C135 圆红冬孢酵母类胡萝卜素合成突变菌株的筛选_张超蕾

第３６卷第５期２　０　１　７年９月大连工业大学学报Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｄａｌｉａｎ　Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ　ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＶｏｌ．３６Ｎｏ．５Ｓｅｐｔ．２　０　１　７张超蕾，张素芳，刘冰南，王际辉．圆红冬孢酵母类胡萝卜素合成突变菌株的筛选［Ｊ］．大连工业大学学报，２０１７，３６（５）：３１８－３２２．ＺＨＡＮＧ　Ｃｈａｏｌｅｉ，ＺＨＡＮＧ　Ｓｕｆａｎｇ，ＬＩＵ　Ｂｉｎｇｎａｎ，ＷＡＮＧ　Ｊｉｈｕｉ．Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｉｎ　Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｄａｌｉａｎ　Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１７，３６（５）：３１８－３２２．圆红冬孢酵母类胡萝卜素合成突变菌株的筛选张超蕾１，２，　张素芳２，　刘冰南１，　王际辉１（１．大连工业大学食品学院，辽宁大连　１１６０３４；２．中国科学院大连化学物理研究所生物技术部，辽宁大连　１１６０２３）摘要：利用等离子体诱变与亚硝基胍诱变的方法，构建油脂合成缺陷型菌株或类胡萝卜素合成突变菌株。

通过乙酰辅酶Ａ流量的分配，验证油脂合成途径是否为乙酰辅酶Ａ节点处优势分支途径。

利用等离子体与亚硝基胍进行复合诱变，等离子体诱变的致死率为９５％，亚硝基胍诱变的致死率为９０％时，筛选得到圆红冬孢酵母颜色突变株ＸＰ－１、ＸＯ－３、ＸＹ－４和ＸＲ－２。

突变株的油脂含量、脂肪酸的成分和类胡萝卜素的含量测定结果显示，ＸＰ－１、ＸＯ－３、ＸＹ－４等３个菌株的类胡萝卜含量低于出发菌株ＮＰ１１，类胡萝卜素的代谢途径受到一定破坏，但类胡萝卜素的降低并没有促进油脂合成的增加。

ＸＲ－２菌株的油脂含量下降，类胡萝卜素含量相应升高，最高达到０．７７μｇ／ｇ。

结果表明，乙酰辅酶Ａ是一个弱刚性节点，油脂合成途径为此节点的优势分支途径，其产物的减少可有效增加类胡萝卜素合成的增加。

关键词：圆红冬孢酵母；等离子诱变；亚硝基胍诱变；油脂；类胡萝卜素；弱刚性节点中图分类号：ＴＳ２０１．３文献标志码：Ａ文章编号：１６７４－１４０４（２０１７）０５－０３１８－０５Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｏｆ　ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ　ｍｕｔａｎｔｓ　ｉｎ　Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ　ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓＺＨＡＮＧ　Ｃｈａｏｌｅｉ　１，２，　ＺＨＡＮＧ　Ｓｕｆａｎｇ２，　ＬＩＵ　Ｂｉｎｇｎａｎ１，　ＷＡＮＧ　Ｊｉｈｕｉ　１（１．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｉａｎ　Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｄａｌｉａｎ　１１６０３４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｉａｎ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｄａｌｉａｎ　１１６０２３，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ　ｍｕｔａｎｔ　ｓｔｒａｉｎ　ｏｆ　ｏｉｌ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ　ｓｔｒａｉｎ　ｏｒ　ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｂｙｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　ｐｌａｓｍａ　ａｎｄ　ｇｕａｎｉｄｉｎｅ．Ｉｔ　ｉｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｗａｙ　ｏｆ　ｌｉｐｉｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｓ　ｔｈｅｄｏｍｉｎａｎｔ　ｂｒａｎｃｈｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙ　ｏｆ　ａｃｅｔｙｌ　ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａ　ｎｏｄｅ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｅｔｙｌ　ｃｏｅｎｚｙｍｅ　Ａｆｌｕｘ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｗａｓ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｕｓｉｎｇ　ｐｌａｓｍａ　ａｎｄ　ｎｉｔｒｏｓｏ　ｇｕａｎｉｄｉｎｅ．ＸＰ－１，ＸＯ－３，ＸＹ－４ａｎｄ　ＸＲ－２ｍｕｔａｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｓｃｒｅｅｎｅｄ　ｏｕｔ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ＡＲＴＰ　ａｎｄ　ＮＴＧ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｗｉｔｈ　９５％ａｎｄ　９０％ｌｅｔｈａｌｒａｔｅ．Ｔｈｅ　ａｂｉｌｉｔｙ　ｏｆ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｌｉｐｉｄ，ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｏｆ　ＸＰ－１，ＸＯ－３，ＸＹ－４ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｔｈｒｅｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｌｏｗｅｒｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｉｎ　ｓｔｒａｉｎ　ＮＰ１１，ｔｈｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｐａｔｈｗａｙ　ｏｆ　ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ　ｈａｖｅ　ｂｅｅｎ　ｄｅｓｔｒｏｙｅｄ，ｂｕｔ　ｔｈｅｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ　ｏｆ　ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ　ｃｏｕｌｄ　ｎｏｔ　ｐｒｏｍｏｔｅ　ｔｈｅ　ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　ｏｆ　ｌｉｐｉｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｔｈｅ　ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ　ｃｏｎｔｅｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ　ｏｆ　ｌｉｐｉｄ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｉｎ　ｓｔｒａｉｎ　ＸＲ－２，ｗｈｉｃｈ　ｃｏｕｌｄ　ｒｅａｃｈｅｄ　ｔｏ　０．７７μｇ／ｇ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ａｃｅｔｙｌｅ－ＣｏＡ　ｉｓ　ａ　ｗｅａｋｌｙ　ｒｉｇｉｄ　ｎｏｄｅ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｗａｙ　ｏｆ　ｌｉｐｉｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｓ　ｔｈｅｄｏｍｉｎａｎｔ　ｂｒａｎｃｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｗａｙ．Ｔｈｅ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｃａｎ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆｃａｒｏｔｅｎｏｉｄ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ　ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ；ｐｌａｓｍａ　ｍｕｔａｔｉｏｎ；ｎｉｔｒｏｓｏｇｕａｎｉｄｉｎｅ　ｍｕｔａｔｉｏｎ；ｌｉｐｉｄ；ｃａｒｏｔｅ－ｎｏｉｄ；ｗｅａｋｌｙ　ｒｉｇｉｄ　ｎｏｄｅ收稿日期：２０１６－０４－０１．基金项目：国家自然科学基金项目（３１３７０５５４）；辽宁省科技计划项目（２０１４２１１００３）；辽宁省教育厅创新团队项目（ＬＴ２０１４０１０）；大连市科技计划项目（２０１４Ｂ１１ＮＣ０８８）．作者简介：张超蕾（１９８９－），女，硕士研究生；通信作者：王际辉（１９７０－），男，教授．０　引　言在代谢工程中，把弱刚性节点处占主导地位的分支途径称为优势分支途径，其他分支则称为从属分支［１－２］。

阻断从属分支途径，优势途径的末端产物含量也常无显著增加［３－４］。

反之，如果要增加从属分支途径产物的产率，则必须通过弱化优势分支途径来实现。

圆红冬孢酵母中，乙酰辅酶Ａ作为关键代谢节点，是油脂合成与萜类化合物合成的共同前体［５－６］。

在限氮的条件下，乙酰辅酶Ａ更多的流向油脂合成的分支途径，只有少部分流向类胡萝卜素合成途径［７－８］。

受限于遗传操作，产油酵母中油脂合成途径是否为乙酰辅酶Ａ代谢节点处的优势分支途径，萜类合成途径是否为从属分支途径，一直没有确切定论。

由于类胡萝卜素含量变化会导致菌株颜色差异，本实验综合利用等离子诱变与亚硝基胍两种诱变方法［９－１０］，对菌株进行快速诱变，并高通量筛选颜色突变菌株，分析突变菌株的油脂含量、脂肪酸成分和类胡萝卜素含量，以期判断油脂合成途径是否为乙酰辅酶Ａ节点处的优势分支途径。

１　材料与方法１．１　材　料１．１．１　菌　体圆红冬孢酵母单倍体（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）菌株ＮＰ１１，由本实验室分离鉴定并保藏在４℃ＹＥＰＤ斜面。

１．１．２　培养基ＹＥＰＤ培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖２０，蛋白胨１０，酵母粉１０；ｐＨ　６．０。

限氮培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖５０，硫酸铵０．１，酵母粉０．７５，ＫＨ２ＰＯ４０．４，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ　１．５；ｐＨ　６．０。

补加１０ｍＬ痕量元素溶液，每升痕量元素溶液包含：ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ　４．０ｇ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ０．５５ｇ，ＺｎＳＯ４·７Ｈ２Ｏ　０．１０ｇ，ＭｎＳＯ４·Ｈ２Ｏ０．０７６ｇ，１８ｍｏｌ／Ｌ　Ｈ２ＳＯ４１００μＬ。

１．１．３　主要试剂亚硝基胍（ＮＴＧ），Ｓｉｇｍａ公司；酵母粉、蛋白胨，北京奥博星生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯。

１．２　方　法１．２．１　亚硝基胍诱变与等离子体诱变１．２．１．１　亚硝基胍诱变致死率曲线取对数期时的圆红冬孢酵母菌液４．５ｍＬ，用无菌水洗涤２次。

离心后加入ｐＨ　６的磷酸钾缓冲溶液４．５ｍＬ，取５ｍｇ的ＮＴＧ溶于少量的丙酮溶液中，加入磷酸钾缓冲溶液至１ｍＬ，配制成ＮＴＧ溶液。

取４．５ｍＬ菌体加入０．５ｍＬ的ＮＴＧ，使ＮＴＧ的终浓度为５００μｇ／ｍＬ，处理时间分别为１５、３０、４５、６０ｍｉｎ，用硫代硫酸钠终止反应，再用无菌水洗涤２遍后，稀释涂于ＹＥＰＤ培养基上进行培养。

１．２．１．２　等离子体诱变致死率曲线采用无锡思清源生物科技生产的常压室温等离子体进行诱变。

诱变过程：用对数期的菌体进行诱变。

取１０μＬ菌悬液均匀涂于１０ｍｍ锭子上，进行等离子体诱变。

对诱变的仪器进行参数设置。

诱变的气体主要为Ｈｅ，距离２ｍｍ，功率１１５Ｗ，体积流量１２Ｌ／ｍｉｎ，时间分别为２０、３０、４０、５０、６０、７０、９０ｓ。

根据存活的菌体数目计算致死率曲线。

１．２．２　突变株的筛选将ＮＰ１１培养至对数期后，先经过亚硝基胍处理，再进行等离子体诱变。

将处理后的菌体在ＹＥＰＤ中培养６ｈ。

将菌液适当稀释后涂于ＹＥＰＤ平板上，挑选出不同颜色的表型突变菌株。

１．２．３　细胞生物量测定取３０ｍＬ菌液，６　０００ｇ离心收集细胞后用等体积蒸馏水洗涤２次，湿细胞于１０５℃烘至恒重，以ｇ／Ｌ表示细胞生物量。

１．２．４　油脂抽提将发酵１４ｄ的菌液６　０００ｇ离心５ｍｉｎ，细胞用蒸馏水洗涤２次，用酸热法提取［１１］。

按每克湿细胞加１０ｍＬ　４ｍｏｌ／Ｌ　ＨＣｌ，于７８℃水浴处理１．５ｈ，冷却后，加入１０ｍＬ甲醇振荡２ｍｉｎ。

甲醇与氯仿按体积比１∶１加入１０ｍＬ氯仿，收集氯仿层，再加入１０ｍＬ氯仿振荡２ｍｉｎ，６　０００ｇ离心５ｍｉｎ，收集氯仿层，合并氯仿液，加入等体积的０．１％ＮａＣｌ溶液，无水Ｎａ２ＳＯ４过滤，用已知质量的接收瓶收集氯仿层，再用氯仿冲洗３次，在旋转蒸发仪上蒸去氯仿，于１０５℃烘干２ｈ，冷却后称重。

１．２．５　残糖量测定采用山东省科学院生产的ＳＢＡ－４０Ｂ生物传感分析仪进行葡萄糖测定，检测范围在０～１．０ｇ／Ｌ。

１．２．６　脂肪酸组成分析按文献方法［１２］对菌油脂肪酸进行甲酯化，准确称取７０ｍｇ油脂，加入５％ＫＯＨ／ＣＨ３ＯＨ溶液０．５ｍＬ，７０℃回流５０ｍｉｎ。