当前位置：文档之家 › 猪胰蛋白酶的分离纯化与鉴定

猪胰蛋白酶的分离纯化与鉴定

  • 格式：doc
  • 大小：195.50 KB
  • 文档页数：9

猪胰蛋白酶的分离纯化与鉴定

一、实验目的

1、掌握等电点沉淀、盐析及离子交换层析原理及操作。

2、熟悉胰蛋白酶分离纯化的一般过程。

3、掌握胰蛋白酶活力测定方法及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。

二、实验原理

胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca2+的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。

猪胰蛋白酶的分子量约为23400，其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，

胰蛋白酶在pH3条件下较稳定，在pH5以上易自溶，Ca2+离子对胰蛋白酶有稳定作用，在低温条件下贮存数周内酶的活性不发生明显的改变。

本实验以猪胰脏为材料，首先用酸性水溶液抽提组织，在Ca2+离子存在条件下，以少量胰蛋白酶结晶激活所得的酶原，再以硫酸铵盐析获得粗胰蛋白酶。经过透析除盐，以羧甲基纤维素柱阳离子交换层析进行纯化，即可获得较纯的胰蛋白酶。

胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。此外还能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端的选择。胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键> 酰胺键> 肽键。因此可利用含有这些键的酰胺或酯类化合物作为底物来测定胰蛋白酶的活力。本实验以酪蛋白为底物的方法来测定胰蛋白酶活力，其主要用于测定胰蛋白酶粗制品的活力。胰蛋白酶催化水解底物酪蛋白生成不被三氯乙酸沉淀的小分子肽以及氨基酸。在一定浓度范围内酶的水解滤液在波长280nm处光吸收的增值与胰蛋白酶的活力单位成正比。测定中以标准酪氨酸溶液的光吸收值做对照，根据酶活力蛋白的定义，确定样品中胰蛋白酶的活性。活力单位的定义：在一定条件下每分钟酶水解滤液光吸收的增值与1μmol酪氨酸在280nm处光吸收值相同时的酶量为一个蛋白酶活力单位（U）。

三、试剂和器材

1、试剂：

（1）pH2.5乙酸酸化水：在酸度计监测下，向蒸馏水中加入乙酸，使pH达2 .5。

（2）10%（V/V）HAc 溶液

（3） 2.5 mol/L H2SO4

（4）5 mol/L NaOH

（5）2 mol/L HCl

（6）0.001 mol/L HCl

（7）0.01 mol/L , pH5.0，柠檬酸钠缓冲液：

量取41mL 0.01mol/L柠檬酸溶液（2.10 g H3C6H5O7·H2O/L），

加入59 mL 0.01mol/L柠檬酸钠溶液（2.9 g Na3C6H5O7·2H2O/L）混匀，

用酸度计检查pH值是否为5.0。

（8） 0.05 mol/L , pH5.0，柠檬酸钠缓冲液： 量取8.2 mL 0.05mol/L柠檬酸溶液（10.5 g H3C6H5O7·H2O/L），

加入11.8 mL 0.05mol/L柠檬酸钠溶液（14.705 g Na3C6H5O7·2H2O/L）混匀，用酸度计检查pH值是否为5.0。

（9） 0.1 mol/L , pH6.0，柠檬酸钠缓冲液：

量取19 mL 0.1mol/L柠檬酸溶液（21 g H3C6H5O7·H2O/L），

加入81 mL 0.1mol/L柠檬酸钠溶液（29 g Na3C6H5O7·2H2O/L）混匀，用酸度计检查pH值是否为6.0。

（10） 8％三氯乙酸

（11） 10 mg/mL酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加13 mL 0.5 mol/L NaOH溶液, 0.1

M Tris－HCl缓冲液，pH8.0 40 mL，置85℃水浴加热至溶解，放至室温后，加上述缓冲液40 mL,用1 N HCl小心调pH为8.0，用缓冲液定容至100 mL。

（12） 不同pH值缓冲液的的配制

Ⅰ 0.1 M磷酸缓冲液：pH6.0、6.5、7.0、7.5

a. 0.1 M磷酸氢二钠的配制:

称取Na2HPO4·12H2O（358.14 g/mol） 17.9070 g

加水定容至 500 mL

b. 0.1 M 磷酸二氢钠的配制:

称取 NaH2PO4·2H2O (156.01 g/mol） 7.8005 g

加水定容至 500 mL

c. 二者互兑至相应pH值

Ⅱ 0.1 M Tris－HCl缓冲液：pH8.0、8.5、9.0

称取Tris 12.11 g

加入水 60 mL

用3N HCl调至所需pH

加水定容至 100 mL

Ⅲ 0.1M NaCO3－NaHCO3缓冲液：pH9.5、10.0、10.5

a. 0.1M NaCO3的配制：

称取 NaCO3 5.2995 g

加水定容至 500 mL

b. 0.1M NaHCO3的配制：

称取 NaHCO3 4.2005 g

定容至 500 mL

c. 二者互兑至相应pH值

（13）SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）所需试剂(无需配制)

① 30%储备胶溶液：将29.0g丙烯酰胺（Acr）和1.0gN-N′亚甲双丙烯酰胺（Bis）溶于60 mL水中，于37℃溶解，定容至100 mL, 棕色瓶存于室温。

② 1.5 mol/L Tris－HCl(pH 8.8)：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.8，定容至100 mL。

③ 1.0 mol/L Tris－HCl(pH 6.8)： Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8，定容至100mL。

④ 10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶，浓盐酸调至pH 7.2，定容至100 mL。

⑤ 10%过硫酸铵（AP）： 100mg AP加ddH2O至1mL。

⑥ TEMED 采用原包装液，4℃保存。

⑦ 10×电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10mL加ddH2O溶解, 定容至100mL。

⑧ 4×SDS电泳上样缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl (pH 6.8)，

8%SDS，

0.4%溴酚兰 1.0ml，

40% 甘油

⑨ 考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝（R-250） 0.25 g，甲醇225mL，冰醋酸 46mL，ddH2O 225mL。

⑩ 脱色液：甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。

2、材料

新鲜或冰冻猪胰脏

3、仪器

组织捣碎机、高速冷冻离心机、磁力搅拌器、透析袋、分析天平、蛋白质柱层析系统、恒温水浴锅、电泳仪、电泳槽、计时器、pH计、凝胶成像仪、核酸蛋白质分析仪。

四、实验方法

1．猪胰蛋白酶的分离纯化

（1）粗猪胰蛋白酶的提取

取猪胰脏，除去脂肪和结缔组织，切碎，称重约50g

加入5倍体积预冷的pH2.5乙酸酸化水

用组织捣碎机捣碎

离心10000 rpm，15 min

用4层纱布过滤得上清液（收集约1.5 mL，作为留样1，测蛋白含量，及时SDS化）

将研细的固体无水氯化钙慢慢加入酶原溶液中，边加边搅拌均匀，使溶液中最终含有0.1 mol/L CaCl2

加入极少量猪胰蛋白酶（约2-5mg），轻轻搅拌均匀

用5 mol/L NaOH 调pH为 8.0

于25℃下活化4~6小时（2小时取样一次），测定酶活性增加的情况 活化完成后，用2.5 mol/L H2SO4调pH至2.5～3.0

（收集约1.5 mL，作为留样2，测蛋白含量，及时SDS化）

量取体积，加入固体硫酸铵达到75%饱和度，静置过夜

离心10000 rpm，15 min 沉淀为粗胰蛋白酶

（2）透析

将粗胰蛋白酶溶于适量预冷的0.001 mol/L HCl溶液中，用2 mol/L

HCl调pH至3，在4℃下对0.001 mol/L HCl溶液透析10小时，而后改用0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲液透析过夜。

次日，离心10000 rpm，15 min，取上清（记录样品体积，收集约1.5 mL，作为留样3，测蛋白含量，及时SDS化）

（2）离子交换层析法初步纯化猪胰蛋白酶

用0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲液平衡CM-纤维素离子交换柱

直接上样于CM-纤维素离子交换柱

以0.01 mol/L , pH5.0柠檬酸钠缓冲液充分洗净未吸附蛋白质

用0.05 mol/L , pH5.0，柠檬酸钠缓冲液洗脱，并收集，此峰为猪胰凝乳蛋白酶

待胰凝乳蛋白酶峰过后，改用0.1 mol/L , pH6.0，柠檬酸钠缓冲液洗脱，此时出现一洗脱峰，收集洗脱液为猪胰蛋白酶。

再生柱子（0.5 M NaOH-0.5 M NaOH）

用蒸馏水洗至呈中性

2．蛋白质含量的测定

蛋白质含量测定采用紫外吸收法。用核酸蛋白分析仪分别测定蛋白质样品在280nm、260nm处的吸收值，以缓冲液为空白对照，按下式计算蛋白质质量浓度C（mg/mL）：

)74.045.1(260280AAn蛋白质质量浓度＝

式中，A280：蛋白质溶液在280nm测得的吸收光度；

A260：蛋白质溶液在260nm测得的吸收光度；

n：稀释倍数。

3．酶活力的测定

①取3支试管按1～3编号。

NO.1体系：样品管

酶液 1 mL

（用0.1M Tris-HCl、pH 8.0缓冲液稀释至合适的浓度,酶液与缓冲液的量为1 mL，可根据具体情况来调节酶

液的浓度，一般粗胰蛋白酶为10～80μg/mL，纯化胰蛋白酶约为6～20 μg/mL)

↓

精确加入37℃预热的10 mg/mL酪蛋白溶液 1mL

↓

混匀，立即置于37℃水浴中，准确反应10min

↓

加入8％三氯乙酸 3 mL

↓

迅速摇匀，终止反应

3000 r/min,5min

取上清，测A280

NO.2体系：对照管

37℃预热的10 mg/mL酪蛋白溶液 1 mL

合集下载

胰蛋白酶或抑制剂分离、纯化综合分析

胰蛋白酶或抑制剂分离、纯化综合分析

实验 胰蛋白酶或抑制剂分离、纯化

在动物胰脏中，胰蛋白酶是以无活性的酶原状态存在的。在生理条件下，胰蛋白酶原随胰液分泌至十二指肠后，在小肠上腔有Ca2+的环境中，为肠激酶或胰蛋白酶所激活，其肽链 N -端的赖氨酸与异亮氨酸之间的一个肽键被水解，失去一个酸性6肽，其分子构象发生一定的改变后转变为具有催化蛋白质水解活性的胰蛋白酶。

胰蛋白酶原分子量约为24 000，其等电点为pH8.9；胰蛋白酶的分子量约为23 400，其等电点为pH 10.8。

胰蛋白酶在pH3.0时最稳定，其浓溶液可贮存于冰箱（0℃以下）数周而活性无显著丧失。pH＜3时，胰蛋白酶易变性。 PH＞５时，胰蛋白酶易自溶。胰蛋白酶催化活性的最适pH为7.6～7.8。

重金属离子、有机磷化合物和反应产物都能抑制胰蛋白酶的活性。胰脏、卵清和大豆中也含有一些蛋白质对胰蛋白酶活性具有抑制作用。

实验（一）胰蛋白酶活性测定

[原理]

胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，对于由碱性氨基酸（如精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的肽键具有高度的专一性。此外，胰蛋白酶也能催化由碱性氨基酸的羧基所形成的酰胺键和酯键，有高度的专一性仍表现为对碱性氨基酸羧基一侧的选择对此等化学键的催化水解活性的敏感度为：酯键＞酰胺键＞肽键。因此，可以利用含有这些化学键中任一种键型的底物来研究胰蛋白酶的专一催化活性。

本实验方法一采用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯[（BAEE），N-benzoyl-L-arginine ethyl ester]作为底物，水解反应如下：

N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯（BAEE）在波长253nm下的紫外光吸收远远弱于N-苯甲酰-L-精氨酸[（BA），benzoyl-L-arginine]的紫外光吸收。在胰蛋白酶的催化下，BAEE随着酯键的水解，水解产物 BA逐渐增多，反应体系的紫外光吸收亦随之相应增加，以△A253nm计算胰蛋白酶的活性。

胰蛋白酶的BAEE单位定义为：以BAEE为底物，在一定反应条件下，每分钟使△A253nm增加0.001的酶量为一个BAEE单位。

实验报告亲和层析法纯化胰蛋白酶

实验报告亲和层析法纯化胰蛋白酶

亲和层析法纯化胰蛋白酶

一. 实验目的

1.理解亲和层析法的基本原理, 并通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作方法；

2.掌握利用紫外可见分光光度计测定酶活性和抑制酶活性的原理和方法。

二. 实验原理

亲和层析主要是根据生物分子与其特定的固相化的配基或配体之间具有一定的亲和力而使生物分子得以分离。这是由一种典型的吸附层析发展而来的分离纯化方法。许多生物分子都具有能和某些相对应的专一分子可逆地结合的特性。这种分子之间的结合能力做亲和力。亲和层析正是利用生物分子间所具有的专一亲和力而设计的层析技术。所以有人称为“生物专一吸附技术”。

在实际工作中, 只要把被识别的分子, 称为配基（Ligand）, 在不损害其生物学功能的条件下共价结合到水不溶性载体或基质上（如Sepharose4B）制成亲和吸附剂, 然后装柱。再把含有要分离纯化的物质的混合液通过这个柱子, 这时绝大部分对配基没有亲和力的化合物均顺利地流过层析柱而不滞留, 只有与配基互补的化合物被吸附留在柱内。当所有的杂质从柱上流走后, 再改变洗脱条件, 使结合在配基上的物质解离下来。这样, 原来混合液中被分离的物质便以高度纯化的形式在洗脱液中出现。

本实验为了纯化胰蛋白酶, 采用胰蛋白酶的天然抑制剂—鸡卵粘蛋白作为配基制成亲和吸附剂。鸡卵粘蛋白是专一性较高的胰蛋白酶抑制剂, 对牛和猪的胰蛋白酶有相当强的抑制作用, 但不抑制糜蛋白酶。在pH=7-8的缓冲溶液中卵粘蛋白与胰蛋白酶牢固地结合, 而在pH=2-3时, 又能被解离下来。采用鸡卵粘蛋白作成的亲和吸附剂可以从粗提液中通过一次亲和层析直接获得高纯度的胰蛋白酶制品, 比用经典分离纯化方法简便得多。纯化效率可达到10-20倍以上。

1.三. 实验方法步骤

2.鸡卵粘蛋白的制备

取蛋清60ml, 加入等体积的三氯乙酸丙酮溶液（丙酮: 三氯乙酸=40:60）后, 出现大量白色沉淀, 搅匀后室温静置4h以上, 待清蛋白完全沉淀, 3000rpm离心10min, 弃去沉淀, 47ml上清液倒入250ml锥形瓶并用塑料薄膜封好, 置于冰箱中冰浴片刻, 缓慢加入3倍体积(141ml)的预冷丙酮, 搅匀后冰浴4h直到出现沉淀,用真空泵抽去部分上清液, 剩余部分的部分沉淀和上清液全部转移至离心管中, 以3000rpm下离心15min, 弃上清液。离心管底部沉淀物放置真空干燥器内, 抽气去丙酮, 然后用20ml蒸馏水溶解。之后将鸡卵粘蛋白溶液装入透析袋内对蒸馏水透析。将透析液转移到离心管内, 再次以3000rpm下离心15min。

猪胰铁蛋白的分离纯化方法比较研究

猪胰铁蛋白的分离纯化方法比较研究

２０１０年第ｉ期　漳州师范学院学报（自然科学版）　（总第６７期）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＺｈａｎｇｚｈｏｕ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．）　Ｎｏ．１．２０１０年　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｎｏ．６７　

文章编号：１００８—７８２６（２０１０）０１—０１１５—０３　

猪胰铁蛋白的分离纯化方法比较研究　

林志超　

（漳州师范学院生物科学与技术系，福建漳州３６３０００）　摘要：比较两种铁蛋白提取方法：传统的硫酸铵沉淀法和超滤法，发现超滤法的提取效率和提取的纯度上　都要大于传统的硫酸铵沉淀法．有利于批量生产铁蛋白，以满足研究需求和产品商品化．　关键词：猪胰铁蛋白；提取方法；超滤　中图分类号：　Ｑ７５　文献标识码：　Ａ　

Ｔｈｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｏｆ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｌｅｎｔｉｎａｎ　

Ｉ　ＩＮ　Ｚｈｉ．ｃｈａｏ　

（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｚｈａｎｇｚｈｏｕ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｆｕｊｉａｎ　３６３０００，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ａ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｃｒａｆｔ　ｏｆ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｉｅｎｔｉｎａｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｕｓｉｎｇ　ｓｅｒｉｅｓ　ｏｆ　ｃｒａｆｔ．　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　ｅｔｈｙｌａｌｃｏｈｏｌ，ＤＥＡＥ－ａｃａｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｃｏｌｕｍｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉ，　ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－２００　ｃｏｌｕｍｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｙ　ａｎｄ　ＳＯ　ｏｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｈｅ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｎｇ　ｒａｔｅ　ｏｆ　ＬＮＴ　Ｉ　ｂ　ｗａｓ　９５．５５％，　ａｎｄ　ｉｔ　ｉｓ　ｐｒｏｖｅｄ　ｔｈａｔ　ＬＮＴ　Ｉ　ｂ　ｉｓ　ａ　ｋｉｎｄ　ｏｆ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｌｅｎｔｉｎａｎ；ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　

生化制备技术实验操作指导

生化制备技术实验操作指导

生化制备技术实验

1

生化制备技术实验操作指导

温州大学生命与环境科学学院

2012年2月

生化制备技术实验

2

实验须知

1．实验室规则

(1) 实验课须遵守实验室开放时间，应自觉遵守课堂纪律，严禁在实验室吃东西、大声喧哗等行为。每组成员可按个人时间协作完成实验过程，但必须每位成员都参与到实验当中，并由组长预先提交实验分工安排书，交予指导教师作为签到依据。

(2) 使用仪器、药品、试剂和各种物品必须注意节约, 应特别注意保持药品和试剂的纯净, 严防混杂污染。

(3) 实验台、试剂药品架必须保持整洁, 仪器药品摆放井然有序。实验完毕,需将药品、试剂排列整齐, 仪器洗净倒置放好, 实验台面抹拭干净, 经教师验收仪器后, 方可离开实验室。实验仪器为配套使用，不可随意调换。每组组长在实验进行之前及结束之后负责对仪器和耗材进行清点，及时反映问题。

(4) 使用和洗涤仪器时, 应小心谨慎, 防止损坏仪器。使用精密仪器时, 应严格遵守操作规程, 发现故障应立即报告教师, 不要自己动手检修。

(5) 在实验过程中要听从教师的指导, 严肃认真地按操作规程进行实验, 并简要、准确地将实验结果和数据记录在实验记录本上。课后写出实验报告, 实验课程完全结束后由学习委员收齐交给教师。

(6) 仪器损坏时, 应如实向教师报告, 认真填写损坏仪器登记表。

(7) 实验出现问题，不建议盲目重做，应及时总结原因，给出合理解释。实验课不完全以最终实验结果为评分依据，更重要的是考察分析问题和解决问题的能力。

(8) 每次实验课安排同学轮流值日, 值日生要负责当天实验的卫生和安全检查。

2．实验记录

实验课前应认真预习实验内容，将实验名称、实验原理、实验内容和步骤等简单扼要写在记录本上。实验记录本要标明页码，不能随意撕掉任何一页。实验中使用的试剂纯度和终浓度以及使用的仪器类型等都要记录清楚。实验中观察到的现象、结果和得出的数据，应及时直接记在记录本上，绝对不可以随意记在单片纸上。原始记录必须准确、简练、清楚。