甲钴胺联合BMSCs移植治疗大鼠脊髓损伤的基础研究

BMSCs联合硫酸软骨素酶ABC移植修复大鼠脊髓损伤的研究目的：探究BMSCs聯合硫酸软骨素酶ABC（ChABC）移植修复大鼠脊髓损伤的研究。

方法：选取新生SD大鼠股骨、胫骨骨髓分离培养鉴定出MSCs，对贴壁培养的BMSCs进行神经诱导培养。

取成年雄性SD大鼠32只，体重200～260 g，利用大鼠T10脊髓半横断模型进行半横断，脊髓损伤模型制备完成后，随机分为对照组（A组）、BMSCs组（B组）、硫酸软骨霉素ABC注射组（C组）和硫酸软骨霉素ABC联合BMSCs移植组（D组），每组8只。

伤后1～2周采用BBB评分法评价大鼠后肢运动功能，伤后2周取材行HE染色计算损伤区面积，采用免疫荧光染色法观察BMSCs分化为功能性神经细胞的情况。

结果：统计分析1～2周后四组大鼠的BBB评分情况，D组大鼠明显高于其余三组，且差异均有统计学意义（P＜0.05），但A组、B组、C组比较差异均无统计学意义（P>0.05）；对比2周后四组大鼠的损伤区面积，D组大鼠损伤区面积明显小于A组，且差异均有统计学意义（P＜0.05），A组、B组、C组比较差异均无统计学意义（P>0.05）；通过荧光染色后对CSPG区域荧光强度的观察，四组大鼠比较差异均有统计学意义（P＜0.05），GFAP/GAP方面D组明显大于A、B、C三组，四组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。

结论：采用BMSCs联合硫酸软骨霉素ABC可促进神经纤维再生，对大鼠脊髓损伤修复有一定促进作用。

脊髓損伤的修复一直是临床的一道难题，脊髓损伤形成的机械性障碍以及其内部化学成分所导致的化学屏障共同阻碍了中枢神经轴突的生长[1-2]。

BMSCs 取材简便、排异反应不明显，具有多项分化的潜能，是脊髓损伤细胞治疗较为理想的种子细胞[3]。

硫酸软骨素酶ABC可特异性降解CSPG，且不破坏其他组织结构，可对BMSCs细胞的分化提供一定的保障[4]。

故本实验采用BMSCs联合硫酸软骨霉素移植修复脊髓损伤，观察其对半横断脊髓损伤的修复作用，现报道如下。

活化小胶质细胞移植后脊髓损伤大鼠神经功能恢复及评价的开题报告一、研究背景和意义脊髓损伤是一种严重的神经系统创伤，其导致的神经功能障碍对患者的身体和心理造成严重影响。

传统的治疗方法，如手术和药物治疗，虽然能够缓解病情，但并不能彻底治愈。

近年来，干细胞移植成为了一种新的治疗方式，因为干细胞具有自我复制和分化为多种细胞类型的能力。

特别是小胶质细胞，能够分化为多种神经细胞，如星形胶质细胞、少突胶质细胞、晕细胞等。

因此，小胶质细胞移植对于脊髓损伤的恢复具有很大的潜力。

有关小胶质细胞移植治疗脊髓损伤的研究已经进行了一些实验室和临床试验，但还需要更多的研究来验证该治疗方法的有效性和安全性。

因此，本研究旨在探究活化小胶质细胞移植后脊髓损伤大鼠神经功能恢复及评价，旨在为临床应用该治疗方法提供科学依据。

二、研究内容和方法本研究将采用脊髓损伤大鼠模型，将活化小胶质细胞移植到损伤部位。

研究内容包括：1.观察小胶质细胞移植对于脊髓损伤大鼠运动和感觉功能的影响。

2.评价小胶质细胞移植对于脊髓损伤大鼠神经细胞生长和调节因子的影响，如神经元生长因子、乙酰胆碱酯酶等。

3.观察小胶质细胞移植对于脊髓损伤大鼠炎症反应的影响，如炎性细胞浸润、细胞因子表达等。

4.评价小胶质细胞移植对于脊髓损伤大鼠的安全性，如细胞治疗相关的副作用等。

三、研究意义和预期结果本研究对于小胶质细胞移植治疗脊髓损伤的有效性、安全性和作用机制的研究具有重要意义。

该研究预期结果如下：1.小胶质细胞移植能够改善脊髓损伤大鼠的神经功能，包括运动和感觉功能的恢复。

2.小胶质细胞移植能够促进脊髓损伤大鼠神经细胞的生长和分化，可能通过释放神经生长因子和调节因子来实现。

3.小胶质细胞移植对于脊髓损伤大鼠的炎症反应具有抑制作用。

4.小胶质细胞移植对于脊髓损伤大鼠的安全性良好，没有明显的细胞治疗相关的副作用。

本研究的结果将有望为小胶质细胞移植治疗脊髓损伤提供科学证据，为该治疗方法的临床应用提供理论和实践指导。

TSP-1修饰的BMSCs促进脊髓损伤大鼠功能康复的机制研究的开题报告一、研究背景和意义脊髓损伤是一种严重影响生活质量和生命安全的神经系统疾病，治疗一直备受关注。

骨髓间充质干细胞（BMSCs）因具有自我更新和多向分化的能力而在治疗脊髓损伤中被广泛应用。

然而，移植后的BMSCs在脊髓损伤局部存活率低、分化程度不明确，并且治疗效果有限。

因此，探索改善BMSCs移植治疗效果的方法具有重要的临床意义。

研究发现，BMSCs在其外泌体中含有许多细胞因子和生长因子，通过外泌体介导的跨膜信号传递作用参与了治疗脊髓损伤的过程。

而外泌体膜表面的分子组成对外泌体功能具有重要的影响。

曾有研究报道，BMSCs表面的TSP-1能够促进其移植后在脊髓损伤局部的存活率和修复效果。

因此，深入研究TSP-1与BMSCs移植治疗脊髓损伤的关系，探究其作用机制，对于寻找更有效的治疗手段具有重要意义。

二、研究内容1.构建TSP-1修饰的BMSCs：从SD大鼠骨髓中提取BMSCs，通过基因工程技术将TSP-1基因导入BMSCs，构建TSP-1修饰的BMSCs。

2.动物模型制备：选择健康雄性SD大鼠，随机分为三组：模型组、BMSCs组、TSP-1/BMSCs组。

动物模型采用钳夹压迫法，制作脊髓完全断裂损伤模型。

3.评价治疗效果：自造行走评分系统，评估大鼠行动能力的恢复情况。

应用免疫荧光染色、Western blot等技术检测TSP-1修饰的BMSCs移植后在脊髓损伤局部的存活情况和分化成神经元、神经胶质细胞的情况。

三、研究意义和创新点本研究将构建TSP-1修饰的BMSCs并移植到脊髓损伤大鼠体内，探究其在治疗脊髓损伤过程中的作用机制，有以下的意义和创新点：1.探究TSP-1与BMSCs之间的相互作用关系，为寻找新的治疗脊髓损伤的途径提供理论基础和实验依据。

2.深入研究TSP-1修饰的BMSCs在治疗脊髓损伤过程中的作用机制，为探索BMSCs移植治疗脊髓损伤更有效的方案提供可行性依据。

提要随着现代交通和工矿业的发展，脊髓损伤的发病率呈上升趋势，脊髓损伤导致运动功能丧失和感觉改变，给社会和家庭造成了沉重的负担，目前，脊髓损伤尚无有效的治疗方法，其研究仍停留在实验阶段，较成功的实验方法是利用组织移植促进功能恢复，组织移植理论上具有①连接损伤的脊髓，为神经元生长穿过损伤部位提供化学及力学诱导。

②连接损伤的脊髓，提供额外的细胞修复损伤的反射弧。

③提供活性因子，挽救将死亡的神经元或调节中枢反射弧改善其功能。

为了促进功能恢复，许多种组织和细胞(雪旺氏细胞、运动神经元、背根神经节、肾上腺组织、杂交瘤、周围神经和胎儿脊髓组织)已被应用到成年哺乳动物脊髓[1]。

本文探讨了大鼠自体坐骨神经移植修复脊髓损伤的可行性，将63只雌性Wistar大鼠（实验中死亡5只）随机分为二组，实验组：采用显微外科技术，逐一将53只（死亡3只）大鼠的脊髓于T13水平切除左半侧脊髓10mm，再把右侧坐骨神经10mm移植到脊髓缺损处，近端接脊髓，远端接马尾，分别于术后进行光镜及电镜观察移植处坐骨神经、吻合口远端马尾神经、左后肢坐骨神经再生情况，并用摄像机记录患肢功能恢复情况。

对照组：10只（死亡2只）大鼠，于T13水平切除左半侧脊髓10mm,不移植坐骨神经，观察脊髓缺损远端马尾神经和左后肢坐骨神经变化情况。

结果显示：对照组左后肢坐骨神经的轴突及髓鞘部分崩解，密度降低，无再生轴突形成。

实验组术后4周电镜下偶见左侧移植处坐骨神经髓鞘及轴突形成，术后8周光镜及电镜下可见较多细的有髓神经纤维，22周时接近正常；同时观察到左后肢坐骨神经轴突再生，且后肢功能部分恢复，肌力达3级。

由此我们认为：大鼠脊髓损伤后有再生能力，周围神经移植修复脊髓损伤是可行的。

前言一、大鼠脊柱脊髓解剖大鼠的脊柱由57-61块脊椎骨组成，包括颈椎7、胸椎13、腰椎6、荐椎4、尾椎27-31块。

椎式如下：C7T13L6S4Cy27-31。

从脊柱全形来看，颈胸弯曲和胸腰弯曲明显，荐尾弯曲不显著[2]。

专利名称：一种促进大鼠脊髓损伤功能修复的药物及动物模型专利类型：发明专利
发明人：高山
申请号：CN201810350435.7
申请日：20180418
公开号：CN108542918A
公开日：
20180918
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于干细胞及有机化学技术领域，公开了一种促进大鼠脊髓损伤功能修复的药物及动物模型，联合不同剂量的甲基强的松龙，利用抗炎、抗凋亡的神经保护作用以及术后不同时间移植羊膜源神经干细胞，观察二者联合能否促进实验大鼠脊髓损伤后的轴突再生和功能恢复，为SCI修复探索新的治疗策略，具有重大的理论意义及广阔的临床应用前景。

本发明结合细胞移植；联合甲基强的松龙的神经保护作用和HAM‑NSCs的神经修复作用，探索SCI治疗的新策略；对探讨神经损伤修复机制提供理论基础，为临床治疗脊髓损伤修复提供可行性方案；对有效降低SCI致残率，提高脊髓损伤患者生活质量，具有广阔的临床应用价值。

申请人：上海市奉贤区中心医院
地址：201400 上海市奉贤区南桥镇南奉公路6600号
国籍：CN
代理机构：北京国坤专利代理事务所(普通合伙)
代理人：赵红霞
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•1364 +安徽医科大学学报"'012018 Sep;5&(9)网络出版时间：2018 - 8-2 09:39 网络出版地址：/kcms/detail/34. 1065. R.20180731. 1310. 009. html ApoJ基因修饰的BMSCs移植对脑出血大鼠C3表达的影响刘茂春\刘亮2，普娟3，陈慧3，徐斌2，刘学良2，郑晓梅3摘要目的探讨载脂蛋白J(Ap〇J)基因修饰的骨髓间充 质干细胞（BMSC/移植对脑出血大鼠补体3 (C3)表达的影响。

方法采用贴壁筛选法体外培养并纯化大鼠BMSC/利用脂质体介导重组质粒pEGFP-N1-A pP转染BMSC/建立 大鼠尾状核脑出血模型，随机分为ApoJ/BMSCs组、BMSC/组和NS组，每组24只，三组分别于建模后24 )在脑出血部位移植等体积转染A pP基因的BMSC/悬液、BMSC/悬液、生理盐水，各组再根据移植后喂养时间不同分为1、3、5、7 d4个亚组，每亚组6只。

采用RT-PCR法和免疫组织化学染色 技术分别检测血肿周围脑组织C3 mRNA和蛋白质的表达情 况。

结果应用全骨髓贴壁法成功分离、培养出活性及纯度 较高的BMSC/携带A pP基因的BMSCs能够表达外源性 ApP。

RT-PCR和免疫组化结果显示，与NS组和BMSC组比 较，ApoJ/BMSCs组各时间点C3的mRNA和蛋白表达均明显降低(！<0. 05)，且BMSCs组亦低于NS组（！<0. 05)。

结论 A pP基因修饰的BMSCs能明显下调C3的表达，证实ApP对脑出血的神经保护作用是通过抑制补体激活而实现的。

关键词载脂蛋白J;骨髓间充质干细胞;脑出血;补体3中图分类号 R743. 34文献标志码A文章编号1000 -1492(2018)09 -1364 -06 doi：10. 19405/ki.issn1000 - 1492. 2018. 09. 009脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH)是指原 发性非外伤性脑实质出血，是急性脑血管病中的危 重类型，严重威胁着人类的健康，且至今缺乏决定性 的治疗策略，目前对脑出血治疗的探索仍是研究的 热点与难点[1]。

论著 ＢＭＳＣｓ移植联合应用Ｇ－ＣＳＦ对放射性脊髓损伤凋亡因子表达的影响佟旭㊀陈颖㊀张拓㊀刘颖㊀徐倩倩㊀刘彦章㊀毕红霞㊀罗福申㊀张娜ʌ摘要ɔ㊀目的㊀探讨骨髓间充质干细胞(ＢＭＳＣｓ)移植联合应用粒细胞集落刺激因子(Ｇ－ＣＳＦ)对放射性脊髓损伤中凋亡因子Ｂａｘ㊁Ｂｃｌ－２㊁Ｃａｓｐａｓｅ－３表达的影响ꎮ方法㊀采用全骨髓贴壁法进行体外分离㊁培养骨髓间充质干细胞ꎮ根据实验要求将４５只大鼠随机分为３组ꎬＡ组为正常对照组ꎬＢ组为放疗后脊髓损伤组ꎬＣ组为放疗后脊髓损伤移植组ꎬ每组各１５只ꎮ采用５ＭｅＶ电子线照射胸部中段脊髓ꎬ照射剂量为５Ｇｙ/次ꎬ总剂量为４０ＧｙꎮＣ组在接受照射２４ｈ后采用第三代ＢＭＳＣｓ(１０６个/ｍｌ)１ｍｌ联合Ｇ－ＣＳＦ尾部静脉注射治疗每周１次ꎮ放疗结束２０周后ꎬ取各组大鼠脊髓组织行ＨＥ染色ꎬ在光镜和透射电镜观察脊髓组织的形态学变化ꎬ免疫组化检测Ｂａｘ㊁Ｂｃｌ－２和Ｃａｓｐａｓｅ－３蛋白表达水平ꎬ应用流式检测其凋亡水平ꎮ结果㊀ＨＥ染色照射组神经元消失ꎬ髓鞘脱落ꎬ细胞核固缩ꎬ部分核消失ꎮ治疗组有小部分神经元ꎬ核结构不清楚ꎬ髓鞘脱落不明显ꎮ电镜结果在微形态上比较ꎬ治疗组比照射组有明显改善和好转ꎮ免疫组化结果表明照射组表达的Ｂａｘ和Ｃａｓｐａｓｅ－３阳性细胞增加ꎬ治疗组表达的Ｂｃｌ－２阳性细胞增加(Ｐ<０.０５)ꎮ流式凋亡检测表明治疗组的细胞凋亡率显著低于照射组(Ｐ<０.０５)ꎮ结论㊀放射性脊髓损伤的大鼠采用ＢＭＳＣＳ移植联合应用Ｇ－ＣＳＦ治疗ꎬ可以抑制Ｃａｓｐａｓｅ－３㊁Ｂａｘ的表达ꎬ上调Ｂｃｌ－２表达ꎬ具有抗细胞凋亡作用ꎮʌ关键词ɔ㊀骨髓间充质干细胞ꎻ㊀Ｇ－ＣＳＦꎻ㊀放射性脊髓损伤ꎻ㊀Ｂａｘꎻ㊀Ｂｃｌ－２ꎻ㊀Ｃａｓｐａｓｅ－３[中图分类号]Ｒ６５１.２㊀[文献标识码]Ａ㊀ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００２－１２５６.２０１９.２２.００１ＴｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆＢＭＳＣｓｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈＧ－ＣＦＳｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｐｏｐｔｏｔｉｃｆａｃｔｏｒｓｉｎｒａｄｉａｔｉｏｎｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｎｊｕｒｙ㊀ＴＯＮＧＸｕ.㊀ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙꎬｔｈｅｔｈｉｒｄａｆｆｉｌｉａｔｅｄｈｏｓｐｉｔａｌｏｆＱｉｑｉｈａｒＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅꎬＱｉｑｉｈａｒꎬＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇꎬ１６１０００ꎬＣｈｉｎａ.ʌＡｂｓｔｒａｃｔɔ㊀Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ(ＢＭＳＣｓ)ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ(Ｇ－ＣＳＦ)ｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｐｏｐｔｏｔｉｃｆａｃｔｏｒｓＢａｘꎬｂｃｌ－２ａｎｄｃａｓｐａｓｅ－３ｉｎｒａｄｉａｔｉｏｎｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｎｊｕｒｙ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｃｕｌｔｕｒｅｄｂｙｗｈｏｌｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗａｄｈｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｉｎｖｉｔｒｏ.Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓꎬ４５ｒａｔｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ３ｇｒｏｕｐｓꎬ１５ｒａｔｓｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐꎬｇｒｏｕｐＡｗａｓｔｈｅｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐꎬｇｒｏｕｐＢｗａｓｔｈｅｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｎｊｕｒｙｇｒｏｕｐａｆｔｅｒｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙꎬａｎｄｇｒｏｕｐＣｗａｓｔｈｅｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｎｊｕｒｙｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｇｒｏｕｐａｆｔｅｒｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ.Ｔｈｅｍｉｄ－ｔｈｏｒａｃｉｃｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｗａｓｉｒｒａｄｉａｔｅｄｂｙ５ＭｅＶｅｌｅｃｔｒｏｎｒａｙａｔａｄｏｓｅｏｆ５Ｇｙ/ｔｉｍｅａｎｄａｔｏｔａｌｄｏｓｅｏｆ４０Ｇｙ.ＧｒｏｕｐＣｗａｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ１ｍｌｏｆｔｈｉｒｄ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎＢＭＳＣｓ(１０６/ｍｌ)ｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈＧ－ＣＳＦｏｎｃｅａｗｅｅｋａｆｔｅｒｅｘｐｏｓｕｒｅｆｏｒ２４ｈ.ＴｗｅｎｔｙｗｅｅｋｓａｆｔｅｒｔｈｅｅｎｄｏｆｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙꎬｔｈｅｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｔｉｓｓｕｅｓｏｆｅａｃｈｇｒｏｕｐｗｅｒｅｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈＨＥꎬａｎｄｔｈｅｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｔｈｅｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｔｉｓｓｕｅｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｕｎｄｅｒｌｉｇｈｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅａｎｄｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ.ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＢａｘꎬｂｃｌ－２ａｎｄｃａｓｐａｓｅ－３ｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬａｎｄｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｌｅｖｅｌｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀ＩｎｔｈｅｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎｇｒｏｕｐＨＥｄｙｅｄｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｎｅｕｒｏｎｓｄｉｓａｐｐｅａｒｅｄꎬｍｙｅｌｉｎｓｈｅｄꎬｓｏｍｅｎｕｃｌｅｕｓｐｙｃｎｏｓｉｓａｎｄｄｉｓａｐｐｅａｒｅｄ.Ｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐꎬａｓｍａｌｌｎｕｍｂｅｒｏｆｎｅｕｒｏｎｓｗｉｔｈｕｎｃｌｅａｒｎｕｃｌｅａｒｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｍｙｅｌｉｎｓｈｅｄ.Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｍｉｃｒｏｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｂｙｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｐｅｒｆｏｒｍｅｄｏｂｖｉｏｕｓｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔａｎｄｂｅｔｔｅｒｔｈａｎｔｈｅｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎｇｒｏｕｐ.ＩｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｎｕｍｂｅｒｏｆＢａｘａｎｄＣａｓｐａｓｅ－３ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌｓｏｆｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎｇｒｏｕｐｉｎｃｒｅａｓｅｄꎬａｎｄＢｃｌ－２ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｅｌｌｓｏｆｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｉｎｃｒｅａｓｅｄ(Ｐ<０.０５).Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅａｐｏｐｔｏｓｉｓｒａｔｅｏｆｔｒｅａｔｍｅｎｔｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎｇｒｏｕｐ(Ｐ<０.０５).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ㊀ＴｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＢＭＳＣＳｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈＧ－ＣＳＦｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｎｒａｔｓｗｉｔｈｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｎｊｕｒｙｃｏｕｌｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃａｓｐａｓｅ－３ａｎｄＢＡＸꎬｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｂｃｌ－２ａｎｄｈａｖｅａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃｅｆｆｅｃｔ.ʌＫｅｙｗｏｒｄｓɔ㊀Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓꎻ㊀Ｇ－ＣＳＦꎻ㊀Ｒａｄｉａｔｉｏｎｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｉｎｊｕｒｙꎻ㊀ＢＡＸꎻＢＣＬ－２ꎻ㊀ＣＡＳＰＡＳＥ３㊀㊀基金项目:黑龙江省教育厅科学技术研究项目(１２５４１９１９)㊀㊀作者单位:１６１０００黑龙江齐齐哈尔ꎬ齐齐哈尔医学院附属第三医院放疗科(佟旭㊁陈颖㊁张拓㊁徐倩倩㊁刘彦章㊁罗福申㊁张娜)ꎬ齐齐哈尔医学院附属第三医院肿瘤二科(刘颖)ꎬ齐齐哈尔医学院纪委监察处(毕红霞)㊀㊀通信作者:佟旭ꎬＥｍａｉｌ:ｃｎ＿ｔｏｎｇｘｕ＠１６３.ｃｏｍ㊀㊀放射性脊髓炎是指脊髓组织受到放射线照射ꎬ并在多种因素联合作用下使神经元发生不可逆的变性㊁坏死㊁神经脱髓鞘及细胞凋亡ꎮ脊髓损伤治疗的方法很多ꎬ近年来应用间充质干细胞移植修复脊髓损伤成为研究热点之一ꎬ但是目前关于骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤多局限在急性外伤性模型研究ꎬ应用在放射性脊髓损伤的报道较少ꎬ还有待进一步研究ꎮ骨髓间充质干细胞(ＢＭＳＣｓ)具有自我修复㊁自我更新和多向分化潜能ꎬ不同诱导条件下ꎬ具有向中胚层和神经外胚层组织分化的能力ꎮ已有实验证明ＢＭＳＣｓ在一定条件下可以诱导分化成为神经样细胞和神经胶质细胞[１－２]ꎮ且ＢＭＳＣｓ还能分泌血管内皮生长因子和神经生长因子等细胞因子ꎬ通过调节星型胶质细胞及其他胶质细胞反应抑制瘢痕形成ꎬ有助于神经组织的修复ꎮＢＭＳＣｓ不仅在骨髓组织中含量丰富ꎬ同时还存在于外周血㊁肝脏等组织中ꎬ因易于获取ꎬ已被应用治疗阿尔兹海默症㊁肌萎缩侧索硬化症等神经系统疾病[３]ꎮ粒细胞集落刺激因子(Ｇ－ＣＳＦ)是一类低分子糖蛋白ꎬ在临床上广泛应用于造血系统疾病ꎬ也是一种造血系统强有力的动员剂ꎬ在干细胞移植领域中对干细胞的释放㊁动员㊁促进迁移㊁诱导分化等方面具有重要作用[４]ꎮ大多数的辐射损伤中ꎬ都会保留部分骨髓ꎬ通过使用细胞因子刺激患者自身骨髓恢复是一种潜在的有效对策ꎬＧ－ＣＳＦ已在化疗患者和至少１５次放疗损伤中使用ꎬＧ－ＣＳＦ能与目标组织细胞表面受体结合ꎬ激活信号ꎬ促进髓系细胞的增殖㊁成熟和活化[５]ꎮ因此ꎬ本实验旨在研究骨髓间充质干细胞移植联合Ｇ－ＣＳＦ应用于放射性脊髓损伤中对凋亡因子Ｂａｘ㊁Ｂｃｌ－２㊁Ｃａｓｐａｓｅ－３表达的影响ꎮ一㊁材料与方法１.材料及设备:实验所用ＳＤ大鼠均由哈尔滨医科大学实验动物中心提供ꎬ体重(２００ʃ２０)ｇꎬ相同条件下饲养ꎮＤＭＥＭ/Ｆ１２培养基(ＨｙＣｌｏｎｅ)㊁胎牛血清(杭州四季青)ꎻ胰蛋白酶㊁青霉素㊁链霉素(碧云天)㊁ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＦＩＴＣ(Ｖａｚｙｍｅ)ꎻＶＳ－１３００Ｌ－Ｕ型净化工作台(苏净安泰)ꎻＣＯ２培养箱(Ｔｈｅｒｍｏ)ꎻ倒置相差显微镜(Ｏｌｙｍｐｕｓ)ꎬ多聚甲醛(上海溶剂厂)ꎬ苏木精(上海标本模型厂)ꎬ伊红(北京化工厂)ꎬ２.５％戊二醛(天津市福晨化学试剂厂)ꎬ１％四氧化饿(Ｓｉｇｍａ公司)ꎬＥｐｏｎ８１２包埋液(美国ＳＥＲＶＡ公司)ꎬＣａｓｐａｓｅ－３一抗㊁ｂａｘ一抗和ｂｃｌ－２一抗(武汉博士德)㊁ＳＰ－９００１㊁ＳＰ－９００２和浓缩型ＤＡＢ试剂盒(武汉博士德)ꎬＢＭＤ－１型模拟定位机(北京医疗器械研究所)ꎬＰｒｉｍｕｓ医用直线加速器(德国西门子公司)ꎬ光学显微镜(日本ＯＬＹＭＰＵＳ)ꎬＫＬＢ－Ｖ型超薄切片机(瑞典ＫＬＢ公司)ꎬＪＥＭ－３０００ＥＸ透射电子显微镜(日本电子株式会社)ꎬ流式细胞仪(ＢＤ)等ꎮ２.ＢＭＳＣＳ体外培养与鉴定:取４周龄ＳＤ大鼠ꎬ采用全骨髓贴壁法ꎬ颈椎脱臼法处死大鼠ꎬ浸泡在７５％乙醇中消毒１０分钟ꎬ在无菌条件下分离ＳＤ大鼠肱骨㊁股骨和胫骨ꎬ用ＰＢＳ缓冲液冲出骨髓ꎬ反复吹打成骨髓单细胞悬液ꎬ离心后接种于含１０％胎牛血清(ＦＢＳ)的Ｌ－ＤＭＥＭ培养基中ꎬ按２ˑ１０６/Ｃ时密度接种于培养瓶中ꎬ置于孵箱中培养ꎮ４８小时后半量换液ꎬ第五天全量换液ꎬ待细胞生长至８０％~９０％融合时ꎬ０.２５％胰酶消化传代ꎮ倒置显微镜观察细胞形态ꎬ流式细胞仪检测细胞表面抗原ＣＤ３４㊁ＣＤ４４㊁ＣＤ４５和ＣＤ９０的表达ꎬ进行细胞鉴定ꎬ从而为本实验提供大量的同种异基因大鼠骨髓间充质干细胞ꎮ３.放射性脊髓损伤模型的建立[６]:将４５只ＳＤ大鼠随机分为三组ꎬ每组各１５只ꎮＡ组为正常对照组ꎬＢ组为放疗后脊髓损伤组ꎬＣ组为放射后脊髓损伤移植组ꎮ用自制的固定装置固定大鼠ꎬ在模拟定位机下拍正位片和侧位Ｘ光片ꎬ检测脊髓的深度(１ｃｍ)ꎬ同时确定胸段照射范围ꎬ左右宽度包括整个椎体ꎬ射野大小为２ｃｍˑ４ｃｍꎬ在照射野附近剪去鼠毛ꎬ用放疗科专用药水在大鼠照射野中心做标记ꎬ使每次照射都能重复相同的照射范围ꎬ采用６ＭｅＶ电子线照射ꎬ每次照射剂量为５Ｇｙꎬ根据脊髓的深度换算出６ＭｅＶ照射时的跳数ꎬ剂量率为３００ｃＧｙ/ｍｉｎꎬ源皮距(ＳＳＤ)技术照射ꎬＳＳＤ＝１００ｃｍꎬ隔日一次ꎬ共８次ꎬ照射总剂量为４０Ｇｙꎮ４.ＢＭＳＣｓ移植及注射Ｇ－ＣＳＦ:Ｃ组大鼠在接受照射完成２４小时后每周进行尾静脉注射间充质干细胞３ˑ１０６/只ꎬ在移植同时注射Ｇ－ＣＳＦꎮ５.观察各组脊髓组织形态学变化:放疗结束后２０周将目标大鼠处死ꎬ取三组大鼠脊髓组织经固定㊁脱水㊁包埋㊁切片㊁行ＨＥ染色后在光镜与透射电镜下观察三组脊髓组织的形态学变化ꎮ６.免疫组化染色法检测各组Ｃａｓｐａｓｅ－３㊁Ｂａｘ㊁Ｂｃｌ－２的表达:按试剂盒说明书操作ꎬ每组制作每种切片各６张ꎬ每张切片于４０ˑ１０倍镜下随机取５个视野ꎬｍｉｇａｅ－ｏｒ－ｐｌｕｓ生物学图像分析系统进行图像分析ꎬ在４０ˑ１０倍镜下观察凋亡相关蛋白Ｃａｓｐａｓｅ－３㊁Ｂａｘ㊁Ｂｃｌ－２的免疫组化结果ꎮ７.凋亡的流式细胞检测:取被照射大鼠脊髓组织细胞ꎬ１.２５％胰酶消化液收集ꎬ用Ａｎｎｅｘｉｎ/ＰＩ凋亡检测试剂盒(ＢｅｎｄｅｒＭｅｄｓｙｓｔｅｍｓ)按说明标记细胞ꎬ流式细胞仪检测１０００个细胞ꎬ计算凋亡率ꎬ比较各组间差异ꎮ８.统计学处理:采用ＳＰＳＳ１３.０统计软件进行数据分析ꎬ结果用均值ʃ标准差( ｘʃｓ)表示ꎬ进行组间比较分析ꎬＰ<０.０５为差异具有统计学意义ꎮ二㊁结果１.ＢＭＳＣｓ体外培养的形态学观察:原代培养:刚接种的骨髓细胞呈圆形ꎬ大小不一ꎬ悬浮于培养液中ꎮ换液后ꎬ部分细胞贴壁生长ꎬ呈短梭形㊁纺锤形或多角形ꎬ胞浆丰富ꎬ细胞核大㊁核仁清楚ꎬ细胞集落呈鱼群状或放射状排列ꎬ少数细胞集落漩涡中心细胞呈多层分布ꎬ细胞界限不清(图１和图２)ꎮ传代培养(图３㊁图４㊁图５):细胞形态大致相同ꎬ梭形㊁长形细胞为主ꎬ呈螺旋样排列ꎬ细胞生长旺盛ꎮ第３代细胞开始可见梭形㊁长形细胞为主ꎬ同向排列ꎬ呈漩涡样生长ꎬ球形细胞明显减少ꎮ流式细胞仪检测ＣＤ４４㊁ＣＤ９０呈阳性结果ꎻＣＤ３４㊁ＣＤ４５呈阴性结果(图６)ꎮ结果表明培养的ＢＭＳＣｓ可以为本实验提供大量的同种异基因大鼠骨髓间充质干细胞ꎮ图６㊀ＳＤ大鼠第三代ＢＭＳＣｓ表面抗原的检测㊀㊀２.光镜下观察各组脊髓组织:在光学显微镜下ꎬＡ组中脊髓灰质㊁白质结构清晰ꎬ神经元细胞核完整ꎬ神经细胞形态正常(图７)ꎻＢ组:脊髓灰质㊁白质界限不清ꎬ神经纤维排列凌乱ꎬ部分细胞肿胀及空泡样变性ꎬ细胞数量显著减少(图８)ꎻＣ组:脊髓组织形态明显改善ꎬ灰质㊁白质结构清晰ꎬ神经细胞数量明显增多(图９)ꎮ㊀㊀３.电镜下观察各组脊髓组织:Ａ组中正常组脊髓髓鞘结构排列紧密有序ꎬ少突胶质细胞颜色正常ꎬ突触间隙和突触小泡正常ꎬ所有细胞没有固缩也没有细胞核密度加大(图１０)ꎻＢ组中髓鞘板层结构水肿粘连ꎬ模糊ꎬ少突胶质细胞周围颜色加深ꎬ突触间隙消失ꎬ突触小泡数量没变ꎬ神经胶质细胞发生核固缩(图１１)ꎻＣ组髓鞘稍好ꎬ小髓鞘好ꎬ仅次于正常组ꎬ轴索里的线粒体多ꎬ不肿胀ꎬ神经元减少ꎬ核膜和高尔基体固缩减轻ꎬ突触小泡多了ꎬ但是结构没有正常组好ꎬ少突特别多ꎬ修复增强(图１２)ꎮ㊀㊀４.免疫组化检测结果:免疫组化检测各实验组中ＳＤ大鼠脊髓组织中Ｂａｘ㊁Ｂｃｌ－２和Ｃａｓｐａｓｅ－３的阳性细胞表达数量ꎬ比较单位面积(ｍｍ２)中的阳性细胞的表达ꎬ如表１所示ꎮＣ组神经细胞中Ｂａｘ㊁Ｂｃｌ－２和Ｃａｓｐａｓｅ－３很少表达ꎬＢ组Ｂａｘ㊁Ｂｃｌ－２和Ｃａｓｐａｓｅ－３阳性细胞表达明显上升ꎮ单纯照射与治疗组比较ꎬＢａｘ㊁Ｂｃｌ－２和Ｃａｓｐａｓｅ－３阳性细胞过表达(Ｐ<０.０５)ꎮ表１㊀Ｂａｘ㊁Ｂｃｌ－２ａｎｄＣａｓｐａｓｅ－３阳性细胞数量(ｘʃｓꎬｎ/ｍｍ２)组别ＢａｘＢｃｌ－２Ｃａｓｐａｓｅ－３治疗组４.３００ʃ１.５７３.４６８ʃ１.２５３.０００ʃ１.０６照射组１３.０００ʃ１.００∗１０.７５０ʃ３.７６∗９.８００ʃ４.６５∗㊀㊀注:与对照组比较ꎬ∗Ｐ<０.０５㊀㊀５.流式细胞凋亡检测结果:ＡｎｎｅｘｉｎＶ/ＰＩ法检出的放射性脊髓损伤模型组的细胞凋亡率显著高于正常组和治疗组(Ｐ<０.０５)ꎮ见图１３~图１６ꎮ图１６　细胞凋亡率㊀㊀讨论㊀放射性脊髓损伤在乳腺恶性肿瘤㊁肺恶性肿瘤等放射治疗中是严重的放疗并发症ꎮ脊髓损伤是一种高致残率的中枢神经系统损伤ꎬ可造成脊髓神经细胞死亡和胶质瘢痕形成ꎬ出现运动㊁感觉及自主神经功能障碍及神经痛等[７]ꎮ放射性的脊髓损伤一旦发生ꎬ其不可逆的病理过程是治疗中最突出的问题ꎬ随着近年来关于干细胞技术和神经生物学的发展ꎬ可以通过移植神经干细胞㊁骨髓间充质干细胞㊁胚胎干细胞等增加脊髓神经细胞数量㊁减少神经元的变性坏死和细胞凋亡ꎮＢＭＳＣｓ是一类具有自我更新能力的多潜能干细胞ꎬ是目前比较理想的ＳＣＩ细胞移植的供体细胞ꎮＢＭＳＣｓ移植后可以抑制细胞的凋亡ꎮ细胞凋亡是脊髓损伤继发性损伤的重要形式之一ꎬ受多种凋亡相关蛋白的调控ꎮ其中最受重视的调控细胞凋亡的基因家族是ｂｃｌ－２基因家族及其相关蛋白ꎮＢｃｌ－２家族成员已有１５种之多ꎬ主要包括Ｂｃｌ－２㊁Ｂｃｌ－ｘｌ㊁Ｂａｘ㊁Ｂａｋ㊁Ｂａｃ㊁Ｂｉｋ和Ｂｉｄꎬ其中Ｂｃｌ－２和Ｂｃｌ－ｘｌ是主要的抗凋亡因子[８]ꎮＢｃｌ－２的主要生物学功能是延长细胞寿命ꎬ增加细胞对各种凋亡刺激因素的抵抗力ꎬ在坏死的刺激下ꎬｂａｘ和ｂａｋ促进细胞色素ｃ从线粒体中释放ꎬ通过线粒体凋亡诱导通道(ＭＡＣ)的形成激活Ｃａｓｐａｓｅ和触发凋亡ꎬＢｃｌ－２主要作用于Ｃａｓｐａｓｅ－３的上游ꎬ通过各种下游因子间接抑制Ｃａｓｐａｓｅ－３激活ꎬ从而发挥抑制细胞凋亡的作用ꎬＢｃｌ－２和Ｂｃｌ－ｘｌ通过结合ｂａｘ和ｂａｋ抑制ＭＡＣ的形成ꎬ保护细胞不凋亡[９￣１０]ꎮＧ－ＣＳＦ在体内可以发挥抑制肿瘤细胞凋亡或诱导血管生成等作用ꎬ参与肿瘤的发生㊁发展过程ꎬ目前临床已将应用Ｇ－ＣＳＦ作为肿瘤治疗过程中的重要辅助用药ꎮ研究表明ꎬＧ－ＣＳＦ能动员骨髓和外周血中ＭＣＳｃꎬ使骨髓和外周血中ＭＳＣｓ的数量显著增多[１１￣１３]ꎮ考虑ＢＭＳＣｓ移植和Ｇ－ＣＳＦ联用有协同作用ꎬ可以加强ＢＭＳＣｓ移植对放射性脊髓损伤的修复作用ꎮ本实验结果显示ꎬ脊髓出现放射性损伤后ꎬ凋亡基因ｂａｘ和Ｃａｓｐａｓｅ－３出现明显过表达ꎬ说明二者有一定的相关性ꎮ而在应用ＢＭＳＣｓ移植和Ｇ－ＣＳＦ后ꎬ与放疗后脊髓损伤组相比ｂａｘ和Ｃａｓｐａｓｅ－３的阳性表达明显降低ꎬＢｃｌ－２的阳性表达明显增高ꎮ说明放射性脊髓损伤的大鼠采用ＢＭＳＣＳ移植联合应用Ｇ－ＣＳＦ治疗后ꎬ可以抑制Ｃａｓｐａｓｅ－３㊁ＢＡＸ的表达ꎬ上调Ｂｃｌ－２表达ꎬ具有抗细胞凋亡作用ꎬ能够增加治疗的效果ꎮ但其作用机理还需要进一步研究ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀ＬｅｉＺꎬＹｏｎｇｄａＬꎬＪｕｎＭꎬｅｌａｌ.Ｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｎｅｕｒａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｒａｔｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏ[Ｊ].ＣｅｌｌＢｉｏｌＩｎｔꎬ２００７ꎬ３１(９):９１６￣９２３.[２]㊀ＣｈｏｉＣＢꎬＣｈｏＹＫꎬＰｒａｋａｓｈＫＶꎬｅｔａｌ.Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｎｅｕｒｏｎ－ｌｉｋｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＲｅｓＣｏｍｍｕｎꎬ２００６ꎬ３５０(１):１３８￣１４６. [３]㊀ＮｅｉｒｉｎｃｋｘＶꎬＣｏｓｔｅＣꎬＲｏｇｉｓｔｅｒＢꎬｅｔａｌ.Ｃｏｎｃｉｓｅｒｅｖｉｅｗ:ａｄｕｌｔｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓꎬａｄｕｌｔｎｅｕｒａｌｃｒｅｓｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓꎬａｎｄｔｈｅｒａｐｙｏｆｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｓ:ａｓｔａｔｅｏｆｐｌａｙ[Ｊ].ＳｔｅｍＣｅｌｌｓＴｒａｎｓｌＭｅｄꎬ２０１３ꎬ２(４):２８４￣２９６.[４]㊀ＳａｔａｋｅＫꎬＬｏｕＪꎬＬｅｎｋｅＬＧ.Ｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｔｈｒｏｕｇｈｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌｆｌｕｉｄｉｎｔｏｉｎｊｕｒｅｄｓｐｉｎａｌｃｏｒｄｔｉｓｓｕｅ[Ｊ].Ｓｐｉｎｅꎬ２００４ꎬ２９(１８):１９７１￣１９７９.[５]㊀ＲｅｅｖｅｓＧ.ＯｖｅｒｖｉｅｗｏｆｕｓｅｏｆＣ－ＣＳＦａｎｄＧＭ－ＣＳＦｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆａｃｕｔｅｒａｄｉａｔｉｏｎｉｎｊｕｒｙ[Ｊ].ＨｅａｌｔｈＰｈｙｓꎬ２０１４ꎬ１０６(６):６９９￣７０３. [６]㊀邹丽娟ꎬ王媛媛ꎬ于丽君ꎬ等.Ｃａｓｐａｓｅ－３和Ｂａｘ在放射性脊髓损伤大鼠的表达[Ｊ].解剖科学进展ꎬ２００８ꎬ１４(４):３６１￣３６４ꎬ３６８. [７]㊀杨利强ꎬ张彭跃.Ａｇｒｉｎ在神经系统损伤后修复中的作用[Ｊ].中国病理生理杂志ꎬ２０１６ꎬ３２(６):１１４２￣１１４６.[８]㊀王力俭ꎬ田可川ꎬ吴伟伟ꎬ等.细胞凋亡信号传导通路的研究进展[Ｊ].中国畜牧兽医(遗传繁育)ꎬ２０１１ꎬ３８(１０):１３２￣１３４. [９]㊀ＺｈｅｎｇＪꎬＶｉａｃａｖａＦＡꎬＫｒｉｗａｃｋｉＲＷꎬｅｔａｌ.ＤｉｓｃｏｖｅｒｉｅｓａｎｄＣｏｎｔｒｏｖｅｒｓｉｅｓｉｎＢＣＬ－２Ｐｒｏｔｅｉｎｓ－ＭｅｄｉａｔｅｄＡｐｏｐｔｏｓｉｓ[Ｊ].ＦＥＢＳＪꎬ２０１６ꎬ２８３(１４):２６９０.[１０]㊀ＹａｎｇＤꎬＯｋａｍｕｒａＨꎬＴｅｒａｍａｃｈｉＪꎬｅｔａｌ.ＨｉｓｔｏｎｅｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅＪｍｊｄ３ｒｅｇｕｌａｔｅｓｏｓｔｅｏｂｌａｓｔａｐｏｐｔｏｓｉｓｔｈｒｏｕｇｈｔａｒｇｅｔｉｎｇａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎＢｃｌ－２ａｎｄｐｒｏ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎＢｉｍ[Ｊ].ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａＭｏｌＣｅｌｌＲｅｓꎬ２０１６ꎬ１８６３(４):６５０￣６５９. [１１]㊀ＲｉｐａＲＳꎬＨａａｃｋ－ＳｏｒｎｓｅｎＭꎬＷａｎｇＹꎬｅｔａｌ.Ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｄｅｒｉｖｅｄｍｅｓｅｎｃｈｕｍａｌｃｅｌｌｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｂｙｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒａｆｔｅｒａｃｕｔｅｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ:ｒｅｓｕｌｔｓｆｒｏｍｔｈｅｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ(ＳＴＥＭＭＩ)ｔｒｉａｌ[Ｊ].Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎꎬ２００７ꎬ１１６:１２４￣１３０.[１２]㊀ＺｈａｎｇＣꎬＺｈａｎｇＸꎬＣｈｅｎＸＨ.Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｃｏｌｏｎｙｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ－ｍｏｂｉｌｉｚａｔｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ:ａｎｅｗｒｅｓｏｕｒｃｅｆｏｒｒａｐｉｄｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔｉｎｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ[Ｊ].ＭｅｄＨｙｐｏｔｈｅｓｅｓꎬ２０１１ꎬ７６(２):２４１￣２４３.[１３]㊀ＢｒｏｕａｒｄＮꎬＤｒｉｅｓｓｅｎＲꎬＳｈｏｒｔＢꎬｅｔａｌ.Ｇ－ＣＳＦｉｎｃｒｓａｓｅｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｐｒｅｃｕｒｓｏｒｃｅｌｌｎｕｍｂｅｒｓｉｎｔｈｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｖｉａａｎｉｎｄｉｒｅｃｔｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｎｖｏｌｖｉｎｇｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ－ｍｅｄｉａｔｅｄｂｏｎｅｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ[Ｊ].ＳｔｅｍＣｅｌｌＲｅｓꎬ２０１０ꎬ５(１):６５￣７５.(收稿日期:２０１９￣０５￣２７)(本文编辑:卜明)胰高血糖素样肽－２对小鼠急性胰腺炎相关肠炎的保护性作用及机制陈德利㊀葛思堂㊀左芦根㊀孔令尚㊀刘牧林㊀郝博ʌ摘要ɔ㊀目的㊀采用小鼠动物模型探究胰高血糖素样肽－２(ｇｌｕｃａｇｏｎｌｉｋｅｐｅｐｔｉｄｅ－２ꎬＧＬＰ－２)对急性胰腺炎相关肠炎的保护性作用及机制ꎮ方法㊀将总数为４０只的雄性实验小鼠ꎬ严格按照随机分配原则ꎬ分为对照模型组即胰腺炎组及ＧＬＰ－２治疗组两组ꎬ每组各２０只ꎮ通过腹腔内注射Ｌ－精氨酸法建立ＡＰ的模型ꎬ并在制模后３０ｍｉｎꎬＧＬＰ－２治疗组按照０.２５ｍｇ/ｋｇ的剂量通过腹腔注射ＧＬＰ－２方式进行处理ꎬ间隔时间为１２ｈꎬ连续使用３ｄꎻ而ＡＰ组模型则是使用相同剂量的生理盐水进行处理ꎮ３ｄ后对两组所有小鼠进行处死ꎬ采用Ｈ＆Ｅ㊁免疫荧光及免疫印迹法等评估检测小鼠肠道标本中炎性水平及肠粘膜细胞凋亡情况ꎻ检测ＴＮＦ－α㊁ＩＬ－１６㊁ＩＬ－１０水平ꎬ进行炎性评分ꎬ对比各组小鼠肠道炎症情况ꎮ结果㊀肠道黏膜的炎性介质水平ꎬ可见ＧＬＰ－２治疗组ＴＮＦ－α及ＩＬ－６含量绝对低于ＡＰ组小鼠(Ｐ<０.０５)ꎬＩＬ－１０的含量则较高于ＡＰ组小鼠(Ｐ<０.０５)ꎬ而治疗组肠道组织炎性评分结果则低于ＡＰ组(Ｐ<０.０５)ꎻＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测显示治疗组肠道组织细胞发生凋亡现象的量相对于对照组大为减少(Ｐ<０.０５)ꎮ结论㊀我们的研究证实ＧＬＰ－２对于急性胰腺炎小鼠相关肠炎具有一定程度的保护性作用ꎮʌ关键词ɔ㊀胰高血糖素ꎻ㊀模型小鼠ꎻ㊀急性胰腺炎ꎻ㊀肠炎[中图分类号]Ｒ３６３㊀[文献标识码]Ａ㊀ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００２－１２５６.２０１９.２２.００２㊀㊀基金项目:蚌埠医学院自然科学基金(ＢＹ０８４５)㊀㊀作者单位:２３３００４安徽蚌埠ꎬ蚌埠医学院第一附属医院胃肠外科㊀㊀通信作者:郝博ꎬＥｍａｉｌ:２１１１３８５２５３＠ｑｑ.ｃｏｍ。

BMSCs移植治疗脑出血损伤大鼠的实验研究的开题
报告
研究背景：脑出血是在脑血管破裂或破裂的情况下，导致大量血液
进入脑实质或脑腔的疾病，占中风的15-20％。

目前，大多数治疗方法仍然是对症治疗，而没有真正治愈障碍的方法。

保护和恢复受损的神经细
胞是治疗脑出血并最终恢复患者功能的关键。

近年来，成骨细胞（BMSCs）被认为是一种有前途的治疗方法。

许多研究表明，BMSCs可
以促进神经细胞再生和修复。

研究目的：本研究旨在探索BMSCs移植治疗脑出血损伤的效果和机理。

研究方法：选取50只SD大鼠，将它们分成两组：对照组和实验组。

使用腹腔注射甲醛为大鼠制造脑出血模型，一周后，将实验组大鼠脾脏
取出分离出BMSCs，并将它们注入实验组的右侧侧脑室。

对照组注入无
细胞等量生理盐水。

研究成果：使用电子显微镜对脑组织样本进行病理分析，并通过行
为学方法进行大鼠运动和神经功能评估。

预期结果：我们期望BMSCs移植治疗可以减少大鼠脑出血损伤的病理学损害并减轻神经功能障碍。

此外，我们还将研究BMSCs如何作用于
脑出血的机制，以便为治疗脑出血提供更有效的解决方案。

研究意义：本研究将为治疗脑出血损伤提供另一种治疗策略，提高
大鼠功能恢复率，为将来相关临床治疗提供实验依据。