猪瘟和猪蓝耳病病毒多重RT_PCR检测方法的建立及初步应用

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常见猪病PCR检测操作步骤及试剂配制(精)

常见猪病PCR检测操作步骤及试剂配制一、RNA病毒(蓝耳病、猪瘟、乙脑、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、轮状病毒等包括病料的处理、RNA的提取、反转录、和PCR扩增、凝胶电泳四个步骤。

1、病料的处理取组织病料约2克,加入4-5毫升灭菌的PBS或者生理盐水,置研磨器(灭菌中研磨或者用剪刀细心剪碎,置-20℃中反复冻融三次,即可用于检测。

2、RNA的提取1取上述冻融三次的病料约200微升置1.5毫升的离心管中,加入500-600微升TRIzol剧烈振摇30秒后,静置5分钟后,再次剧烈振摇30秒后,静置5分钟。

2在加入200微升的氯仿,上下颠倒混匀30s,静置5分钟,4℃ 12000g 离心15 min。

离心完毕后,取上清约400-500微升(注意不要吸到中间层白色物质置新的灭菌好的离心管中,加入等体积的异丙醇,颠倒数次后(不可剧烈震动静置10分钟,4℃12000g离心10 min.可见管底部有少量白色沉淀,倒掉异丙醇,加入1毫升75%的乙醇(DEPC水配制,振摇,将白色沉淀悬浮,4℃7500g离心5 min。

弃去上清,干燥沉淀物(将离心管倒置于卫生纸或者其它吸水纸上,室温约5 min即可加入20μLDEPC 水溶解用于RT-PCR,或于-20℃保存备用。

两步法:1、反转录在10μL的反转录体系中加入:上述步骤中提取的RNA7μL、5×Buffer 2μL、0.5μL或者下游引物0.5μL;65℃10分钟, 10 mM dNTP 0.25μL、Oligo (dT18迅速放置-20摄氏度冰箱中2分钟,加入M-MLV 100U/μL 0.25μL(反转录酶37℃水浴1h,即可做为PCR扩增的模板,立即用于PCR扩增或置于- 20 ℃保存备用。

2、PCR扩增设立阳性和阴性对照,阳性对照一般为病毒液,阴性对照用灭菌的双蒸水做为PCR反应模板。

反应总体系为25μLcDNA 2μL,(模板25mmol/L Mg2+ 1.5μL,2.5mmol/L dNTPs 2.0μL,10× Mg2+ free PCR Buffer 2.5μL,20mmol/ L上下游引物各1μL,Taq DNA聚合酶(5U/μL0.2μL无菌双蒸水补至25.0μL。

RT—PCR检测高致病性猪蓝耳病方法的探讨

至７２．。灭菌，然后在４Ｃ￣保存。５０倍ＴＥ电泳缓冲液的配制。称量三羟甲基氨甲基烷Ａ
２０分钟。弃上清液，沿管壁缓缓滴入１毫升７％乙醇，５轻轻旋
转一周后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上１分钟，自然风干
（以无乙醇味为准）。将ＤＰＥＣ处理的灭菌去离子水与ＲＮＡ酶抑制剂混合（９：按１比例配制）成混合液，１制取０微升将病毒ＲＮ溶解，２微升用于Ｒ－ＣＡ取ＴＰＲ反应模板。分步法Ｒ－Ｃ。ＲＴＰＲＴ体系的组成建立。反转录反应液１６
微升，Ｎ酶抑制剂１ＡＲ微升，录酶１反转微升，已溶解的病毒
ＲＡ２微升，Ｎ总体积２０微升。混匀放入ＰＲ扩增管中，ＰＲＣ在Ｃ扩增仪上进行以下循环，２Ｕ６４＇０分钟，８Ｃ：９￣５分钟，扩增完毕后备用。ＰＲ体系的组成建立。ＣＣＰＲ反应液１６微升，ａＤＡ聚合ＴｐＮ
养殖技术顾问２Ｏ．Ｏ９８
研究与综述
酶２微升，反转录产物２微升，总体积２０微升。混匀，加入并２Ｏ微升矿物油覆盖，于ＰＲ扩增仪上，如下扩增程序扩放Ｃ按增，４０，５Ｏ秒 ×３９ ℃３秒５ ℃３５循环，２Ｃ０，２７￣３秒７ ℃５分钟。扩有的是不同的细菌混合感染，本实验在细菌学的检测中发现没有其他细菌所引起的并发症状。操作过程中的影响。在Ｒ－ＣＴＰＲ的操作过程中。键环节关是ＲＡ的提取。通过变性剂破碎细胞或者组织，Ｎ然后经过氯

高致病性猪蓝耳病与经典猪蓝耳病二重RT—PCR检测方法的建立及应用

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｍｕｔａｔｉｏｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｏｆｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｈｉｌｙｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ（ＨＰ — ＰＲＲＳＶ），ａｎｄｌｏｗｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｐｏｒｃｉｎｅｒｅ— ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ（ＬＰ—ＰＲＲＳＶ），ｔｗｏｐａｉｒｐｒｉｍｅｒＳｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄ，ａｒａｐｉｄｄｕｐｌｅｘＲＴ —ＰＣＲｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇＨＰ－ＰＲＲＳＶａｎｄＬＰ— ＰＲＲＳＶｗｅｒｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄ．１４９８ｓａｍｐｌｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｅａｔａｂｌｉｓｈｅｄｄｕｐｌｅｘＲＴ－ＰＣＲａｓｓａｙ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｍｍｅｒ— ｃｉａｌｋｉｔｓ，ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ
关键词：高致病性猪蓝耳病；猪蓝耳病；二重ＲＴ－ＰＣＲ
ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔＡｎｄＡｐｐｌｙｏｆｄｕ‘ ｐｌｅｘＲＴ－ＰＣＲＡｓｓａｙｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｎｇＨｉｇｈｌｙＰ￣ｈｏｇｅｎｉｃＰｏｒｃｉｎｅＲｅｐｒｏｄｕｃ。ｔｉｖｅａｎｄＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＳｙｎｄｒｏｍｅＶｉｒｕｓＡｎｄＰｏｒｃｉｎｅＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄＲｅｓ。ｐｅｒａｔｏｒｙＳｙｎｄｒｏｍｅＶｉｒｕｓ
猪繁殖与呼吸综合征（ＰｏｒｃｉｎｅＲｅ—
ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＳｙｎｄｒｏｍｅ，

猪瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

猪瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用岳锋;朱艳平;银梅;王选年【摘要】根据GenBank中猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)5' NTR的保守序列,设计1对特异性引物和TaqMan探针,以CSFV全长基因重组质粒pGEM-CSFV为标准品,建立TaqMan实时荧光定量PCR标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验,并检测人工感染CSFV后不同时期猪血浆中CSFV的载量.结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系,R2=0.999;敏感性高,最低检测限为1×101拷贝/μL;特异性强,与猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒无交叉反应性;重复性好,组内和组间变异系数均小于2％.人工感染CSFV后第7天猪血浆中CSFV载量达到峰值,之后逐渐降低.结果表明,建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、重复性好等优点,为CSFV的定量分析及临床诊断奠定基础.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2014(041)006【总页数】5页(P18-22)【关键词】猪瘟病毒;实时荧光定量PCR;TaqMan探针【作者】岳锋;朱艳平;银梅;王选年【作者单位】新乡学院生命科学与技术系,河南新乡453003;新乡学院生物技术研究所,河南新乡 453003;新乡学院生命科学与技术系,河南新乡453003;新乡学院生物技术研究所,河南新乡 453003;河南科技学院动物科学学院,河南新乡 453003;新乡学院生命科学与技术系,河南新乡453003;新乡学院生物技术研究所,河南新乡453003【正文语种】中文【中图分类】S858.28猪瘟（classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起猪的一种热性、出血性传染病，是严重威胁养猪业的重要传染病之一，被世界动物卫生组织（office international des epizooties，OJE）列入OJE疫病名目，也是中国农业部规定的一类传染病（殷震等，1997）。

BVDV荧光RT-PCR检测方法的建立和初步应用

吉林农业大学硕士学位论文BVDV荧光RT-PCR检测方法的建立和初步应用姓名：李天松申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：胡桂学20050601吉林农业大学碗士学位论文ＢＶＤＶ时实定量荧光ＲＴ－－ＰＣＲ检测方法的建立和初步应用２结果２．１病毒培养正常ＭＤＢＫ细胞呈梭形、均匀铺在细胞培养瓶的底部，中心部较亮，边缘明显，有的地方呈现细胞集落。

接毒后７２ｈ开始出现细胞病变（ＣＰＥ），细胞开始变圆、细胞核圆缩边缘、胞浆内出现大量空泡，细胞逐渐脱落，细胞单层呈网状，最后大部分或全部从瓶壁脱落下来，如图ｌ、２。

图１正常ＭＤＢＫ细胞Ｆｉｇ．１ＴｈｅＭＤＢＫｃｏｎｌｒｏｌｃｅｌｌ２．２ＴＣＩＤ５０测定结果图２接毒ＭＤＢＫ细胞Ｆｉｇ．２ＴｈｅｉｎｆｅｃｔｅｄＭＤＢＫｃｅｌｌ细胞病变观察结果见表３。

表３ＯｒｅｇｏｎＣ２４ＶＴＧＩＤ５０测定结果！垫里苎堡！！婪！！竺缎丝！∑婴１２熊稀释度细胞孔观察结果累计细胞孔数细胞ＣＰＥ出现ＣＰＥ孔不出现ＣＰＥ孔出现ＣＰＥ孔不出现ＣＰＥ孔孔数孔的％１０＂１８０３１０３１１００１０一７１２３１２４９５．８１０—７１１６２１８８８．９１０４４４９６１５６０１０～３５５１１１６３１．３１０４１７２１８２０１０１０‘７１７ｔ２５２６４１０‘８０８０３３３３０根据Ｒｅ酣．Ｍｕｅｎｃｈ法计算提供的方法：．１９．高于５０％的百分数．５０一”。

”ｏｕ。

１¨’～”¨）ＴＣ甄ｏ＝ｉ磊赢磊孬丽ｉ赢鬲ｉ再Ｆ“ｍ５％ｍ３１。

３￣０‘３１ｕｕ５０－高于５０％的百分数．低于５０％的百分数所以传代的ＯｒｅｇｏｎＣ２４Ｖ病毒的ＴＯｌＤ５０为Ｏ．１ｍＬ１０４３。

经查反对数约得１９９５２．６即将Ｏ．１ｍＬ病毒进行１９９５２．６倍稀释后的Ｏ．１ｍＬ病毒液为１个ＴＣＩＤｓ０。

２．３ＭｇＣｌ２用量优化结果用预先设定的ＰＣＲ反应体系和条件扩增ＲＮＡ，计算机绘制样品曲线如图３：图３ＭｇＣｌ２优化结果Ｆｉｇ．３Ｔｈｅ代ｓｕｌｔｏｆＭｇＣｈｏｌｒｄｍｉｚａｔｉｏｎ由上至下３条线分别是５耻Ｌ、４ｐＬ、３ｕＬＭｇＣｈ用量的结果曲线，由图３可见，当ＭｇＣｌ２用量为５ｕＬ时，曲线里典型的“Ｓ”形。

猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和乙型脑炎病毒多重RT-PCR检测方法的建立

０２０ｎ、．４ｇ００７ｎ，．７ｇ００９ｎ、．６ｇ其它的ＲＮＡ病毒如ＴＧＶ以及ＤＮＥＡ病毒如ＰＶ、ｒＰＶ２测结果为阴ＰＰＶ、Ｃ－检性。以ｆｃｉｌｔ－ｎ为对照，ａ利用本方法检测了１４份临床样品（ｔ、脏和胎Ｊ）其结果为：ＲＳＣＦ７Ｓ清肺ｋ，ＰＲＶ、ＳＶ和ＪＶ的阳性率分别为３．、．％和１７；ＳＶ和ＰＲＶ混合感染阳性率为１７。同时对临床样品中ＥＯ４４６．ＣＦＲＳ．％ＣＦＪＶ和ＰＲＶ阳性ＰＲ产物进行测序分析，现ＣＦＰＲＳ和ＪＶ的ＰＲ产物序列和ＮＣＩＳＶ、ＥＲＳＣ发ＳＶ、ＲＶＥＣＢ数据库中目标基因的同源性分别为９％、ｏ２９％和８％，９这证实了多重ＰＲ的阳性结果为上述３种病毒。结果证Ｃ
病毒，因此，过特异性引物建立多重ＲＴＰＲ方ｒｓＴＧＶ）猪细小病毒（ｏｃｅｐｒｏｉｓ通－Ｃｕ，Ｅ，ｐｒｉａｖｖｒ，ｎｕ法，疑似病猪的组织样品进行检测，对仅需１次反应ＰＶ）伪狂犬病毒（ｓｕｏａｉｉｓＰＶ）Ｐ，ｐｅｄｒｂｓｖｕ，ｒ和猪ｅｒ即可诊断ＣＦＰＲＶ和ＪＶ的单独或混合感圆环病毒２型（ｏｃｎｉｏｉｕｙｅ２ＰＶ－）ＳＶ、ＲＳＥｐｒｉｅｃｃｖｒｓｔｐ，Ｃ２均ｒ
维普资讯
第２卷第１７期

猪非典型性瘟病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

猪非典型性瘟病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用作者：郭佳琪杨晓宇冯宇杨钒徐志文朱玲来源：《江苏农业学报》2019年第02期摘要：为建立一种快速、准确检测猪非典型性瘟病毒（APV）的方法，根据Genbank发布的APPVNS2基因序列，设计合成1对扩增后目的基因片段大小为500bp的特异性引物。

建立的R’T-PCR方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、伪狂犬病毒（PRV）和猪瘟病毒（CSFV）的检测结果均为阴性，该方法对APPV的最低检岀量为1μl4.95×10拷贝，重复性试验中组间、组内试验结果均与预期相符。

应用该方法对68份疑似患病的仔猪样品进行检测，阳性病料检出率为7.35%。

利用Mega7.0绘制APⅤ系统进化树，对APPⅤ进行遗传进化分析，结果显示本试验检出的APPⅤ（SC株）与中国报道的APPV的亲缘关系较近。

建立的APPV RT-PCR检测方法可用于APPV的临床诊断及流行病学检测。

关键词：猪非典型性瘟病毒;RT-PCR;检测中图分类号：S858281.34+7文献标识码：A文章编号：1000-4440（2019）02-0357-06仔猪先天性震颤（Congenital tremors，CT）会导致仔猪出生后数小时内出现骨骼肌双侧痉挛性收缩，妨碍仔猪站立、步行和寻找乳头3，致使仔猪饥饿和初乳摄入不足，严重的可导致仔猪死亡。

一般根据神经系统是否发生病变，将CT分为A型和B型，A型有明显的大脑和脊柱的组织学损伤，B型无损伤45。

A型又可分为A～A-V5种亚型，其中只有A-I型与AⅡ型具有传染性。

A-型一般认为是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起，以小脑发育不全为特征67。

AⅡ型的病因存在一定争议，直到2015年，Hause等通过宏基因组测序发现了猪非典型性瘟病毒（Atypical porcine pestivirus virus，APPV）2016年，Arruda9确定APPV是A的病因。

猪蓝耳病RT-PCR检测方法的建立

关键词：猪蓝耳病；开放阅读框７；ＲＴ－ＰＣＲ
ＤｏＩ：１０．３９６９／Ｊ．ＩＳＳＮ．１６７１ — ６０２７．２０１７．０６．０１１
国内外诸多学者已对高致病性猪蓝耳病开展了深入研
究，并建立了间接免疫荧光试验、免疫过氧化物酶单层试验、
１材料
２．１引物的设计与合成
经查阅国内外大量文献后发现，高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲｓＶ）的开放阅读框７
（ｏｆｆ７）序列相对保守，依据ＧｅｎＢａｎｋ数据库中公布ＰＲＲＳＶ
１．１参考序列高致病性蓝耳病病毒标准株、蓝耳病标准
株、蓝耳病北美株、蓝耳病欧洲株等设计引物时所参考的序
列均查询自ＧｅｎＢａｎｋ。
的ｏｒｆ７基因序列和高致病性蓝耳病标准株基因序列，用
Ｐｒｉｍｅｒ５．０软件设计引物，扩增ｏｒｆ７至近基因组尾端，产物片
要：本研究针对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）的开放阅读框７（ｏｒ￣７）序列设计扩增引物，建立
ＲＴ — ＰＣＲ检测方法，既可检测出高致病性蓝耳病，也可检测出蓝耳病经典毒株，提高了蓝耳病的检出率。
１０ × ＯｎｅＳｔｅｐＲＮＡＰＣＲＢｕｆｒｅ５Ｌ
作者简介：纪爱英（１９６２￣），女，河北省魏县人，本科，农业技

用RT—PCR方法检测猪瘟与猪蓝耳病混合感染

了一对扩增ＣＦ的引物Ｐ、２ＳＶｌＰ，其片段大小为５８ｂ：０ｐ一对扩增ＰＲＶ的引物Ｐ、４其片段大ＲＳ３Ｐ，
小为４０ｂ。０ｐ
弓物Ｐ： ’一ＣＣＴＧＹＧＡＣＣＧ一ｌ１５ＧＴＣＧＴＧＴＡＧＴＧ３； ’ 引物Ｐ： ’ ＴＡＧＴＴＡＡＡＧＧＡ一 ’ ２５一ＧＴＣＧＣＣＣＧＴＡ３；弓物Ｐ： ’ ＡＧＣＡＧＣＧＣＡＣ３；引物ｌ３５一ＴＧＣＣＡＴＡＴＡ一 ’

２１年０２
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用Ｒ—ＣＴＰＲ方法检测猪瘟与猪蓝耳病混合感染
王隆柏
（．省农业科学院畜牧兽医研究所１福建
摘
福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心
福州３００）５０２
福州３０１：５０３
２福建农林大学动物科学学院．
要福建省某规模化猪场暴发一种以保育猪精神沉郁、体温升高、腹泻、消瘦等为主要特征的传染性疾病。利用Ｒ — ＣＴＰＲ
和ＰＲ分别对采集的病料进行猪瘟病毒、Ｃ猪蓝耳病病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒和猪细小病毒检测，结果猪瘟病毒和猪蓝
以上引物均由大连ＴＫＲＡＡＡ公司合成。１ＲＡ和ＤＡ提取．４ＮＮ取患猪的肺、淋巴结、肾等组织，菌条件下剪取约２ｇ的组织病料，入无加

猪瘟兔化弱毒疫苗中病毒含量实时荧光定量RT_PCR检测方法的建立及初步应用

关键词：猪瘟兔化弱毒；实时荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ；病毒含量中图分类号：Ｓ８５２．４文献标识码：Ａ文章编号：１６７１－７２３６（２０１４）１２－００５６－０６
猪瘟（ｃｌａｓｓｉｃａｌｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒ，ＣＳＦ）是由猪瘟病毒（ｃｌａｓｓｉｃａｌｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ，ＣＳＦＶ）引起猪的一种高度接触性传染病。目前，中国猪瘟的流行以温和型猪瘟和母猪持续感染引起的流产、死胎和新生仔猪死亡为主；同时，猪瘟疫情表现复杂，区域性流行和零星散发并存；猪瘟免疫猪群频繁发病，往往还伴随有多种原因引起的免疫失败，严重威胁养猪业的健康发展（王琴，２０１２）。疫苗免疫接种仍是预防和控制猪瘟的重要手段，中国的猪瘟兔化弱毒（ｈｏｇｃｈｏｌｅｒａｌａｐｉｎｉｚｅｄｖｉｒｕｓ，ＨＣＬＶ）是国内制备猪瘟弱毒疫苗种毒，用于生产猪瘟兔化弱毒疫苗细胞苗和脾淋苗（仇华吉等，２００５；宁宜宝等，２０１１）。国内有些猪瘟兔化弱毒疫苗生产厂家生产的疫苗效价达不到免疫预防需求。目前测定猪瘟弱毒疫苗的抗原效价或疫苗效力主要采用兔体定型热反应，对于规模化猪场猪瘟的防疫，该方法费事、费力，不太适合猪场对猪瘟疫苗选择的需求，因此建立一种敏感性高、特异性强的猪瘟兔化弱毒疫苗中病毒含量检测方法有实际意义。鉴于实时荧光定量ＲＴ－ＰＣＲ技术具

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通讯作者：程福亮，E-mail：cfl_0428@
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中国生物制品学杂志 2013 年 3 月第 26 卷第 3 期 Chin J Biologicals March 2013，Vol. 26 No. 3
98. 2%，while those of amplified PRRSV to ten representative PRRSV strains were 94. 1% ~ 97. 9%. Conclusion A multi－ plex RT-PCR method for detection of CSFV and PRRSV was successfully developed，which laid a foundation of early diag－ nosis and epidemiological investigation of classical swine fever and porcine respiratory and reproductive syndrome. Key words： Classical swine fever virus（CSFV）; Porcine respiratory and reproductive syndrome virus（PRRSV）; Multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction
中国生物制品学杂志 2013 年 3 月第 26 卷第 3 期 Chin J Biologicals March 2013，Vol. 26 No. 3
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猪瘟和猪蓝耳病病毒多重ＲＴ-ＰＣＲ检测方法的建立及初步应用宝来利来生物工程股份有限公司，山东泰安 271000
摘要：目的建立猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）和猪蓝耳病病毒（Porcine respiratory and reproductive syndrome virus，PRRSV）多重 RT-PCR 检测方法，并进行验证及初步应用。方法根据 GenBank 中登录的 CSFV 和 PRRSV 疫苗株基因组序列，分别设计针对 CSFV 和 PRRSV 的两对引物，建立多重 RT-PCR 检测方法，并进行敏感性及特异性验证。用建立的多重 RT-PCR 法检测 20 份疑似猪瘟、猪蓝耳病或混合感染病料，并与市售 RT-PCR 试剂盒的检测结果进行比较；检测病料的部分 PCR 产物测序后，与 9 株具有代表性的 CSFV 毒株和 10 株具有代表性的 PRRSV 毒株进行核苷酸序列同源性比对。结果以 CSFV 和 PRRSV 混合引物扩增，分别可扩增出 286 和 664 bp 的特异性条带。建立的多重 RT-PCR 检测方法可检出 100 倍稀释的病毒 RNA；该方法可检出 CSFV、PRRSV 及 CSFV 与 PRRSV 混合病毒，而猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastro-enteritis virus，TGEV）、猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）、猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）和猪伪狂犬病病毒（Porcine pseudorabies virus，PRV）的检测结果均为阴性；该方法检测 20 份疑似猪瘟、猪蓝耳病或混合感染病料的结果与市售 RT-PCR 试剂盒比较，灵敏度达 100%；选取的两份 CSFV 扩增片段与 9 株具有代表性的 CSFV 毒株的核苷酸序列同源性在 92. 3% ~ 98. 2%之间，扩增的 PRRSV 与 10 株具有代表性的 PRRSV 毒株的核苷酸序列同源性在 94. 1% ~ 97. 9%之间。结论成功建立了 CSFV 和 PRRSV 多重 RT-PCR 检测方法，为猪瘟和猪蓝耳病的早期诊断及流行病学调查奠定了基础。关键词：猪瘟病毒；猪蓝耳病病毒；多重逆转录聚合酶链反应
猪瘟是由黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pesti virus）的猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）［1］引起的猪高致死性烈性传染病，该病以高热稽留、全身广泛性出血、败血症、母猪繁殖障碍为主要特征［2］。猪繁殖与呼吸综合征（Porcine respiratory and reproductive syndrome，PRRS）又称猪蓝耳病，是由动脉炎病毒科（Arteriviridae）动脉炎病毒属（Arterivirus）猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRS virus，PRRSV）［3］引起的一种猪高度接触性传染病，该病以母猪发生流产、产死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔猪呼吸困难、高死亡率等为特征［4］。目前很多猪场均同时存在这两种疾病，严重影响猪的生产［。 5-6］
中图分类号： S852. 65 + 1 S851. 34 + 7. 1 ／ . 7-1 文献标识码： A 文章编号：1004-5503（2013）03-0425-05
Development and preliminary application of multiplex RT-PCR for classical swine fever virus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus
1. 2 主要试剂 rTaq DNA 聚合酶、dNTP Mixture （各 10 mmol ／ L）、DNA marker DL2000、反转录酶 M-MLV（Rnase H-）和 RNA 酶抑制剂 RNase Inhibitor 购自宝生物工程（大连）有限公司；Trizol 试剂购自上海英骏生物技术有限公司；RNA 吸附柱为北京百泰克生物技术有限公司产品；其他试剂均为国产试剂。 1. 3 引物设计及合成根据 GenBank 中登录的 CSFV（JQ411591）和 PRRSV（EF635006）疫苗株的基因组序列，应用 Primer 5. 0 软件各设计 1 对引物，见表 1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
CHEN Tian-tian，CHENG Fu-liang，LIANG Jin，SU Zhi-rui，FAN Qun-ping Shandong Baolai Bioengineering Co. Ltd.，Tai’an 271000，Shandong Province，China
Corresponding author：CHENG Fu-liang，E-mail：cfl_0428@ Abstract： Objective A multiplex RT-PCR method for detection of classical swine fever virus（CSFV）and porcine repro－ ductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）was developed，verified and preliminarily applied. Methods According to the genomic sequences of CSFV and PRRSV reported in GenBank，two specific pairs of primers were designed，based on which a multiplex RT-PCR method was developed and verified for sensitivity and specificity. Twenty suspected sam－ ples with CSFV，PRRSV or mixed infection were detected by the developed method，of which the results were compared with those by commercial RT-PCR kit. The PCR products of partial samples were sequenced，and analyzed for homolo－ gies of nucleotides to those of representative nine CSFV strains and ten PRRSV strains. Results Specific gene fragments at lengths of 664 and 286 bp respectively were amplified by RT-PCR using the mixed primers for CSFV and PRRSV. The viral RNA at a dilution of 1 ∶ 100 was detected by the developed method. The detection results of CSFV，PPRSV and mixture of the two viruses were positive，while those of porcine epidemic diarrhea virus （PEDV），transmissible gastro-en－ teritis virus（TGEV），porcine circovirus（PCV），porcine parvovirus（PPV） and porcine pseudorabies virus（PRV） were negative. Compared with that of commercial RT-PCR kit，the sensitivity of the developed method for 20 suspected sam－ ples was 100%. The homologies of nucleotides amplified CSFV to those of nine representative CSFV strains were 92. 3% ~