实验14 亲和层析纯化胰酶一、原理在制备胰蛋白酶过程中，往往混杂着与胰蛋白酶相近似的蛋白水解酶，如胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。
由于三者在物理化学性质和结构上均十分接近，利用一般常用的提取分离方法，很难将它们之间彼此彻底分开。
为了获得高纯度的胰蛋白酶制品，采用亲和层析技术进一步纯化后、可达到十分满意的效果。
生物大分子化合物的重要特征之一是具有与某些相对应的分子通过次级键或共价键专一结合的能力即亲和力。
例如酶与抑制剂之间，抗原与抗体之间，结合的双方不仅是专一的，而且结合以后可以在不丧失生物活性的基础上用物理或化学的方法进行解离。
根据这一特性，如果把具有亲和力的一对分子的某一方连接于水不溶的固相载体上作为固定相，那么另一方随着流动相流经该固定相时，双方便亲和结合为一个整体。
然后只有改变某种物理条件或化学条件使结合的双方解离，即能得到与固定相有特异亲和力的某一特定物质。
这种利用生物分子和相对应分子之间亲和结合和解离性质而建立起来的层析方法称之为亲和层析。
亲和层析作为一种新型的分离纯化技术，可以用来纯化各种酶、抗体、抗原、维生素结合、传递蛋白、激素和药物的受体、核酸以及其他生物大分子化合物。
与一般的提纯生物大分子化合物的方法相比，亲和层析具有简单、快速、得率和纯化倍数高等显著特点，尤其适合实验室规模的微量生物大分子化合物的分离纯化。
但是，亲和层析也有其局限性。
由于某一种生物大分子化合物只与特定的配基之间具有亲和力，因此针对每一个分离对象不仅需要寻找和制备专一的固相配基，而且还需要选择特定的层析条件。
几乎没有统一的方法可供任意配套。
用于生物活性分子固相化的材料首先要求能够功能化，即具有能活化或修饰的功能基团，以使配基与之结合，除此之外，固相化材料必须具有稳定的物理化学性质，优良的流通性，非专一性吸附小等特性。
常用的固相载体有纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和交联琼脂糖等。
为了将配基偶联与固相载体上，需要使固相载体活化，即使载体具有与配基进行反应，生成共价偶联物的性质，其方法根据固相载体的性质而定。
实训亲和色谱纯化胰蛋白酶［任务描述］亲和色谱主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。
鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂，对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用，在pH7.0～8.0的缓冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合，而在pH2.0～3.0时，又能被解离下来。
因此，采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从胰脏粗提液中通过一次亲和色谱直接获得活力大于10000BAEE单位/毫克蛋白胰蛋白酶制品，比用经典分离纯化方法简便得多，纯化效率可达到10～20倍以上。
本次实训任务为纯化胰蛋白酶，采用胰蛋白酶的天然抑制剂-鸡卵粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂，从胰脏粗提取液中纯化胰蛋白酶。
［任务实施］一、准备工作1.建立工作小组，制定工作计划，确定具体任务，任务分工到个人，并记录到工作表。
2.收集亲和色谱纯化胰蛋白酶工作中必须信息，掌握相关知识及操作要点，与指导教师共同确定出一种最佳的工作方案。
3.完成任务单中实际操作前的各项准备工作。
（1）材料准备鸡蛋清，新鲜猪胰脏。
（2）试剂与仪器试剂：丙酮、三氯乙酸、HCl、NaOH、NaCl、NaHCO3、Na2CO3、氯代环氧丙烷、乙腈、甲酸、Tris、CaCl2、KCl、DEAE-纤维素、Sepharose-4B、乙酸二氧六环二甲基亚砜。
主要贮存溶液：①鸡卵粘蛋白色谱液（1L）。
0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液。
②DEAE-纤维素处理液。
0.5mol/L HCl 300mL和0.5mol/L NaOH、0.5mol/L NaCl 各300mL。
③卵粘蛋白洗脱液。
0.02mol/L pH7.3 Tris-HCl缓冲液含0.3mol/L NaCl，150mL。
④标准胰蛋白酶溶液。
结晶胰蛋白酶以0.001mol/L HCl 配制成1mg/mL 。
⑤亲和色谱柱平衡液。
含0.5mol/LKCl 、0.05mol/L CaCl 2的0.1mol/L pH8.0 Tris-HCl 缓冲液500mL （配1000mL ：12.1g Tris ，37.5g KCl ，5.6g CaCl 2）。
