HPLC法测定不同产地桑椹药材中柠檬酸成分的含量
桑椹，又名桑椹子、桑果、桑子、是桑科桑属mulberry（Morus alba L.）植物的果实。
本属植物全球约有16种，分布于北温带、亚洲热带和非洲热带及美洲地区。
我国约有11种，分布于全国大部分地区，以江苏、浙江等南方养蚕地区产量较大[1]。
1993年国家卫生部把桑椹列为“既是食品又是药品”的农产品之一[2]。
桑椹中含有丰富的糖类、有机酸、脂类、维生素、色素、非色素酚和矿物质等成分[3]。
目前，在桑椹营养成分的研究的基础上，国内外对桑椹中功效成分的研究较多，主要集中在桑椹色素、非色素酚、及多糖等成分上。
柠檬酸是其中含量较高的有机酸[4]，同时其具广泛的药理作用：①柠檬能防止心血管动脉硬化并减少血液粘稠度；②中国中医认为，柠檬性温、味苦、无毒，具有止渴生津、祛暑安胎、疏滞、健胃、止痛等功能利尿，调剂血管通透性；③柠檬酸热量低，且具有很强的收缩性，因此有利于减少脂肪，是减肥良药；④具有防止和消除皮肤色素沉着的作用；⑤?痰作用等[5-7]。
因此，本文建立一种准确定量桑椹药材中的柠檬酸含量的方法。
1 仪器与试药
1.1仪器岛津高效液相色谱仪（Prominence UFLC），日本岛津公司；1/10万电子分析天平，型号ME235S，德国塞多利斯公司；电热套（1000 ml），上海科析实验仪器厂；KQ-300DE数控超声波发生器，昆山超声仪器有限公司。
1.2试药磷酸，AR级，天津市富宇精细化工有限公司；水，自制；
柠檬酸（批号111679-200401）对照品，购自中国食品药品检定研究院；桑椹药材：安徽产地（批号20150412、20150415），新疆药材（批号20150418、20150419、20150421），较广产地批号（20150422），河南产地（批号20150508），江苏产地（批号20150428），四川产地（批号20150502），陕西产地（批号20150427）由陕西君碧莎制药有限公司提供。
2 实验方法
2.1色谱条件色谱柱为Kromasil C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.6% 磷酸水溶液；检测波长：209 nm；流速：0.5 ml/min；柱温：30℃；进样量10 μl。
2.2对照品溶液的配制精密称取柠檬酸对照品17.2 mg，置10 ml容量瓶，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，超声并摇匀，滤过，取续虑液，作为母液，备用。
2.3供试品溶液的制备取样品粉末（过4号筛）2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入蒸馏水100 ml，称定重量，加热回流提取1 h，放冷，再精密称定重量，用水补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4标准曲线及线性范围量取母液0.30，0.50，1.00，2.00， 4.00 ml，分别置于5 ml量瓶中，加蒸馏水溶解并定容至刻度，滤过，分别得到浓度为0.10320、0.17200、0.34400、0.68800、1.37600 mg/ml的对照品溶液，按上述条件测定峰面积，以对照品峰面积值（y）为纵坐标，柠檬酸浓度（x）为横坐标进行线性回归。
结果：柠檬酸的质量浓度范围（mg/ml）、线性方程及相关系数（r）分别为：线性范围为0.10320～1.72000
mg/ml，回归方程为y=1278680x+1614，r=0.9999。
结果表明对照品在相应浓度范围内线性关系良好。
2.5精密度实验精密量取线性样品溶液（浓度为1.72 mg/ml）1.07 ml 于5 ml量瓶中加蒸馏水至定容至刻度，得浓度为0.36808 mg/ml，按上述色谱条件重复进样6次，测得柠檬酸峰面积值的RSD分别为1.01%。
结果表明该方法精密度良好。
2.6稳定性实验取精密度试验样品溶液（浓度为0.36808 mg/ml），每间隔一定时间进样一次，测定柠檬酸对照品峰面积的RSD值分别为
2.28%。
结果表明柠檬酸对照品峰面积值在8 h内稳定。
2.7加样回收实验采用加样回收法，取已测知含量的样品（江苏产，批号20150428，含量为5.140%），精密称取柠檬酸对照品50.00 mg加入其中。
按供试品溶液制备法操作，并按上述色谱条件进行测定，计算回收率。
柠檬酸平均加样回收率为98.29%，结果表明本方法具有良好的回收率。
2.8重复性实验精密称取样品（江苏产，批号20150428，含量5.140%）2.0000 g，按照供试品方法制备6份样品，按上述色谱条件进样测定，结果柠檬酸含量的RSD值分别为0.63%。
结果表明本方法稳定。
2.9不同产地桑椹药材中柠檬酸含量的测定分别精密量取供试品溶
液10 μl，按前述色谱条件进样，测定峰面积，在此检测条件下，柠檬酸能够很好地分离。
3 实验结果
3.1色谱图柠檬酸对照品色谱图与供试品色谱图，见图1、图2。
3.2 桑椹中柠檬酸的测定结果，见表1。
4 讨论
4.1流动相的选择实验中考察了1.0%醋酸与0.6%磷酸2种系统梯度洗脱及其不同流动相比例，比较的磷酸浓度有0.1%，0.3%，0.6%，1.0%水溶液。
结果表明，各种流动相中0.6%磷酸水溶液系统为最佳，其图谱上各个色谱峰的分离度较好，保留时间适中，因此选此流动相系统作为桑椹药材中柠檬酸含量指标检测的流动相。
4.2制样方法比较了用水作为溶剂超声提取与用水作为溶剂加热回流提取。
结果表明，用水作为溶剂加热回流提取得到的峰面积较大、峰个数较多、分离度较好，所以选择用加热回流的方式提取。
4.3其他比较了不同柱温与流速，柱温超过30℃分析时间缩短，但大多数色谱峰分离度小或不能分开；流速0.5 ml/min大多数色谱峰分离度差。
因此选择便于控制的柱温30℃与流速 0.5 ml/min作为色谱条件。
综上所述，通过测定不同产地桑椹药材中柠檬酸成分含量的研究，表明该方法稳定可靠，单用液相色谱仪即可，避开了液相色谱与质谱连用的限制，使检测简单化。
由于桑椹药材中的柠檬酸含量较高，且作用广泛，可用于桑椹药材的质量控制。
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不如积阴德于冥冥之中，此乃万世传家之宝训也。
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