外源蛋白质或多肽片段连接到其表面结构上，从而使噬菌体表面显示出被展示物。
这样，科研人员可以通过研究噬菌体表面展示的蛋白质或多肽片段的结构与功能，来了解其它生物分子如何与宿主细菌进行相互作用。
噬菌体展示技术的原理主要包括三个步骤：插入、表达和展示。
首先，需要将目标蛋白质或多肽片段的编码序列导入噬菌体基因组中，形成噬菌体展示质粒。
接下来，通过转染等方式将该质粒导入宿主细菌中，并在合适的培养条件下进行表达。
最后，噬菌体表面展示质粒编码的蛋白质或多肽片段，并形成可供研究的噬菌体展示复合体。
噬菌体展示技术具有广泛的应用领域。
一方面，它可以用于抗原表位鉴定，帮助寻找新的病原体相关抗原。
另一方面，噬菌体展示技术可用于蛋白质工程和抗体库筛选等研究中。
此外，噬菌体展示技术还可以用于药物开发，如靶向肿瘤治疗等方面。
它能够为科学家们提供有力的工具和方法，从而更好地进行相关研究。
尽管噬菌体展示技术在许多领域都表现出巨大的应用潜力，但它仍然面临一些挑战和限制。
首先，噬菌体展示的蛋白质或多肽片段需要能够与宿主细菌成功表达并显示在噬菌体表面，这对于一些大型复杂蛋白质来说可能存在困难。
其次，噬菌体展示的蛋白质或多肽片段需要具有良好的稳定性和可溶性，以保证其展示效果和研究可行性。
此外，噬菌体展示技术在开发过程中需要耗费大量的时间和资源，对于科研人员来说也是一项具有挑战性的工作。
未来，随着科学技术的不断发展和进步，噬菌体展示技术有望得到进一步改进和优化。
研究人员可以利用基因编辑技术、合成生物学和高通量筛选等方法，提高噬菌体展示的效率和可行性。
应用噬菌体表面展示技术筛选肝细胞p53启动子结合蛋白吴顺华1,2，郑玉建1，钟彦伟3，成军2，张跃新11新疆医科大学公共卫生学院劳动卫生学与环境卫生学教研室，乌鲁木齐 (830054)2北京地坛医院传染病研究所，北京 (100011)3解放军302医院传染病研究所病毒性肝炎研究室，北京 (10039)E-mail：wushunhua@摘要：目的筛选p53启动子结合蛋白，探讨P53对肝细胞调节的分子生物学机制。
方法应用噬菌体表面展示技术，以p53作为固相筛选分子，对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”过程，经噬斑的PCR扩增后，构建克隆载体，最后对所筛选克隆进行DNA测序和生物信息学分析。
结果噬菌体经5轮富集后，成功构建了噬菌体p53展示文库，该文库包含与P53结合的肝细胞蛋白有17种。
其中2个克隆编码未知功能蛋白；其余的克隆分别编码人α2HS糖蛋白(AHSG)、人D4,锌指蛋白家族2(DPF2)、凋亡反应锌指基因(REQ)、Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制因子结合蛋白、氨基甲酰磷酸合成酶1、磷酸化酶激酶、酪氨酸氨基转移酶、酪蛋白激酶细胞周期素激酶、谷胱甘肽过氧化物酶、组蛋白结合蛋白3、跨膜蛋白2、血清粘蛋白2、有核红细胞白血病病毒癌基因2、毛细管扩张失调症突变基因等蛋白，涉及到细胞发育和代谢、细胞外基质、细胞周期调控、信号转导、细胞凋亡以及原癌基因等方面。
结论 p53启动子DNA在肝细胞具有结合多种类型和功能蛋白的作用。
关键词：噬菌体表面展示技术；p53；肝细胞慢性砷中毒是全世界各国政府和研究工作者高度重视的重大公共卫生问题。
主要是饮用高砷水和燃高砷煤所诱发的慢性砷中毒，目前估计全世界受高砷威胁的人群超过4700万，慢性砷中毒患者可达数十万人。
仅在我国目前病区人口就达300万，而且慢性砷中毒病区有进一步扩大的趋势。
流行病学研究已证明慢性砷中毒可致皮肤损伤，手脚掌部皮肤角化以及其他脏器损伤，特别可引起皮肤癌和肝癌、肺癌、膀胱癌等内脏肿瘤的高发，但砷作为确定的人类致癌物，至今在动物身上未能获得致癌模型，使慢性砷中毒的分子作用机制一直未明确[1]。
p53肿瘤抗原是正常细胞所必需，在细胞恶性转化中起重要的作用。
慢性砷中毒与p53的表达异常紧密相关[2]。
噬菌体表面展示技术是近年来出现的一种新技术，其原理是将cDNA表达文库基因通过与噬菌体外壳蛋白基因融合而将外源蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，将之与固相化的目的分子结合，经过多轮的结合-淘洗过程，筛选出与目的分子（DNA或蛋白）结合的外源多肽或蛋白质，这种技术不仅可以应用到抗体基因的筛选、模拟表位的筛选、抗独特型单链可变区抗体的筛选等，而且可以应用于蛋白结合蛋白的筛选和DNA/RNA结合蛋白的筛选[3-5]。
在本研究中，我们应用噬菌体表面展示技术，从肝细胞T7噬菌体cDNA文库中筛选了与p53启动子结合的蛋白，试图寻找肝细胞内与p53具有相互作用的蛋白，探讨p53与肝细胞蛋白相互作用的分子生物学机制。
1. 材料和方法1.1 材料T7select 人肝细胞cDNA文库，受体菌BLT5615（Novagen公司），质粒pGEM-Teasy （Promega公司），Taq酶、琼脂糖、dNTP、T4连接酶、RNA酶、玻璃奶DNA回收试剂盒1本课题得到国家自然科学基金项目（30560137）教育部博士点基金（20040760002）的资助。
（博大科技），大肠杆菌DH5α为本实验室保存。
1.2方法1.2.1 p53启动子的扩增根据Tuck,S.P. 和Crawford, L[6]公布的p53基因启动子区选择PCR扩增的目的片段，自行设计并由上海生工公合成引物，在上下游引物的5’-端分别加上Kpn I和Xho I.上游引物：5’- AGTGATAAGGGTTGTGAAGGAG -3’，下游引物：5’-GACTCATCAAGTTCAGTCAGG -3’. 以HepG2细胞基因组为模板，进行PCR(PE9600 PCR 仪)，扩增条件：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，62℃退火1 min，72℃延伸1 min，循环35次后，72℃保温10 min. PCR产物经0.9%琼脂糖凝胶电泳，切胶，玻璃奶法回收DNA片段。
1.2.2 T7噬菌体文库扩增将BLT 5615新鲜克隆在3ml LB/Amp内振摇，37℃过夜；在3ml LB/Amp内加入30µl 振摇细菌，将细菌浓度摇至OD600值0.5，加入30µl 0.1MIPTG，再振摇30分钟后加入噬菌体文库5µl；37℃振摇1h左右直到观察到细菌裂解；8000r离心10min，将上清移至另一无菌管中，4℃保存。
1.2.3 生物淘洗链亲和素15µl（1 mg/ml）包被微孔板，4℃过夜。
生物素化的p53启动子80µg/µl和 0.05M NaHCO3包被液包被微孔板，4℃过夜。
1×TBS洗涤，加入2%BSA 1ml，4℃过夜。
1×TBST （0.5% Tween-20）洗涤3遍，加入文库扩增裂解液，100µl，4℃过夜。
1×TBST洗板5次，加入100µl T7洗脱缓冲液，室温孵育15min，将洗脱液移至另一无菌管中。
将10µl噬菌体洗脱液加入3ml对数生长期的5615细菌培养液，37℃振摇培养，直到看到细菌裂解。
8000r 离心10min，将上清移到一新管，4℃保存备下一轮筛选用。
每轮筛选后，均做噬斑分析。
按上述步骤共筛选5轮。
1.2.4 噬斑的PCR扩增用Tip头刮取第5轮筛选后的阳性噬斑共40个，分别加入3ml对数生长期的5615细菌培养液，37℃振摇培养，直到看到细菌裂解。
收集裂解上清。
在0.5ml管中依次加入17µl 双蒸水，2.5µl的10×缓冲液（含20mmol/L MgCL2），2µl 2mmol/L dNTP， 0.5µl 12.5µmmol/L T7select上游引物：5’ GGA GCT GTC GTA TTC CAG TC 3’和下游引物：5’ AAC CCC TCA AGA CCC GTT TA 3’，1.5µl 裂解上清作为模板，0.2µlTaq酶（5u/µl）。
放入PE9600 PCR仪中扩增。
扩增条件：94℃变性1min、50℃退火1min、72℃延伸1min，循环35次后，72℃保温10min。
0.9%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果。
玻璃奶法回收。
1.2.5 克隆载体的构建和鉴定将纯化的噬斑PCR产物与pGEM-Teasy载体混合，在16℃条件下用T4 DNA连接酶连接过夜，随后转化入氯化钙法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞，在铺有IPTG/X-gal的氨苄西林平板上进行蓝白斑菌落筛选，挑取白色菌落用碱裂解法提取质粒，进行EcoRI酶切鉴定和T7、SP6 PCR验证。
1.2.6 序列测定及同源性搜索以酶切和T7、SP6 PCR验证鉴定阳性的重组子为模板，进行目的基因的DNA序列测定，图 1 部分阳性噬斑PCR 结果 Figure1 The result of PCR positive plaques DL2000: DNA 相对分子量标准，14-21: 噬斑PCR 扩增的DNA 片段 DL2000:2000 DNA ladder ， 14-21: Positive phaques PCR 2000bp→1000bp→ 500bp→ 100bp→ 序列测定由上海博亚生物公司完成。
同源性搜索由以下网址上的BLASTn 软件完成（http ：///blastn ）。
2 结果2.1 肝细胞cDNA 文库的筛选以固相化的p53启动子DNA 片段作为支持分子，对肝细胞cDNA 文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选。
噬菌体的富集结果见(表1)。
随着淘洗次数的增加，从固相平板洗脱的噬菌体数显示了明显的增加趋势，在第5轮筛选后结合到包被有p53启动子DNA 片段平板的噬菌体与第1轮相比，富集了941倍（富集倍数=第4轮产出率/第1轮产出率）。
表 1 链亲和素筛选对噬菌体的富集Table 1 Enrichment of specific phage particles噬菌体数筛选次数投入捕获 产出率 第1轮 8.8×109 1.5×1014 1.7×104第2轮 1.5×1016 1.4×1019 9.3×102第3轮 1.4×1019 1.2×1023 8.6×103第4轮1.2×1023 8.0×1028 6.7×105 第5轮8.0×1028 1.3×1036 1.6×107 注：产出率=洗脱的噬菌体数量/所用的噬菌体数量2.2 目的基因的PCR 扩增经过5轮筛选，随机挑取45个噬斑为模板，用T7 select 引物进行PCR 扩增，PCR 产物用0.9%琼脂糖凝胶电泳。
结果产生片段大小不等的条带（图1），用同一噬斑裂解液重复PCR 得到相同结果。
2.3 目的基因克隆的酶切鉴定将随机获得40个阳性噬斑PCR 产物连接pGEM-Teasy 载体上，转化感受态细胞，0.9%琼脂糖凝胶电泳显示切出3.0 kb片段和大小不一目的片段条带，说明重组子分别带有不同的目的片段DNA。
2.4 序列比对和同源性分析对阳性克隆基因的DNA序列测定，及根据GenBank数据库提供的数据库进行BLASTn 同源性搜索，28个阳性克隆筛选到启动子DNA结合蛋白，共编码17种蛋白。
其中2个克隆编码未知功能蛋白；其余的克隆分别编码人α2HS糖蛋白(AHSG)、人D4,锌指蛋白家族2(DPF2)、凋亡反应锌指基因(REQ)、Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制因子结合蛋白、氨基甲酰磷酸合成酶1、磷酸化酶激酶、酪氨酸氨基转移酶、酪蛋白激酶细胞周期素激酶、谷胱甘肽过氧化物酶、组蛋白结合蛋白3、跨膜蛋白2、血清粘蛋白2、有核红细胞白血病病毒癌基因2、毛细管扩张失调症突变基因、等蛋白，结果见(表2) 。
表2 应用噬菌体展示技术筛选到的阳性克隆Table 2 Positive clones acquired from biopanning编号编码蛋白同源性克隆数1 Homo sapiens alpha-2-HS-glycoprotein (AHSG) (人α2HS糖蛋白)) 100% 2100% 62 Homo sapiens D4, zinc and double PHD fingers family 2 (DPF2) (人D4,锌指蛋白家族2)3 Homo sapiens phosphorylase kinase ( 磷酸化酶激酶) 100% 14 Homo sapiens PAI-1 mRNA-binding protein (Ⅰ型纤溶酶原激活物抑制因子100% 4 结合蛋白)5 Homo sapiens CPS1 (氨基甲酰磷酸合成酶1) 100% 16 Human 28S ribosomal(28S核糖体蛋白) 100% 27 H.sapiens mRNA for tyrosine aminotransferase（酪氨酸氨基转移酶）97% 18 Homo sapiens transmembrane protein 2 (TMEM2)( 跨膜蛋白2) 97% 19 Homo sapiens requiem, apoptosis response zinc finger gene (REQ) gene(凋亡100% 2 反应锌指基因)10 Homo sapiens HIRA interacting protein3(HIRIP3)（组蛋白结合蛋白3) 97% 1100% 1 11 Homo sapiens nuclear ubiquitous casein kinase and cyclin-dependent kinase(酪蛋白激酶细胞周期素激酶)12 Homo sapiens hypothetical protein LOC127262 100% 113 Homo sapiens cDNA FLJ25500 fis 100% 1100% 1 14 Homo sapiens v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog 2,neuro/glioblastoma derived oncogene homolog (avian)(ERBB2)（有核红细胞白血病病毒癌基因2）15 Homo sapiens glutathione peroxidase 7 (GPX7) 谷胱甘肽过氧化物酶100% 1100% 1 16 Homo sapiens ataxia telangiectasia mutated (includes complementatio groupsA, C and D) (ATM) gene（毛细管扩张失调症突变基因）17 Homo sapiens orosomucoid 2 (ORM2) 血清粘蛋白2 100% 13 讨论流行病学研究已证明慢性砷中毒可致皮肤损伤，手脚掌部皮肤角化以及其他脏器损伤，特别可引起皮肤癌和肝癌、肺癌、膀胱癌等内脏肿瘤的高发，但砷作为确定的人类致癌物，至今在动物身上未能获得致癌模型， Kitchin KT[7]综述无机砷致癌的9个动物模型结论显示无机砷作为致癌物可诱导染色体畸变、氧化应激，阻止DNA修复，诱导DNA甲基化，促进生长因子表达进而促进细胞增殖，启动基因扩增，抑制p53的表达。
