蓖麻毒素的分离、提取及活性研究

蓖麻毒素的分离、提取及活性研究

本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在四川Ｉ大学读书期间在侯太平教授指导下取得的，论文成果归四川Ｉ大学所有，特此声明。

警２００７＠ｚ衙４户ｊ／杉 四川大学硕｝。学位论文蓖麻毒素的分离、提取及活性研究 农药学专业 研究生：高杉

指导教师：侯太平 本研究以蓖麻毒素灭鼠为目的，以小白鼠活性实验为筛选指标，研究了从蓖麻种子中分离蓖麻毒蛋白的方法，实现了对蓖麻毒素的最优提取，并利用得到的蓖麻籽粗提物对小白鼠进行灭鼠试验，来模拟高原鼠兔的灭鼠效果评价。最终在野外大面积应用实验中，取得了比较满意的效果。 以蓖麻籽为原料，通过选用不同物质做浸提剂，单独研究了各种浸提剂对蓖麻毒素的最佳提取方法，在综合对各浸提剂在其最佳提取条件下的提取蓖麻毒素的效果后，最终确定，０．２ｍｏｌ／Ｌ的磷酸缓冲液在对去皮蓖麻籽的质量体积比为ｌ：３（ｇ／ｍ１）时，浸提２４小时后，所得混合物４０００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ，小心除去油脂，以及离心所剩的渣滓，保留清液，在清液中加入（ＮＨ４）ｚＳ０４盐析剂到８０％饱和度，盐析２４小时，１００００ｒｐｍ离心３０ｍｉｎ，再经透析，真空干燥后所得蓖麻毒素（粗毒）产率最高，同时该提取方法还兼顾到蛋白的稳定性及整个提取流程的经济性，正是要寻找的最佳工艺路线。 应用提取出的蓖麻毒素（粗毒）对小白鼠做活性实验，’结果表明，蓖麻毒素对小鼠腹腔注射的ＬＤ∞为７．９７１ｕｇ／ｋｇ，其主要药效成分为蓖麻毒素。蓖麻毒素使小白鼠中毒后无明显异常反应，不容易造成拒食现象，能够提高灭鼠效率。而小白鼠从腹腔注射后３０ｈ开始出现死亡，直到９６ｈ后均有死亡，说明本毒饵是高效、慢性灭鼠刻。 针对ＪｌＩ西北高原的主要害鼠一高原鼠兔，应用蓖麻毒素灭鼠剂进行了野外 四川ｒ大学硕上学位论文防治实验，在大面积实验中，该粗毒以１％浓度配制毒饵对高原鼠兔的校正灭效为８５％以上。小区实验的灭效在９０％左右。通过连续半个月的观察，未发现鹰等天敌出现二次中毒现象，对受试绵羊也无明显影响，禁牧期后，未发现对牲畜造成危害。这些都充分说明，蓖麻毒素灭鼠剂在应用中是具有安全保障的。， 上述研究结果说明，蓖麻毒素灭鼠剂作为一种新型的灭鼠剂，无二次中毒，对牛、羊等对非靶标生物未见明显危害，比较安全、无残毒，不造成环境污染。不失为一种优良的安全无公害灭鼠剂。关键词：蓖麻毒素；提取分离；ＬＤｓｏ；高原鼠兔；灭洞率 四ＪＩ『人学硕｝。学位论立 Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｒａｗ Ｔｏｘｉｎ ｏｆ Ｒｉｃｉｏｕｓ Ｍａｊｏｒ：Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｇｒａｄｕａｔｅ：ＧＡＯ Ｓｈａｎ

Ｔｕｔｏｒ：ＨＯＵ Ｔａｉ—ｐｉｎｇ Ｔｈｅ ｐａｐｅｒ ｍａｉｎｌｙ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｄｅｒａｔｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｒｉｅｉｎ．Ｉｔ ｔａｋｅｓ ｔｈｅ ｗｈｉｔｅｍｏｕｓｅ’ｓ ａｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ａｓ ｔｈｅ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ，ｓｔｕｄｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ

ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｉｎ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃａｓｔｅｒ ｂｅａｎ．Ｆｉｎａｌｌｙ，ｆｉｎｄｏｕｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｗａｙ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．ａｎｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｒｕｄｅ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ ｒｉｃｉｎ，Ｉ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｋｉｌｌｉｎｇ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｔｏ ｔｈｅ ｗｈｉｔｅ

ｍｏｕｓｅ，ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｔｈｅ ｐｌａｔｅａｕｒｏｄｅｎｔｓ ｔｏ ｄｅｒａｔｉｚａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ａｐｐｒａｉｓａｌ．Ａｔ ｌａｓｔ，ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｇ ａｒｅａ ａｐｐｌｌｅｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｔｈｉｓ ｒｏｄｅｎｔｉｃｉｄｅ ｈａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｅ ｑｕｉｔｅ ｓａｔｉｓｆａｃｔｏｒｙ

ｅｆｆｅｃｔ． Ｃｈｏｏｓｅ ｃａｓｔｅｒ ｂｅａｎ ａｓ ｔｈｅ ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌ。ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｌｅｃｔｓ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ ｔｏ ｓｏａｋ，ａｆｔｅｒ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｂｓｅｔ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｗｉｔｈｄｒａｗｉｎｇｒｉｃｉｎ ｂｙ ｅａｃｈ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ，ａｎｄ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｅｆｆｉｃａｃｙ

ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｂｓｅｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｆｉｎａｌｌｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎ，ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ

ｍｅｔｈｏｄｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｉｓ：ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ０．２ｍｏｌ／Ｌ ＰＢＳ（ｃａｓｔｅｒ ｂｅａｎ：ＰＢＳ，ｑｕａｌｉｔｙｖｏｌｕｍｅ

ｒａｔｉｏ ｉｓ Ｉ：３（ｇ／ｍ１）），Ａｆｔｅｒ ｓｏａｋ ｆｏｒ ２４ ｈｏｕｒｓ，ｏｂｔａｉｎｅｄ ｍｉｘｔｕｒｅ４０００ ｒｐｍ ｃｅｎｔｒｉ ｆｕｇａｔｅｄ ３０ｍｉｎ，ｄｅｇｒｅａｓｅ ｃａｒｅｆｕｌ ｌｙ，ｒｅｍｏｖｅ ｔｈｅ ｓｅｄｉｍｅｎｔ油ｉｃｈ ｔｈｅ

ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ｒｅｍａｉｎｓ，ｋｅｅｐ ｔｈｅ ｃｌｅａｒ １ ｉｑｕｉｄ，ａｎｄ ｕｓｅ（ＮＨ４）２Ｓ幽ｓａｌｔｅｄ ｏｕｔ ｉｎ ｔｈｅ １ ｉｑｕｉｄ ｔｏ ８０％ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ，Ａｆｔｅｒ ｓａｌｔｉｎｇ—ｏｕｔ ３ 四川大学硕｝：学位论文２４ ｈｏｕｒｓ，ｉ００００ ｒｐｍ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａａｔｅ ３０ｍｉａ，ｄｉａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｖａｃｕｕｍ ｄｒｙｉｎｇ．ｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｒｉｃｉｎ（ｃｒｕｄｅ ｅｘｔｒａｃｔ）ｉＳ ｈｉｇｈｅｓｔ，ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｔｈｉＳｗｉｔｈｄｒａｗ ｍｅｔｈｏｄ ａｌＳＯ

ｇｉｖｅ ｄｕａｌ ａｔｔｅｎｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄｅｃｏｎｏｍｉｃａｌ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．Ｓｏ ｉｔ ｐｒｅｃｉｓｅｌｙ ｉＳ

ｔｈｅ ｂｅｓｔｃｒａｆｔ ｒｏｕｔｅ ｗｈｉｃｈ ｗｅ ｓｅｅｋｅｄ． Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｒｉｃｉｎ（ｃｒｕｄｅ ｅｘｔｒａｃｔ）ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｗｈｉｔｅ ｍｏｕｓｅ ａｃｔｉｖｅｎｅｓｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ｆｉｎａｌｌｙ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ，ｔｈｅ ＬＤ５０ ｏｆ ｒｉｃｉｎ ｗｈｉｃｈ ｉｎｊｅｃｔｓ ｔｏ ｔｈｅｍｏｕｓｅ ａｂｄｏｍｉｎａｌ ｃａｖｉｔｙ

ｉｓ ７．９７１ ｕｇ／ｋｇ，ｔｈｅ ｍａｉｎ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｒｏｄｅｎｔｉｃｉｄｅｉｓ ｒｉｃｉｎ．Ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｒｉｃｉｎ ｃａｕｓｅｓ ｔｈｅ ｗｈｉｔｅ ｍｏｕｓｅ ｔｏ ｂｅ ｐｏｉｓｏｎｅｄ．ｔｈｅ ｒ＝ｅｉｓ ｎｏｔ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ａｂｎｏｒｍｉｔｙ ｒｅｓｐｏｎｄｅｄ，ｔｈａｔ ｉｓ ｎｏｔ

ｅａｓｙ ｔｏ ｃｒｅａｔｅ ｔｈｅａｎｔｉｆｅｅｄａｎｔ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ，ｔｈａｔ ｃａｎ ｅｎｈａｎｃｅ ｔｈｅ ｋｉｌｌｉｎｇ ｍｏｕｓｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｓ ｔｈａｔ ｒａｃｉｎ ｉＳ ａ ｓｌｏｗｌｙ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｔｏｘｉｎ ｓｉｎｃｅｔｈｏｓｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｈｉ ｔｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｅｒａｌ ｌｙ ｄｉ ｅｄ ｂｅｔｗｅｅｎ ３０ｈ ａｎｄ

９６ｈ． Ｉｎ ｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｍｏｕｓｅ…Ｏｃｈｏｔｏｎａ ｃｕｒｚｏｎｉａｅ ｉｎ ｔｈｅｗｅｓｔｅｒｎ—ｎｏｒｔｈ Ｓｉｃｈｕａｎ ｐｌａｔｅａｕ。ａｐｐｌｉｃａｔｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｉｎ ｔｈｅ ｂｉｇ ａｒｅａ ｗａｓｔａｋｅｄ，ｕｓｉｎｇ ｒａｃｉｎ ａｓ ｔｈｅ ｍａｉｎ

ｃｏｍｐｏｎｅｔ．ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｒａｔｅｓ ａｒｅ ｏｖｅｒ ８５％．Ｔｈｅ ｋｉｌｌｉｎｇ ｒａｔｅ ｆｏｒ Ｏｃｈｏｔｏｎａ ｃｕｒｚｏｎｉａｅｉＳ ａｂｏｕｔ ９０％ｉｎ ｔｈｅ ｐｌｏｔ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ

ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｉｎ ｈａｌｆ ｍｏｎｔｈ—ｌｏｎｇ，ｗｅ ｈａｄ ｎｏｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ ｏｎ ｎａｔｕｒａｌｅｎｅｍｙ ｌｉｋｅ ｈａｗｋ．Ｔｈｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｓｈｅｅｐ ａｌＳＯ ｎｏｔ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｔｏ ｂｅ ａｆｆｅｃｔｅｄ，ａｆｔｅｒ ｐｒｏｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒａｚｉｎｇ ｐｅｒｉｏｄ，ｗｅ ｈａｓ ｎｏｔ ｄｉｓｃｏｖｅｒ ｔｈｅ ｈａｒｍ ｔｏ ｔｈｅｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｉｍａｌ．Ｔｈｅｓｅ ａｌｌ

ｆｕｌｌｙ ｅｘｐｌａｉｎｅｄ ｔｈａｔ，ｔｈｅ ｒｉｃｉｎ ｒｏｄｅｎｔｉｃｉｄｅｈａｓ ｔｈｅ ｓａｆｅｔｙ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｓｈｏｗｓ

ｔｈａｔ，ａｓ ｏｎｅ ｋｉｎｄ ｏｆ ｎｅｗ ｒｏｄｅｎｔｉｃｉｄｅ，ｔｈｅｒｉｃｉｎ ｒｏｄｅｎｔｉｃｉｄｅ ｈａｓ ｎｏｔ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ，ｓａｆｅ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｓｏ．ｉｔ’Ｓ ａ ｐｒｏｍｉＳｉｎｇ ｒｏｄｅｎｔｉｃｉｄｅ ｔｏ ａｐｐｌｙ ｔｏ ｗｉｄｅ ａｒｅａｓ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｒｉｃｉｎ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ，ＬＤｓ０，Ｏｃｈｏｔｏｎａ ｃｕｒｚｏｎｉａｅ， ｔｈｅ ｋｉｌｌｉｎｇ ｒａｔｅ ｆｏｒ Ｏｃｈｏｔｏｎａ ｃｕｒｚｏｎｉａｅ ４

【『ｑ川人学硕Ｉ：学位论文 前言 蓖麻（Ｒｉｃｉｎｕｓ

ｃｏｍｍｕｎＹｓ Ｌ．）属大戟科蓖麻属，是十大油料作物之一。我国蓖麻种植面积约４７万公顷，蓖麻籽年产量３０万吨，居世界第２位。蓖麻籽榨油后的饼粕富含多种氨基酸、矿物质，可作为牲畜的优良饲料，但蓖麻籽中含有的蓖麻碱、毒蛋白、变应原和血球凝集素等毒素对牲畜有较强的毒性，不能直接被利用。因此，寻找有效提取蓖麻籽中的毒素的方法将会极大地提高蓖麻资源的综合利用程度，产生更大的经济和生态效应。 蓖麻毒蛋白（Ｒｉｃｉｎ）是蓖麻种子中的一种毒蛋白，含量占籽重的１％－５％。在１８８７年，Ｄｉｘｓｏｎ首次证明了蓖麻籽的毒性是由一种蛋白引起的：１９世纪后叶，Ｓｔｉｌｉｍａｒｋ详细地研究了这种毒素蛋白，并建议命名为“Ｒｉｃｉｎ”。此后，蓖麻毒蛋白的理化性质和生物学特性引起了许多生化学家的兴趣和关注。研究表明，蓖麻毒蛋白对所有哺乳动物的有核细胞都有毒害作用，它通过抑制蛋白质合成来杀死癌细胞，这使它在医学上成为用于杀伤肿瘤细胞的候选毒素之一。Ｒｉｃｉｎ是迄今为止天然药中最毒的蛋白之一，几乎对所有真核细胞都有毒性。它以往主要用于治疗肿瘤的研究，在作为灭鼠剂应用上尚未见报道。 有资料显示，川西北高寒草场