高效液相色谱演示实验

高效液相色谱分析实验高效液相色谱(HPLC)是一种用于分离、检测和定量分析化学样品的分析技术，具有高分辨率、高灵敏度和高选择性。

在实验室中，HPLC广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全等领域。

本文将介绍HPLC的实验原理、步骤及关键技术。

一、实验原理HPLC的原理是将混合物通过高压注射，经过固定相柱进行分离。

在HPLC中，固定相柱是最重要的组成部分之一，它可以根据样品之间的化学性质选择不同的固定相柱，如反相柱、离子交换柱、手性柱等。

在HPLC实验中，样品可以通过两种方式进样，一种是自动进样器，另一种是手动进样。

进样器将样品注入进样站点后，通过高压泵将样品推入柱子中，样品在柱子中分离后，被通过光学检测器检测，进而得到分离的结果。

二、实验步骤1.样品准备：根据实验要求，准备需要进行分析的物质样品，将其溶解或稀释到适当的浓度。

2.选择柱子：根据样品的性质选择适当的固定相柱。

例如，如果样品是极性的，则选择反相柱。

3.设定实验条件：根据样品的特征和实验需求，设置高压泵的流速、检测器、柱温等参数。

4.样品进样：将样品使用自动进样器或手动进样器进行进样。

5.柱子分离：开启高压泵，将样品推入柱子中。

样品将在柱子中根据化学性质进行分离。

6.数据检测和记录：通过光学检测器检测样品的峰值，并记录分离结果。

可以使用计算机软件进行数据分析。

7.清洗和重用：实验完成后，需要对HPLC仪器进行清洗和重置，以便下次使用。

三、关键技术1.换柱：为了保证实验结果的准确性和可靠性，柱子需要定期更换。

柱子的寿命取决于样品的特性和使用情况。

2.校准标准品：在实验中使用标准品校准HPLC仪器，以确保仪器的准确性和灵敏度。

3.优化实验条件：通过改变流速、温度、柱子等实验条件，可以优化分离效果。

4.检测器选择：根据样品的性质选择合适的检测器，例如紫外检测器、荧光检测器等。

5.数据分析：使用HPLC软件对数据进行分析，生成和保存分析报告。

四、实验安全1.注意个人防护：在操作HPLC仪器时，应佩戴安全防护眼镜和手套，避免接触有害物质。

高效液相色谱实验报告高效液相色谱法，基本原理为影响柱效的主要因素是涡流扩散和传质阻抗。

分为液固吸附色谱法，流动相为液体，固定相是固体吸附剂；液分配色谱法，固定相几乎全是化学键合硅胶，又称化学键合相色谱法等。

（二）塔板理论：塔板理论方程式（高斯方程式）：理论塔板式数：理论塔板高度：（三）速率理论： h=a+b/u+cu影响塔板高度的因素：1、涡流扩散 2、纵向扩散 3、传质阻抗二、气相色谱仪：（1）色谱柱：固定相与柱管组成。

填充柱、毛细管柱；分配柱、吸附柱（2）紧固液：低沸点的液体，操作方式下为液态。

甲基硅油、聚乙二醇等选择原则：按相似性、按主要差别、按麦氏差别选择。

（3）载体：化学惰性的多孔性微粒（4）毛细管色谱柱：开管型、填充型（5）检测器：1、浓度型检测器：热导检测器和电子捕捉检测器2、质量型检测器：氢焰离子化检测器中国药典对气相色谱规定：除检测器种类、紧固液品种及特定选定的色谱柱材料严禁任一修改外，其他均可适度发生改变，色谱图于30min内记录完。

第四节高效液相色谱法1、基本原理：影响柱效的主要因素就是涡流蔓延和传质电阻。

分类：1、液固吸附色谱法：流动相为液体，固定相是固体吸附剂。

2、液——液分配色谱法：紧固二者几乎全系列就是化学键再分硅胶，又称化学键再分相色谱法。

按固定相和流动相的极性2又分：正相色谱法和反相色谱法正相色谱法：流动二者极性大于紧固二者极性的色谱法。

用作拆分溶有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用作所含相同官能团物质的拆分。

极性强组分先流入反相色谱法：……………大于……………………… 用于分离非极性至中等极性的分子型化合物2、高效率液相色谱仪：1、高压输液泵2、色谱柱3、进样阀4、检测器：紫外稀释检测器、荧光检测器、热法折光检测器、电化学检测中国药典对高效液相色谱法规定：除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意更改外，其余均可适当改变，色谱图于20min内记录完毕。

第五节色谱系统适用性试验和定量分析方法一、系统适用性试验1、色谱柱的理论板数：2、分离度：应大于1.53、重复性3、拖尾声因子：0.95-1.05之间二、定量测定法：1、内标法加较正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量2、外标法测量供试品中某个杂质或主成分含量3、加较正因子的主成分自身对照法不加较正因子的主成分自身对照法。

1、了解HPLC的结构和流程及操作方法；2、了解流动相的制备和样品溶液的制备；3、掌握该仪器的运行程序和具体操作内容；4、学会用HPLC对样品进行分析，并从图谱中获得有用数据。

二、实验原理高效液相色谱由储液器，泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成，储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动，经过反复多次的吸附—解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。

三、仪器和试剂1、仪器：美国安捷伦1200型HPLC一台（如图一）、50μL的微量注射器一个图一、常见的HPLC图2、试剂：磷酸乙腈溶液(PH=3)、重蒸水、邻氯苯甲酸1、流动相的准备 流动相只有一组：PH=3的磷酸乙腈溶液，进过脱气，用蠕动泵输送。

2、样品溶液的准备配置好邻氯苯甲酸溶液，按要求选好滤纸的孔径大小。

用低压过滤装置过滤，由于美国安捷伦1200型HPLC 配有脱气装置，因此滤液无需事先脱气就可以进行分析。

3、开机 当2完成后，开机，待色谱柱平衡。

4、基线的查看由于仪器内部压力的变化可以引起基线的不断波动，因此，需等待压力稳定后，基线平稳才能进行进样。

5、样品进样分析用微量注射器取10μL 的邻氯苯甲酸，微量注射器中不能有气泡，将微量注射器的针头插入到注射的孔时，打开微量注射阀，将邻氯苯甲酸注射进去后，迅速关闭阀门，抽出针头，等待仪器的分析结果。

6、色谱柱的清洗分析工作结束后，要清洗进样阀中的残留样品，也要用甲醇溶液来清洗色谱柱。

7、关机实验完毕后，关闭仪器和电脑。

五、实验数据及处理1、LC 参数表5-1 LC 参数数据表温度 流速 停止时间VWD 信号 后运行时间 最大压力 最小压力 25.0℃ 1.000 mL/min0.00 min236 nm0.00 min300 bar0 bar2、色谱柱参数 色谱柱柱子 柱长 柱子内径 运行压力 C18150 mm4.6mm88bar表5-2色谱柱参数表3、根据色谱分析谱图（见附页），经过注射10μL 的邻氯苯甲酸，得到了三组实验色谱图，列出谱图上的数据如下表：峰 # 保留时间/min 类型 峰宽/min 峰面积/mAU*s 峰高/mAU 峰面积/% 1 1.411VV 0.3191 76.03598 3.25529 0.3692 2 2.444 VV 0.1151 2.03350e4 2806.48608 98.7468 33.220VBA0.1189159.4780720.732140.7744表5-3 实验数据表4、理论塔板数的计算与分析已知，色谱柱长(L)、理论塔板高度(H)与理论塔板数(n)三者的关系为： n = L / H而且，理论塔板数和色谱参数之间的关系为： n = 16 ( t R / W b ) 2 = 5.54 ( t R / Y 1/2 ) 2 取第1组的数据计算可以得到： t R = 1.411 min = 84.66 sY 1/2 = 2.354(0.3191 / 4 ) =0.1878min= 11.27 s 则：n 1= 5.54 ( t R / Y 1/2 ) 2 = 313 (块)同上法，得到其他两组的理论塔板数：n 2=7227(块) n 3=11732(块)根据塔板理论，单位住长的理论塔板数越多，表明柱效越高，则可以得出，保留时间越长，色谱柱分离效能的越好。

联苯、甲苯、萘和菲以及它们混样的高效液相色谱分析实验目的1.熟练掌握高效液相色谱相关仪器的操作流程。

3.通过谱图分析，掌握运用谱图数据处理目标物质的方法。

一、实验原理色谱分析是运用物质在固定相和流动相两相间的分配系数不同而达到分离，它是一种分离技术，主要目的是对混合物中目标产物进行分离并定量分析的一种技术。

二、实验内容运用高效液相色谱仪测定联苯、甲苯、萘和菲以及四者混合物的色谱，熟练仪器的相关操作流程，能从检测的谱图中定性的指认四者峰的归属，并能定量的描述四者混合物中各自的相对含量。

三、实验步骤1、打开仪器电源开关，让仪器预热一段时间，此时可准备待测样品；2、待仪器运转正常，打开测试软件，先用甲醇清洗柱子（在Load状态下进样，分析时在Inject状态下）；3、进样状态下插入微量注射器，切到装填状态，注入样品，切回到进样状态。

4、点击分析按钮，输入分析的样品名；5、数据分析，通过软件查看积分面积。

五、实验结果液相色谱图0.00.51.01.52.0 2.53.0 3.54.0 4.55.0 5.56.0min0.01.02.03.04.05.06.0mV(x100)Detector A:254nm1.722/156063.034/11168863.383/7097684.037/25429775.046/7069594（2）联苯0.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0min0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.5mV(x100)Detector A:254nm1.7312.5784.1475.2130.01.02.03.04.05.06.07.08.09.0min0.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0mV(x10)Detector A:254nm1.7213.0433.4084.0845.152（4）甲苯0.01.02.03.04.05.06.07.0min0.00.51.01.52.02.53.03.5mV(x10)Detector A:254nm1.7213.0565.193（5）菲0.01.02.03.04.05.06.07.0min0.01.02.03.04.05.06.07.0mV(x100)Detector A:254nm1.7303.4065.075谱图分析：依据各个物种标样的色谱图可以知道他们各自的出峰时间大致为：菲：5.075min ；联苯：4.147 min ；萘：3.408 min ；甲苯：3.032 min ；故此可以判断混样中出峰位置所对应的物种，5.046 min 对应为菲，4.037 min 对应为联苯，3.383 min 对应为萘，3.034 min 对应为甲苯。

高效液相色谱实验The document was prepared on January 2, 2021高效液相色谱实验I. 色谱柱的评价请在实验前预习基础分析化学实验第二版137－140页.目的(1)了解高效液相色谱仪的工作原理；(2)学习评价液相色谱反相柱的方法.原理高效液相色谱是色谱法的一个重要分支.它采用高压输液泵和小颗粒的填料,与经典的液相色谱相比,具有很高的柱效和分离能力.色谱柱是色谱仪的心脏,也是需要经常更换和选用的部件,因此,评价色谱柱是十分重要的.而且对色谱柱的评价也可以检查整个色谱仪的工作状况是否正常.评价色谱柱的性能参数主要有：（1） 柱效理论塔板数n式中t r 为测试物的保留时间,W 1/2为色谱峰的半峰宽.（2） 容量因子k’式中t 0为死时间,通常用已知在色谱柱上不保留的物质的出峰时间作死时间.(3)相对保留值选择因子α式中k 1’和k 2’分别为相邻两峰的容量因子,而且规定峰1的保留时间小于峰2的.(4)分离度R s式中t r1、t r2分别为相邻两峰的保留时间,W b1、W b2分别为两峰的底宽.对于高斯峰来讲,W b =2.为达到好的分离,我们希望n 、α和R s 值尽可能大.一般的分离如α=,R s =,需n 达到2000.柱压一般为104 kPa 或更小一些.本实验采用多核芳烃作测试物,尿嘧啶为死时间标记物,评价反相色谱柱.仪器和试剂Waters 510高效液相色谱仪由Waters 510高压输液泵,Rheodyne 7725i 进样器,440检测器和记录仪组成色谱柱：5 cm × mm ., YWG-C 18H 37 ODS,10 μm流动相：甲醇－水80+20样品I ： 含尿嘧啶 mg ·mL －1、萘 mg ·mL －1、联苯 mg ·mL －1、菲 mg ·mL －1的甲醇混合溶液；样品I I ：尿嘧啶的甲醇溶液；萘的甲醇溶液；联苯的甲醇溶液；菲的甲醇溶液.溶液浓度约为·mL －1；实验内容（1） 准备流动相.将色谱纯甲醇和色谱纯水按比例配制200mL 溶液,混合均匀并经超声波脱气后加入到仪器储液瓶中.（2） 检查电路连接和液路连接正确以后,接通高压泵、检测器和记录仪的电源.设定操作条件为：流速 mL ·min －1,压力上限2′104 kPa 约3000 psi,检22/1r )/(54.5W t n =00r /)('t t t k -=12'/'αk k ＝)/()(2b2b1r1r2s W W t t R +-=测波长254 nm 该仪器检测波长已固定,灵敏度 AUFS,记录仪走纸速度 cm ·min －1,记录灵敏度为5 mV.开启记录仪走纸开关记录基线.并调节基线到合适位置一般为距右10%处.（3） 待基线平稳后建议观察检测器的读数显示,将进样阀手柄拨到“Load ”的位置,使用专用的液相色谱微量注射器取5μL 样品注入色谱仪进样口,然后将手柄拨到“Inject ”位置,同时按一下检测器的标记按钮,同时计时,记录色谱图.（4） 重复3的实验两次.（5） 用同样方法进纯样品的甲醇溶液,确定出峰顺序.（6） 根据三次实验所得结果计算色谱峰的保留时间、半峰宽,然后计算色谱柱参数n 、k’,以及相邻两峰的α、R s（7） 将流速降为0,待压力降为0后关机.思考题1. 高效液相色谱与气相色谱相比有什么相同点和不同点2. 如何保护色谱柱延长使用寿命高效液相色谱实验II固相萃取水样中的多核芳烃并以内标法测定其含量目的（1） 学习固相萃取法处理样品；（2） 用内标法定量.原理固相萃取法是色谱法的一个重要的应用.在此方法中,使一定体积的样品溶液通过装有固体吸附剂的小柱,样品中与吸附剂有强作用的组分被完全吸附；然后,用强洗脱溶剂将被吸附的组分洗脱出来,定容成小体积被测样品溶液.使用固相萃取法,可以使样品中的组分得到浓缩,同时可初步除去对感兴趣组分有干扰的成分,从而提高了分析的灵敏度.固相萃取不仅可用于色谱分析中的样品预处理,而且可用于红外光谱、质谱、核磁共振、紫外和原子吸收等各种分析方法的样品预处理.C18固相萃取小柱具有疏水作用,对非极性的组分有吸附作用,因此可以从水中将多核芳烃萃取出来,完成浓缩样品的作用.固相萃取小柱还有其他类型,如极性、离子交换等.内标法的原理是,设在V mL 样品中含有W i g 待测组分i,加入W S g 内标物S,混匀后进样,得组分i 及内标物S 的峰面积分别为A i 及A S .由于峰面积正比于通过检测器的物质量,所以有：W i =f i A iW S =f S A S式中f i 、f S 分别为组分i 和内标S 的校正因子.两式相除,得所以,组分i 的体积浓度为：S Si S i i W A A f f W ⋅⋅=V W A A f V W A A f f VW SS i i S S i S i i '⋅⋅=⋅⋅=fi’可用已知被测物i和内标物浓度的样品进样分析得到.内标法是一种相对测量方法,因此,进样量不必准确,操作条件稍有变化对结果没有什么影响.仪器和试剂Waters 510高效液相色谱仪由Waters 510高压输液泵,Rheodyne 7725i进样器和440检测器组成色谱柱：5 cm× mm ., YWG-C18H37ODS,10 μm流动相：甲醇－水80+20 流速： mL·min－1检测波长：254 nmC18固相萃取小柱：2支25 mL移液管：1支50 mL医用注射器：1支10 mL医用注射器：2支2 mL容量瓶：2个样品I：内标标准样,含萘 mg·mL－1、联苯 mg·mL－1、菲 mg·mL－1的甲醇溶液.样品II：内标物溶液.含联苯 mg·mL－1的甲醇溶液.样品III：含萘、菲的被测水样.实验内容（1）固相萃取小柱预处理：用10 mL注射器将2 mL甲醇压过小柱,再将2 mL 纯水压过小柱.（2）用移液管取25 mL水样,用50 mL注射器压过小柱,这时水样中的萘和菲被吸附在小柱上.在小柱下端承接一2 mL的容量瓶,将约 mL甲醇用10 mL 注射器压过小柱到容量瓶中,加入一定量内标联苯溶液,定容摇匀,得到浓缩的样品.（3）按“实验I”中的步骤,进样分析内标标准样和浓缩样品各三次.（4）取平均结果,计算峰面积A s和A i；根据内标标准样的浓度计算f i’,再计算出浓缩样品中的萘和菲的浓度,进而计算出原水样中的浓度mg·mL－1.思考题1.内标法与外标法各有哪些特点本实验为什么采用内标法为好2.为什么要对色谱分析中的样品进行预处理简单列出三个以上的原因.。

高效液相色谱实验报告
根据实验任务要求填写实验报告
实验目的：
本实验的目的是利用高效液相色谱仪（HPLC）分析特定有机物的组分，以鉴定其结构组成。

实验原理：
高效液相色谱是一种色谱技术，以分离混合物中的组分，并确定这些
组分的含量，其目的是测定混合物中的每个物质所占的比例。

它的基本原
理是：样品中的物质在其中一适当的溶剂中溶解，将其分成各种各样的表
观溶剂溶液，然后以合适的流动率、柱温和检测系统将溶液分流，分层分离，最后再以射频电压等信号检测检测器检测光谱信号，从而得到物质在
柱内的分离检测结果。

实验设备：
1.高效液相色谱仪。

2.检测器：可选择UV检测器或电压检测器。

3.柱：由于HPLC技术的特点，选择柱的大小、长度、型号和材料取
决于样品的组成。

4.样品：混合型有机物（比如药物）。

实验步骤：
1.准备实验样本：取适量样品，向它加入一定的溶剂，调制成其中一
种浓度的溶液。

2.柱装置：在高效液相色谱仪上安装好柱，根据样品的组成选择合适的柱，将溶液放入柱内，调节柱温，以及流量等各项参数。

高效液相色谱实验报告高效液相色谱实验报告引言：高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种常用的分析技术，广泛应用于药物分析、环境监测、食品安全等领域。

本实验旨在通过HPLC技术分析某种药物中的有效成分，并探讨其分析方法的可行性和准确性。

实验方法：1. 仪器及试剂准备：本实验采用Agilent 1200系列高效液相色谱仪，色谱柱为C18反相色谱柱。

试剂准备包括纯化水、甲醇、乙腈等有机溶剂，以及待测药物样品。

2. 样品制备：取待测药物样品10mg，加入10ml甲醇中，超声处理10分钟，离心沉淀，取上清液备用。

3. 色谱条件设置：流动相采用甲醇-水（60:40）的混合溶液，流速为1.0ml/min，柱温设定为25℃，检测波长为254nm。

4. 样品注射及分析：将样品注入进样器，设定注射体积为10μL，进行分析。

结果与讨论：通过HPLC分析，我们得到了待测药物中的有效成分的峰图，并计算出了其相对峰面积。

根据标准曲线的结果，可以进一步计算出待测药物中有效成分的浓度。

在本实验中，我们发现HPLC技术对于药物分析具有较高的准确性和灵敏度。

通过优化色谱条件，我们可以获得清晰的峰形和较低的噪音，从而提高分析结果的可靠性。

此外，我们还对样品的稳定性进行了研究。

将样品在不同温度下保存一段时间后，再进行HPLC分析，结果显示样品在低温下保存稳定性较好，而高温和阳光暴晒会导致有效成分的降解。

在实际应用中，HPLC技术可用于药物质量控制、环境监测和食品安全等领域。

例如，通过HPLC分析药物中的杂质含量，可以确保药物的质量符合标准；通过HPLC分析环境中的有害物质，可以及时发现和监测环境污染情况；通过HPLC分析食品中的添加剂和残留物，可以保障食品的安全性。

然而，HPLC技术也存在一些局限性。

首先，分析过程中需要一定的操作技巧和经验，对于初学者来说可能存在一定的困难。

高效液相色谱实验报告一、实验目的：1.学习并掌握高效液相色谱法的基本原理及操作方法；2.熟悉高效液相色谱分析仪的结构和性能；3.进行一些标准品的测定，验证高效液相色谱法的分析准确性和重复性。

二、实验原理：三、实验步骤：1.打开高效液相色谱仪的电源，启动设备，待仪器稳定后进行下一步操作。

2.准备待测样品溶液，并过滤以去除杂质。

3.打开进样器盖，将待测样品溶液通过注射器注入进样器。

4.设置流动相的组成和流速，并调节柱温箱温度，使样品能够顺利分离。

5.打开检测器并进行基线校正，确保仪器正常工作。

6.开始自动分析，记录输出数据。

7.报告结果并进行数据分析。

四、实验结果：本实验使用高效液相色谱法对其中一标准品进行分析测定，得到了一系列数据，具体如下：峰1：保留时间为10.345min，峰面积为1246.78mm^2；峰2：保留时间为12.789min，峰面积为1843.56mm^2；峰3：保留时间为15.367min，峰面积为2150.89mm^2；...五、实验讨论：通过高效液相色谱法的分析测定，我们可以得到样品中各组分的保留时间和相对峰面积。

根据实验结果，我们可以推测样品中可能存在着一些特定的化合物。

并且，我们还可以通过峰面积的大小来估计样品中各组分的含量，从而进行定量分析。

值得注意的是，在实验过程中，我们需要严格控制各个参数的稳定性，以确保结果的准确性和重复性。

同时，对于一些复杂样品的分析，可能需要进行柱后衍生化或其他特殊处理，以增强分离效果。

六、实验总结：通过本次实验，我们学习并掌握了高效液相色谱法的基本原理和操作方法，了解了高效液相色谱仪的结构和性能。

同时，通过对标准品的测定，验证了高效液相色谱法的分析准确性和重复性。

高效液相色谱法作为一种重要的分析方法，在科研和工业生产中有着广泛的应用前景。

[1]汪仲良，杨正葆，胡冬琴，杨建民.分析化学.高等教育出版社。

[2]高效液相色谱技术与应用.化学工业出版社。

高效液相色谱实验报告
实验目的：
通过高效液相色谱仪分离和测定混合物中的化合物。

实验原理：
高效液相色谱（HPLC）是一种利用高压将样品中的化合物推
动通过填充在柱中的固相材料的分离技术。

在HPLC中，样
品溶液通过溶剂泵被推入柱中，然后溶剂流经柱床，在样品中的化合物与柱床中的固体相互作用，导致化合物被分离。

随后，溶剂中的化合物传送到检测器中进行检测。

实验步骤：
1. 准备样品溶液：将待测混合物溶解在适当的溶剂中。

2. 准备色谱柱：安装和预平衡色谱柱，选择适当的柱材、填料和流动相。

3. 设置色谱仪参数：设置流动相的流速、温度和检测器等参数。

4. 注入样品：使用自动进样器或手动注射器，将样品溶液注入进样器中，并注入色谱柱。

5. 进行分离：根据样品的特性和需要，使用适当的温度和梯度程序，进行分离。

6. 检测：将溶剂与样品中的化合物一起传送到检测器中，并记录峰高、峰宽和保留时间等数据。

7. 数据分析：通过对峰的分析，确定混合物中各成分的相对含量。

8. 清洗和保养设备：完成实验后，清洗和保养色谱柱和色谱仪
设备。

实验结果：
根据分离得到的色谱图，通过分析峰的保留时间和峰面积，确定混合物中各成分的相对含量。

实验结论：
高效液相色谱是一种有效的分离方法，能够对混合物中的化合物进行准确的分离和测定。

根据实验结果，我们可以得到混合物中各组分的含量信息，并进一步进行结构解析和质量控制等工作。

一、实验目的1. 了解液相色谱的发展历史及最新进展。

2. 学习液相色谱的基本构造及原理。

3. 掌握液相色谱的操作方法和分析方法，能够通过HPLC分离和检测样品。

二、实验原理高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种利用高压泵将液体流动相输送至装有固定相的色谱柱，对混合物进行分离和分析的方法。

根据固定相和流动相的极性差异，将混合物中的组分分离，再通过检测器检测各个组分，从而实现对样品的分析。

三、实验仪器与试剂1. 仪器：高效液相色谱仪、色谱柱、流动相储液体瓶、输液泵、进样器、检测器、记录器等。

2. 试剂：甲醇、磷酸、标准样品、待测样品等。

四、实验步骤1. 准备色谱柱：将色谱柱安装在色谱仪上，连接好各部件，调节好流速和温度。

2. 配制流动相：根据实验要求，将甲醇和磷酸按照一定比例混合，配制成流动相。

3. 进样：将待测样品溶解于流动相中，用进样器将一定量的样品注入色谱柱。

4. 分离：流动相通过色谱柱，根据固定相和流动相的极性差异，将样品中的组分分离。

5. 检测：分离后的组分进入检测器，检测器将信号传输至记录器，记录各个组分的峰面积。

6. 数据处理：将记录器上的数据输入计算机，进行数据处理和分析。

五、实验结果与分析1. 样品分离：根据色谱图，可以观察到待测样品中各个组分的峰，证明液相色谱法可以将样品中的组分分离。

2. 线性关系：在一定的浓度范围内，峰面积与样品浓度呈线性关系，说明该方法具有良好的线性。

3. 精密度：重复进样，观察峰面积的相对标准偏差（RSD），RSD越小，说明实验结果越稳定。

4. 灵敏度：通过减小进样量，观察峰面积的变化，说明该方法具有良好的灵敏度。

六、实验结论1. 本实验成功实现了待测样品的分离和检测，证明液相色谱法在样品分析中的应用价值。

2. 液相色谱法具有分离效能高、灵敏度高、操作简便等优点，适用于多种样品的分析。

高效液相色谱实验高乃群实验目的：1 进一步理解高效液相色谱的基本原理；2 熟悉高效液相色谱仪器的构成；3 了解影响高效液相色谱分离的主要操作参数。

实验原理：1. 基本原理在互不相溶的两相——流动相和固定相的体系中，当两相作相对运动时，第三组分（即溶质或吸附质）连续不断地在两相之间进行分配，这种分配过程即为色谱过程。

由于流动相、固定相以及溶质混合物性质的不同，在色谱过程中溶质混合物中的各组分表现出不同的色谱行为，从而使各组分彼此相互分离，这就是色谱分析法的实质。

也就是说，当一种不与被分析物质发生化学反应的被称为载气的永久性气体（例如H2、N2 、He、 Ar 、CO2等）携带样品中各组分通过装有固定相的色谱柱时，由于试样分子与固定相分子间发生吸附、溶解、结合或离子交换，使试样分子随载气在两相之间反复多次分配，使那些分配系数只有微小差别的组分发生很大的分离效果，从而使不同组分得到完全分离，例如一个试样中含A、B二个组分，已知B组分在固定相中的分配系数大于A，即K B > K A，如图1-1所示。

当样品进入色谱柱时，组分A、B以一条混合谱带出现，由于组分B 在固定相中的溶解能力比A大，因此组分A的移动速度大于B，经过多次反复分配后，分配系数较小的组分A首先被带出色谱柱，而分配系数较大的组分B则迟被带出色谱柱，于是样品中各组分达到分离的目的。

设法将流出色谱柱某组分的浓度变化用电压、电流信号记录下来，便可逐一进行定性和定量分析。

2.高效液相色谱法的分类及其分离原理液-固色谱法液—液色谱法离子交换色谱法凝胶色谱法a.液-固色谱法（液-固吸附色谱法）固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。

①液-固色谱法的作用机制吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其表面常存在分散的吸附中心点。

流动相中的溶质分子X(液相)被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下交换反应： X(液相)+nS(吸附)<==>X(吸附)+nS(液相)其作用机制是溶质分子X(液相)和溶剂分子S(液相)对吸附剂活性表面的竞争吸附。

仪器分析实验报告实验名称：高效液相色谱测定物质浓度一、实验内容1、学习高效液相色谱仪的使用2、利用高效液相色谱法测定溶液中物质的浓度二、实验步骤分别向液相仪注射苯、萘、甲苯、混合四种液体，测定谱图，并利用标准曲线，测定其浓度。

三、数据处理标准曲线：实验数据：0.00.51.01.52.0 2.53.0 3.54.0 4.55.0 5.56.0 6.5min-7.5-5.0-2.50.02.55.07.510.012.515.017.520.022.525.027.530.032.535.037.540.042.545.047.550.0mAU254nm,4nm (1.00)1.401/6571311.872/71922.076/440242.315/176632.542/32972.731/14743.338/3466684.311/107074.829/722055.436/3447766.381/5633图四 苯0.00.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5min-10-505101520253035404550556065mAU254nm,4nm (1.00)4.280/810108图五 甲苯0.00.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5min-10010020030040050060070080090010001100mAU254nm,4nm (1.00)1.281/2692011.523/1123671.851/198352.054/339512.313/57782.523/16233.361/56544.306/46304.591/2586585.394/16492918图六 萘0.00.51.01.52.0 2.53.0 3.54.0 4.55.0 5.56.0 6.5min-20-100102030405060708090100110120130140150160mAU254nm,4nm (1.00)1.363/7093351.890/487072.107/685472.299/240562.512/86352.741/134203.331/4865384.265/8520234.813/1162295.403/26525186.383/5382图七 混合数据计算：表一 混合液中各物质保留时间、峰面积及浓度计算物质苯 甲苯 萘 保留时间（min ） 3.331 4.265 5.403 峰面积（mAu ） 496538 852023 2652518 浓度（ug/ml ）339.854374.9208.803四、数据分析1.谱图中存在一定的杂峰，可能是由于溶液被污染2.保留时间存在一定的差异，可能是由于混合溶液中各组分之间会相互影响3.实验中要注意清洗针头，避免相互污染，并且要尽量排除气泡。