褪黑素对大鼠急性脊髓损伤内质网应激蛋白GADD153／CHOP表
达的影响
目的探讨褪黑素（MT）对急性脊髓损伤（ASCI）大鼠模型脊髓组织GADD153/CHOP表达的影响。方法选取健康SD大鼠96只，随机分为生理盐水处理组（NS组）、乙醇处理组（ET组）及褪黑素治疗组（MT组）各32只。所有大鼠均以改良Allen法制备脊髓损伤模型；MT组在模型制备的基础上给予褪黑素治疗；ET组在模型制备的基础上给予5%乙醇处理；NS组在模型制备的基础上给予0.9%氯化钠溶液处理。分别于伤后3 h、1 d 、3 d、7 d时各取8只应用改良Tarlov评分法评价其神经功能；Tarlov评分后处死，取受损节段脊髓行HE染色及免疫组化染色，观察形态学改变和CHOP表达的特点；并应用TUNEL方法检测神经细胞凋亡情况。其量的评定借助于麦克奥迪数码医学图像分析系统A（Motic.med 6.0）软件，结果分别用累积光密度（IOD）及细胞凋亡指数（AI）来表示。结果所有实验大鼠脊髓组织均有不同程度出血、水肿、细胞凋亡及坏死。MT组Tarlov评分除3 h时间点外，其他各时间点Tarlov评分明显高于ET组及NS组，且差异有统计学意义（P 0.05）。结论MT可抑制CHOP 表达，降低脊髓细胞凋亡指数，可能为其发挥急性脊髓损伤保护作用的重要机制之一。
标签：褪黑素；急性脊髓损伤；GADD153/CHOP；细胞凋亡；药物治疗
现代研究结果显示[1]，急性脊髓损伤（actue spinal cord injury，ASCI）后存在广泛细胞凋亡现象。细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡，目前大量研究认为其对损伤后神经功能产生重要的影响[2]，是导致继发性脊髓损伤的主要原因[3]。以往认为细胞凋亡信号传导通路包括线粒体和死亡受体途径[4]。最新研究表明，内质网应激也参与了细胞凋亡，其中CHOP/GADD153（C/EBP homologous protein/growth arrest-and DNA damage inducible gene 153）是内质网应激特异的转录因子[5-6]，可由DNA生长停滞性损害诱导产生。黄怀等[7]发现内质网应激可以诱导大鼠ASCI神经细胞的凋亡，加重脊髓的损伤及神经功能障碍，该研究还发现ASCI组织CHOP表达含量的高低与ASCI的严重程度一致。CHOP又称内质网应激促凋亡蛋白，是继发性脊髓损伤发生机制的重要因素之一。褪黑素（melatonin，MT）是人体重要神经内分泌活性物之一，主要由松果体分泌，因此也称为松果体素。目前，MT对脊髓损伤的保护作用是国外研究的热点。据相关文献报道，MT对脊髓的保护作用主要通过线粒体通路或者死亡受体通路而实现，关于MT通过内质网通路发挥脊髓保护作用的文献鲜有报道。本实验旨在观察褪黑素对大鼠ASCI后脊髓组织内质网应激相关蛋白GADD153/CHOP表达的影响，探讨其对脊髓损伤的保护作用。
1 材料与方法
1.1 动物与分组
丙戊酸对大鼠急性脊髓损伤后BDNF及NT [摘要] 目的探讨丙戊酸（VPA）对脊髓损伤后脑源性神经营养因子（BDNF）和神经营养素3（NT-3）表达的影响。方法将60只雄性SD大鼠随机分为三组：对照组（C组）、损伤组（SCI组）和丙戊酸保护组（VPA组）。采用改良Allen法制作脊髓损伤动物模型。VPA组术后即刻及其后每12 h皮下注射VPA 300 mg/kg；C组和SCI组在相应时间点注射等体积的生理盐水。于伤后24、48、72 h和1周取材。利用BBB评分标准进行不同时段的行为学评分。通过免疫组化法观察各组大鼠脊髓损伤后BDNF及NT-3表达的变化。结果BBB评分显示，C 组运动功能未受影响，VPA组的BBB评分均高于SCI组，在伤后48、72 h和1周两者比较，差异有统计学意义（P [关键词] 脊髓损伤；丙戊酸；脑源性神经营养因子；神经营养素3 [中图分类号] R651.2 [文献标识码] A [":.gerenzongjie.co" ="" class="">文章编号] 1673-7210（2012）07（c）-0023-03 Effects of valproic acid on the expression of BDNF and NT-3 in rats after acute spinal cord injury LI Xinzhi Department of Anatomy and Histo-Embryology, Chengdu Medical College, Sichuang Province, Chengdu 610083, China [Abstract] Objective To investigate the effects of valproic acid (VPA) on the expression of BDNF and NT-3 in rats after acute spinal cord injury. Methods 60 adult rats were randomly divided into three groups: control group (C group), spinal cord injury group (SCI group) and VPA treatment group (VPA group). Spinal cord injury model was made by modified Allen technique. VPA (300 mg/kg) was administrated in rats through subcutaneous injection immediately after injury and repeated per 12h after injury, while C group and SCI group were received
关键词：郁证；应激；大鼠模型中图分类号：R2-332 文献标志码：B 文章编号：1004-5627（2010）03-0030－03 抑郁症是一种常见的情感障碍性精神疾病，是一种以显著而持久的心境低落为主要特征的综合征，其主要表现有情绪低落，言语减少，精神、运动迟缓，常自责自罪，甚至企图自杀等，并常伴有睡眠异常、食欲减退、体重减轻、性欲减退等躯体症状，是目前世界上最易致残的疾病之一［1］。它与中医郁证有若干相通之处，属于中医“郁证”范畴，多因情志所伤或素体偏弱，致气机失和，脏腑气血阴阳失调所致［2］。研究表明，抑郁症的发生与应激性事件有着密切关系，慢性应激可以诱导抑郁。我们采用慢性轻度应激和孤养2种经典造模结合的方式，利用长期不可预见性的轻度应激，造成动物的抑郁状态，类似中医的“郁证”，并对此模型的建立和有效性作出评价。 1材料和方法 1.1动物分组健康SD 成年大鼠，体重180～200g ，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，批号：SCXK （沪）2007、0005。用敞箱实验进行行为学评分，选择得分相近的大鼠30只，随机分为3组：①生理盐水组（正常对照组）10只，大鼠笼每笼喂养5只：②慢性轻度不可预见性应激抑郁组（模型组）10只，每笼孤养1只：③造模加百忧解组（阳性对照组）10只，每笼孤养1只。慢性轻度不可预见性的应激抑郁模型造模过程持续24d 。1.2抑郁大鼠模型的建立按照Katz ［3］248的方法略加改进，将明暗颠倒24h 、夹尾1min 、禁食24h 、禁水24h 、160Hz 摇晃5min 、30V 电压电击足底5s 、40℃环境5min 、冰水游泳8种刺激，随机安排到24d 内，每日1种刺激，每种刺激出现3 次，同种刺激不能连续出现，使动物不能预料刺激的发生。 1.3行为测定按Open-Field 法［3］248测定行为。 敞箱装置由不透明材料制成，底面为76cm ×76 cm 的正方形并被等分为25个等边方格，周围有高40cm 的墙壁。在安静的房间内进行此项试验观察，每日早晨8∶00―12∶00进行此项试验观察。将大鼠置于中心方格内，观察大鼠在5min 内穿 越格数（四爪均进入的方格方可计数，为水平运动得分），后肢直立次数（两前爪腾空或攀附墙壁）为垂直运动得分，彻底清洁敞箱后再进行下1只大鼠的观察。每周进行1次行为评分。 1.4体液消耗实验按Willner P 等的实验方 法［4］，试验前，在隔离噪音的安静房间内，训练动物适应含糖饮水，每笼同时放置2个水瓶，第1个24 h ，2瓶均装有1%蔗糖水，随后的24h ，1个瓶装1%蔗糖水，1个瓶装纯净水。24h 的禁食禁水后，进行大鼠的基础糖水／纯水消耗试验，同时给予每只大鼠事先定量好的2瓶水：1瓶为1%蔗糖水，1瓶为纯净水，计算大鼠1h 饮用1%蔗糖溶液的量。1.5统计学处理数据用x ±s 表示，用SPSS 11.5统计软件处理数据，采用t 检验，P ＜0.05为有显 著性差异。 2结果 实验结果 见表1～表4。 3讨论 3.1从中西医不同角度看，抑郁症的发生是受到 外界的不可知的慢性刺激后引发的。为了便于实验研究抗抑郁药的作用，我们需要根据其发病原因在动物身上模拟抑郁症的症状。目前本病的动物模型国内外报道较多，一般可分为应激模型、孤养或分养模型、药理学抑郁模型、脑损伤模型、操作应激模型、遗传选择性抑郁模型等［5］，其中慢性轻度不可预见性的应激（CUMS ）抑郁模型主要模拟了人类抑郁的核心症状即快感缺乏，同时模拟了其它重症抑郁障碍的症状表现，如运动能力及社会交往能力下降、探索行为能力下降、侵犯攻击 郁证的大鼠模型 王玉露1，林于雄2，陈 燕 1 （1.福建中医药大学药学院，福建福州350108；2.福建中医药大学学报编辑部，福建福州350003） 收稿日期：2010-03-13 作者简介：王玉露（1975—），女，讲师，医学硕士，主要从事药理学的研究。 Journal of Fujian University of TCM June 2010，20（3） 福建中医学院学报2010年6月第20卷第3期30
内质网应激 庄娟（江苏省淮阴师范学院生命科学学院淮安223300） 摘要内质网是真核细胞内蛋白质合成的重要场所，只有正确折叠的蛋白质才能够在内质网驻留或转运至高尔基体。如果蛋白质合成过多或不能正确折叠与运输，内质网内就会累积大量蛋白质，造成内质网应激，引发未折叠蛋白质反应。未折叠蛋白质反应主要与内质网感受器蛋白介导的信号通路有关。 关键词内质网应激未折叠蛋白质反应内质网感受器 内质网（endoplasmic reticulum，ER）是真核细胞内蛋白质合成、脂质生成和钙离子贮存的主要场所。多种蛋白需要在内质网中折叠、组装、加工、包装及向高尔基体转运，这是一个需要细胞精确调控的过程。ER 含有一种免疫球蛋白结合蛋白（immunoglobulin－bind-ing protein，BIP）和蛋白二硫键异构酶（protein disulfide isomerase，PDI），可以帮助与促进蛋白质的正确折叠。不能正确折叠的畸形肽链或未组装成寡聚体的蛋白质亚单位，无论是在内质网腔内还是在内质网膜上，一般不能进入高尔基体，主要通过泛素依赖性降解途径被蛋白酶体所降解。当内质网中未折叠或错误折叠蛋白累积，就会造成内质网应激，引发未折叠蛋白质反应（unfolded protein response，UPR）。 1内质网应激 内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是指细胞受到内外因素的刺激时，内质网形态、功能的平衡状态受到破坏后发生分子生化的改变，蛋白质加工运输受阻，内质网内累积大量未折叠或错误折叠的蛋白质，细胞会采取相应的应答措施，缓解内质网压力，促进内质网正常功能的恢复［1］。引发ERS的因素很多，缺血低氧、葡萄糖或营养物匮乏、钙离子紊乱等可造成急性应激损伤；而病毒感染、分子伴侣或其底物的基因突变等能引发慢性应激损伤。 根据诱发原因，可将ERS分为以下3种类型：①未折叠或者错误折叠蛋白质在内质网腔内蓄积引发的UPR；②正确折叠的蛋白质在内质网腔内过度蓄积激活细胞核因子κB（NF－κB）引发的内质网过度负荷反应（ER over－load response，EOR）；③胆固醇缺乏引发的固醇调节元件结合蛋白质（sterol regulatory element binding protein，SREBP）通路调节的反应。 ERS是细胞对内质网蛋白累积的一种适应性应答方式，细胞通过减少蛋白质合成，促进蛋白质降解，增加帮助蛋白质折叠的分子伴侣等方式缓解内质网压力［2］。但ERS过强或持续时间过长，超过细胞自身的调节能力，就会伤害细胞，引起细胞代谢紊乱［3］和凋亡［1］等。 2未折叠蛋白质反应 目前对UPR的机制研究较为深入。如果新合成的蛋白质在N末端糖基化、二硫键形成以及蛋白质由内质网向高尔基体转运等过程受阻时，未折叠或错误折叠的新合成蛋白质就会在内质网中大量堆积，细胞就会启动UPR［2］。UPR与内质网膜上的跨膜蛋白PERK（PKR－like ER1kinase）、IRE1（inositol requiring enzyme1）和ATF6（activating transcription factor－6）介导的信号通路有关［4，5］，这三种膜蛋白也被称为内质网感受器（ER stress sensors）［2］。 2．1内质网感受器蛋白的激活BIP（immunoglobulin －binding protein）是ER腔内的一种分子伴侣，为热休克蛋白70（heat shock protein of70kDa，HSP70）家族成员，又称为葡萄糖调节蛋白78（glucose－regulated pro-tein of78kDa，GRP78），由N端的ATP酶结构域和C 端的待折叠蛋白结合结构域组成，从酵母到高等哺乳动物高度保守。BIP能结合未折叠蛋白质富含疏水氨基酸区域，利用ATP水解释放能量帮助蛋白质折叠，并阻止未折叠、错误折叠的蛋白质聚集。非应激状态时GRP78/BIP与PERK、IRE1及ATF6这三种感受器的ER腔部分结合在一起，此情况下感受器蛋白没有活性。当ER内蛋白聚集，内质网处于应激状态时，与未折叠蛋白结合能力较强的BIP就解离释放到ER腔内，执行蛋白质折叠功能。此时内质网感受器被激活，产生PERK－eIF2α、IRE1－XBP1s和ATF6－ERSE三条主要的信号通路，进行UPR［2，6］。内质网应激条件下，BIP/GRP78表达上调明显，因而BIP/GRP78的诱导表达可作为ERS和UPR的激活标志［7］。 2．2信号通路PERK－eIF2α的应答反应PERK是内质网单次跨膜蛋白，胞质区有激酶结构域。内质网应激时，与BIP/GRP78解偶联的PERK蛋白形成同源二聚体，胞质区结构域自身磷酸化被激活，与真核生物起始因子2（eukaryotic initiation factor2，eIF2）的α亚单位（eIF2α）结合并促使eIF2α上的N端第51位丝氨酸磷酸化。磷酸化的eIF2a蛋白能抑制翻译起始复合物中GDP与GTP的交换，阻断了翻译起始复合物eIF2－GTP－tRNAMet的组装，从而抑制蛋白质的翻译与合成，减少新生蛋白质向内质网的内流，减少未折叠蛋
褪黑素对大鼠急性脊髓损伤内质网应激蛋白GADD153／CHOP表 达的影响 目的探讨褪黑素（MT）对急性脊髓损伤（ASCI）大鼠模型脊髓组织GADD153/CHOP表达的影响。方法选取健康SD大鼠96只，随机分为生理盐水处理组（NS组）、乙醇处理组（ET组）及褪黑素治疗组（MT组）各32只。所有大鼠均以改良Allen法制备脊髓损伤模型；MT组在模型制备的基础上给予褪黑素治疗；ET组在模型制备的基础上给予5%乙醇处理；NS组在模型制备的基础上给予0.9%氯化钠溶液处理。分别于伤后3 h、1 d 、3 d、7 d时各取8只应用改良Tarlov评分法评价其神经功能；Tarlov评分后处死，取受损节段脊髓行HE染色及免疫组化染色，观察形态学改变和CHOP表达的特点；并应用TUNEL方法检测神经细胞凋亡情况。其量的评定借助于麦克奥迪数码医学图像分析系统A（Motic.med 6.0）软件，结果分别用累积光密度（IOD）及细胞凋亡指数（AI）来表示。结果所有实验大鼠脊髓组织均有不同程度出血、水肿、细胞凋亡及坏死。MT组Tarlov评分除3 h时间点外，其他各时间点Tarlov评分明显高于ET组及NS组，且差异有统计学意义（P 0.05）。结论MT可抑制CHOP 表达，降低脊髓细胞凋亡指数，可能为其发挥急性脊髓损伤保护作用的重要机制之一。 标签：褪黑素；急性脊髓损伤；GADD153/CHOP；细胞凋亡；药物治疗 现代研究结果显示[1]，急性脊髓损伤（actue spinal cord injury，ASCI）后存在广泛细胞凋亡现象。细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡，目前大量研究认为其对损伤后神经功能产生重要的影响[2]，是导致继发性脊髓损伤的主要原因[3]。以往认为细胞凋亡信号传导通路包括线粒体和死亡受体途径[4]。最新研究表明，内质网应激也参与了细胞凋亡，其中CHOP/GADD153（C/EBP homologous protein/growth arrest-and DNA damage inducible gene 153）是内质网应激特异的转录因子[5-6]，可由DNA生长停滞性损害诱导产生。黄怀等[7]发现内质网应激可以诱导大鼠ASCI神经细胞的凋亡，加重脊髓的损伤及神经功能障碍，该研究还发现ASCI组织CHOP表达含量的高低与ASCI的严重程度一致。CHOP又称内质网应激促凋亡蛋白，是继发性脊髓损伤发生机制的重要因素之一。褪黑素（melatonin，MT）是人体重要神经内分泌活性物之一，主要由松果体分泌，因此也称为松果体素。目前，MT对脊髓损伤的保护作用是国外研究的热点。据相关文献报道，MT对脊髓的保护作用主要通过线粒体通路或者死亡受体通路而实现，关于MT通过内质网通路发挥脊髓保护作用的文献鲜有报道。本实验旨在观察褪黑素对大鼠ASCI后脊髓组织内质网应激相关蛋白GADD153/CHOP表达的影响，探讨其对脊髓损伤的保护作用。 1 材料与方法 1.1 动物与分组
大鼠行为学实验评价汇总 大鼠行为学评定方法比较 大鼠进行行为学评定(behavior test)的十分重要，对其评定的方法也颇多，但究竟那种方法更适用，目前未有人进行过比较。为了合理选择MCAO后的评定方法，如下对目前常用的几种行为学评定方法进行比较。 行为学检查方法:由3位参加试验的人员分别以单盲法对试验的大鼠进行打分和记录.然后将3组的记分结果进行平均后的得分进行统计计算。（国内） 由一个对试验实施过程不了解的观察者对大鼠进行行为学评测。评测续贯进行。如果大鼠在一次评测中出现恰当的行为，而以后却未出现，按前者记分。(国外) 1. 神经行为学检查Longa评分法 2．Berderson评分法姿势反射测验（postural reflex test） 3. 攀绳实验 4．网屏测验（screen test） 5．肢体放置测验（limb-placement test）Elicited Forelimb Placing 6．开野试验（Open－Field法）测定行为 7．MNSS 8.转动杆测验（rotating pole test） 9．Rotation 10．肢体对称试验评分法 11. rotarod test 12. adhesive-removal somatosensory test 13．Spontaneous Activity 14．Symmetry in the Movement of Four Limbs 15．Forepaw Outstretching 16．Climbing 17．Body Proprioception 18. Response to Vibrissae Touch 改善记忆作用 1.跳台试验 2.避暗试验 3.穿梭箱试验 4.水迷宫试验 Motor behavior (1) observation of spontaneous ipsilateral circling, (2) contralateral hindlimb retraction, (3) beam walking ability,平衡木测验（balance beam test） (4) bilateral forepaw grasp, Skilled forelimb function (1)staircase feeding apparatus nociception (1) plantar test
1、由日本Okamoto从Wistar大鼠中填培育的一种白化高血压大鼠，10周龄后动脉收 缩压雌鼠可达180mmHg雄鼠可达200mmHg以上。这个大鼠品系是 A ACI B F344 C SHR D WKY 2、由美国某兄弟农场培育，产仔多、生长最快、性情温顺、对性激素感受性高，在我国广泛使用的封闭群大鼠是 A Wistar B Sprague-Dawley D C Long－Evans D LOU/C 3、下列动物中垂体一肾上腺系统发达垂体摘除容易的动物是。 A 小鼠B大鼠 C 豚鼠 D 地鼠 4、下列动物中，对致畸药物十分敏感，适宜作致畸实验的动物是 A 狗 B 兔 C 豚鼠D大鼠 5、对大鼠外观描述正确的是。 A 成年大鼠一般体长10-15cm B 大鼠与小鼠同属一个属是小鼠长大成年而成 C尾巴上被有短毛和环状角质鳞片 D 前足有四趾，后足有三趾 6、下列均可导致大鼠产生攻击人的倾向。 ①粗暴操作②营养缺乏③母鼠哺乳④雄性大鼠关养在一起 ⑤雄性激素 A ①②③ B ①③④ C ②③④⑤ D ①②③④⑤ 7、严重缺乏时雄性大鼠可终生丧失生殖能力。 A VitA B Vit C C VitE D VitB2 8、大鼠比较活跃，采食、交配多在此期间发生。 A 夜间和黄昏B夜间和清晨 C 白天和黄昏 D 白天和清晨 9、大鼠对极为灵敏，长期慢性刺激时，会引起大鼠肺炎和进行性肺组织坏死。 A 噪声 B 高于临界的温度C粉尘、氨气 D 光照强度 10、大鼠，对外界刺激反应敏感，适宜作行为学研究。 A喜独居，喜安静的环境 B 喜群居，耐噪声环境 C 喜独居，耐噪声环境 D 喜群居，喜安静环境 11、由于，大鼠适于建立龋齿的动物模型 A门齿终身不断生长，需经常磨损以维持其恒定 B大鼠上下颌各有2个门齿和6个臼齿 C大鼠有乳齿 D磨牙的解剖形态与人类e相似，产生与人一样的龋损 12、由于，导致大鼠不会呕吐。 A在界限嵴存在一个褶 B 大鼠属于单室胃 C 胃分为非腺胃和腺胃 D 食管细长 13、对大鼠的肝脏描述正确的是。 A大鼠的肝重量约占体重的10% B 大鼠肝脏分为五叶 C再生能力很强，切除90%后可再生D肝Kupffer’s细胞95%有吞噬能力14、大鼠与小鼠相比较，叙述正确的是。
内质网应激与心血管疾病 摘要：应激是心血管疾病发生的机理之一，内质网应激是亚细胞器水平的应激。内质网内钙稳态失衡，错误折叠蛋白质聚集等都可引起内质网应激。研究发现内 质网应激参与动脉粥样硬化的形成；同时还介导组织缺血再灌注时的细胞损伤和 细胞死亡；预先诱发内质网应激可以通过改善再灌注损伤时细胞钙超载保护心肌 细胞。 关键词：内质网应激；细胞凋亡；心血管疾病 前言：内质网（endoplasmicreticulum，ER）是真核细胞蛋白质合成折叠、脂质合成以及 细胞内钙储存的亚细胞器，也是调节细胞应激与凋亡的重要场所。很多病理生理刺激，如氧 化应激、缺血缺氧、钙稳态紊乱及病毒感染等，能够引起内质网腔内未折叠与错误折叠蛋白 蓄积以及Ca2+平衡紊乱，称为内质网应激（endoplasmicreticulumstress，ERS）。适度的ERS 是一种保护性细胞机制，可通过促进内质网处理未折叠及错误折叠蛋白等降低损伤；持久或 严重的ERS可引起细胞凋亡。根据诱发ERS的原因不同，ERS可分为3种类型：未折叠/误折 叠蛋白在内质网内蓄积激发的未折叠蛋白反应（unfoldedproteinresponse，UPR），过多表达 的蛋白质经ER膜转运（如病毒感染产生大量病毒糖蛋白）激发的内质网过负荷反应，以及 ER膜上固醇剥夺激活的固醇级联反应。UPR是介导ERS的最重要的信号机制。ERS与很多心 血管疾病如动脉粥样硬化、缺血性心脏病、心肌肥大及心力衰竭等有关。 一、内质网应激反应的途径 内质网是一个动态的膜性细胞器，具有多种功能，包括：蛋白质的合成、修饰、折叠和 亚基的组合；类固醇合成；脂质合成；糖原合成；钙的储存以及钙稳态的维持等。感染性因素，环境中的毒性物质，不利的代谢条件以及蛋白质糖基化障碍、二硫键生成减少，蛋白质 从内质网到高尔基体的转运障碍，错误折叠蛋白的表达，内质网腔内的钙损耗等都可以干扰 内质网的功能，破坏内质网稳态，引发内质网应激。细胞为了生存产生针对内质网应激的反应，称内质网应激反应，迄今为止，至少已发现了四种功能上相互独立的反应途径。 1.1蛋白质生物合成的早期暂时性减缓： 蛋白质的不正确折叠引发的内质网应激反应称未折叠蛋白反应（unfoldedprote in response，UPR），在哺乳动物细胞中由三种内质网感应蛋白介导，即IRE-1 （type-I ER transmembrane prote in kinase），ATF-6 （activating transcription factor 6）和PERK（panc reatic eIF-2 kinase，pancreatic ER kinase）。此三种感应蛋白在未发生应激时都以无活性的状 态与GPR78 （glucose-regu-lated prote in78）/ B iP （immunoglobulin-binding prote in）结合。 未折叠蛋白的积聚使GRP78 / B ip与三种感应蛋白分离，引起它们的激活。其中PERK 自身聚合、自我磷酸化激活，将e IF-2α（α subunit of eukaryotic translation initiation factor 2）的 Ser51磷酸化，使之不能结合GTP，阻止了起始蛋氨酸..RNA与核糖体的结合，无法进行翻译 起始。这种保护性机制很快阻止了新生蛋白向内质网腔的转运，抑制了内质网的负荷过重。 2 某些基因的活化： 编码参与内质网蛋白质的折叠、转运、分泌、降解的基因在内质网应激时诱导表达，其 中包括内质网应激反应的标志性蛋白GRP78 / B ip。GRP78 / B ip是热休克蛋白家族H SP70的 成员之一，主要参与内质网中蛋白质的重新折叠和装配。 研究发现：内质网应激时诱导基因表达的通路有3条。 IRE-1是应激激活的有内切酶活性的内质网跨膜蛋白激酶，作为核酸内切酶对XBP-1 （X-box binding prote in 1）mR-NA进行选择性剪接，去除26bp的内含子序列，导致蛋白翻译移码，产生XBP..1 蛋白，转录活化含有上游ERSE （ERstress response e lement or the unfolded prote in response e lement（UPRE ））元件的基因。[1] ATF-6在内质网应激发生后，从内质网膜转移到高尔基体，其反式激活结构域被特异蛋白 酶（specific proteases ）S1P和S2P从膜上水解下来，转移到胞核中，与ERSE 相互作用，激 活许多内质网应激反应蛋白的转录，包括GRP78 / B ip，CHOP（C /EBP homologous prote in）/ GADD153 （grow tharrestand DNA-dam ag e-induc ib le gene 153），XBP-1，ERp72 （ERprote in72）和H erp （H cy-induced ER prote in）。S1P和S2P同时识别、裂解、激活SREBPs
2.2 内质网应激 2.2.1 内质网及内质网应激概述 内质网（endoplasmic reticulum，ER）是哺乳动物细胞中一种重要的细胞器，其膜结构占细胞内膜的二分之一，是细胞内其它膜性细胞器的重要来源，在内膜系统中占有中心地位。ER 的功能包括：①ER 是细胞的钙储存库，内质网的钙离子浓度高达 5.0mmol/L，而胞浆中为 0.1ummol/L。并能调节维持细胞内钙平衡。②ER 是分泌性蛋白和膜蛋白的合成、折叠、运输以及修饰的场所。ER 通过内部质量调控机制筛选出正确折叠的蛋白质，并将其运至高尔基体，将未折叠或错误折叠的蛋白质扣留以进一步完成折叠或进行降解处理。③ER 还参与固醇激素的合成及糖类和脂类代谢，内质网膜上含有固醇调节元件结合蛋白，对固醇和脂质合成起调节作用。 ER对影响细胞内能量水平、氧化状态或钙离子浓度异常的应激极度敏感。当细胞受到某些打击（如缺氧、药物毒性等）后，内质网腔内氧化环境被破坏，钙代谢失调，ER功能发生紊乱，突变蛋白质产生或者蛋白质二硫键不能形成，引起未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网腔内积聚以及钙平衡失调的状态，即内质网应激（endoplasmic reticulumstress，ERS）。内质网巨大的膜结构为细胞内活性物质的反应提供了一个广阔的平台，在许多信号调控中起到关键作用。最近的研究表明，内质网是细胞凋亡调节中的重要环节[39]。ERS可以介导与死亡受体和线粒体途径不同的一条新的凋亡通路。当细胞遭到毒性药物、感染、缺氧等刺激时，内质网腔未折叠蛋白增多和细胞内钙离子超载，引起caspase 12活化，继而激活下游的caspase，导致细胞凋亡。早期的ERS是机体自身代偿的 过程，对细胞具有保护作用；如果这种失衡超过了机体自身调节的能力，最终的结局将是细胞的死亡。ERS的确切机制目前尚不明确。深入研究ER及ERS，对于完善细胞损伤和凋亡理博具有重要意义，有助于进一步认识疾病发生发展的机制，为临床疾病预防和治疗提供新的理博依据。 2.2.2 内质网应激的信号通路 ER 内环境的稳态一旦被打破，将激活一系列的级联反应通路，包括PERK/eIF2α通路、IRE1/XBP1 通路及 ATF6 介导的通路。内质网应激激活的信号通路主要有[40]：①未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）；
应激对小G蛋白RhoB的诱导作用 【摘要】小G蛋白RhoB是一个早期反应基因,多种应激原如放射线、紫外线、缺氧、抗癌药(如5-氟脲嘧啶、顺铂)等均能迅速上调RhoB的mRNA和蛋白质水平和(或)激活RhoB。RhoB上调或被激活在细胞应激反应中具有重要的生物学意义,目前RhoB在应激中的作用渐受重视。本文就几种应激原对其影响作一介绍。 【关键词】小G蛋白;RhoB;应激 随着对应激机制研究的深入,人们发现应激时除有神经-内分泌以及相关的功能代谢改变外,还有细胞水平的变化。这种当细胞处于不利环境和遇到有害刺激时所产生的防御或适应性反应称为细胞应激,它存在于从单细胞生物到高等动物所有的生物体内[1]。 细胞应激可分为基因毒应激(由紫外线、离子射线、过多的活性氧、化学致畸及致癌物等引起)和非基因毒应激(由切应力、创伤、感染、缺氧和热应激等引起)两大类。细胞应激反应包括一系列高度有序事件,表现为应激原诱发的细胞内信号转导,激活相关的转录因子和促进应激基因的快速表达,合成多种特异性和非特异性的对细胞有保护作用的应激蛋白质,从而对细胞产生特异和非特异的保护作用,同时细胞内一些正常基因的表达受到抑制。 小G蛋白Rho亚家族是一类GTP酶结合蛋白,它通过其下游效应蛋白介导参与调控多种细胞生物学功能,涉及到细胞的骨架重组、生长、凋亡、运动等[2-3]。Rho亚家族成员主要有RhoA、RhoB和RhoC,虽然RhoB和RhoA、RhoC在结构上的相似性高达87%,但它在细胞内定位、不同细胞周期中的表达情况以及调控等许多方面都显示出其特殊性[4-5]。小G蛋白RhoB至今的研究表明其是一类GTP结合蛋白,只有与GTP结合的RhoB(活化的RhoB)才能激活下游的信号转导通路,进而发挥复杂多样的生物学效应[6]。RhoB属于即时反应基因,可被多种基因毒应激因素所诱导,诸如紫外线、化疗药物(如顺铂、5-氟尿嘧啶)等[7-8],并能抑制某些肿瘤细胞增生和诱导细胞凋亡[9-10]。 1紫外线(UV)对小G蛋白RhoB的诱导作用 紫外线照射属于基因毒应激,它是通过损伤DNA引起的细胞应激,紫外线依据波长一般分为UV A(320～400 nm)、UVB(290～320 nm)和UVC(240～290 nm)。其损伤DNA的机制:UV A主要通过其他分子产生活性氧间接损伤DNA的单个碱基;而UVB和UVC直接被DNA分子吸收,使DNA形成嘧啶二聚体,相邻2个T,相邻2个C,C与T之间均可形成二聚体,但最容易形成的二聚体是TT,结果使其不能与嘌呤配对而致DNA损伤。 Westmark等[11]发现,在分化细胞(NIH/3T3)和原代细胞(NHEK)细胞中,紫外线照射数小时后,RhoB上调,RhoB mRNA的半衰期较对照增加2～3倍,其是通过
条件恐惧大鼠模型的行为比较 【摘要】目的探讨不同性别条件恐惧大鼠的恐惧记忆保持和矿场行为是否存在差异。方法利用巴甫洛夫经典条件反射建立声音+电击,建立条件恐惧大鼠模型，于训练前1天及训练后第1、3、7、20天进行恐惧记忆保持测和试旷场测试。结果 (1)恐惧记忆保持测试实验结果显示,雄性大鼠的恐惧记忆保持水平高于雌性大鼠，其僵立时间百分比在个时段均高于雌性大鼠，尤其在训练后训练后1天和训练后20天，雄性性大鼠为67.90±34.74与 27.4±22.51，雌性大鼠为23.60±21.10和3.10±3.07,存在统计学差异（P<0.05）。（2）旷场实验结果显示,除修饰次数外，雌雄大鼠旷场行为比较存在明显统计学差异（P<0.05）。结论雌雄条件恐惧大鼠存在行为学差异。 【关键词】应激恐惧记忆保持旷场行为 创伤后应激障碍（post traumatic stress disorder,PTSD）是指在强烈的精神创伤后发生的一系列心理、生理的应激反应所表现出的一系列临床综合征。 PTSD临床表现多样，从临床症状来看,其核心症状是创伤性记忆的不断闯入导致恐惧情绪、逃避行为和过度唤起的生理反应。有研究表明,社区普通人群中PTSD的终生患病率男性为5%,女性为10.4% 。普通人群中女性的患病率是男性的2倍。制备理想的模型是研究PTSD发生、发展规律机制的一个重要环节。目前PTSD的动物模型，多采用条件恐惧模型。一般认为，雌性动物由于生理周期的影响，在PTSD的动物实验研究中，制备动物模型多采用雄性动物，那么动物雌雄间是否具有差异，未见报道。本研究中依照文献所用的方法[3]，建立条件恐惧大鼠模型，观察雌雄大鼠条件恐惧记忆保持及其行为活动的差异。 1 材料和方法 1.1实验动物与材料 健康成年Sprague-Dawley（SD）大鼠20只，雌雄各10只,体重200±30g,由第三军医大学实验动物中心提供。自制足底电刺激控制箱，该装置由电刺激箱、电压控制仪一季声音发生器组成。旷场行为观察箱为90m×90m×45cm(安徽正华生物仪器设备有限公司提供),底被划分为等面积的25格正方形方格。 1.2实验方法 1.2.1条件恐惧大鼠模型制备 先将大鼠在动物饲养室中适应1周,室温22～25 ℃, 分隔喂养, 自然昼夜节律光照,通风良好, 自由摄食、饮水。期间实验者每天抚摸大鼠5分钟以使动物适应。并将大鼠放入电击箱内10分钟，使其熟悉电击箱并观察大鼠行为。模型制备前一天，进行一次旷场测试。所有的行为实验均在8:00AM- 12:30AM 间进行。 采取声音信号提示结合电击大鼠足底产生条件性恐惧的方法,制造创伤后应激障碍动物模型。将大鼠放入电击箱中，适应3分钟允许自由探索，3分钟之后由扬声器输出声音信号（4.5kHz,80db；条件性刺激，conditioned stimulus CS）；持续30秒，在30秒声音最后两秒同时加以不可逃避的足底电刺激(40V～45V，10秒；非条件性刺激，unconditioned stimulus, US )，反复10次，两次间隔1～4分钟。当给予声音信号，动物出现显著僵立行为或逃避反应，表示声音信号提示的恐惧性条件反射建立。电刺激结束后动物继续在该箱中停留1～4分钟然后放回日常饲养笼中。每只大鼠训练结束取出后及时地清理其排泄物，将电击箱打扫干净，并用90%酒精檫洗箱底。 1.2.2 行为学测定 1.2.2.1恐惧记忆保持测验 主要测定僵立行为（僵立行为是一种普遍见于啮齿类的防御行为，表现为刻板式的蹲伏姿势，大鼠外观除呼吸运动以外其余的肌肉运动均消失，是大鼠恐惧表达的行为方式。于训练后第1、3、7天和训练后20天时观察两组大鼠情感行为改变，将大鼠放入电击箱中，适应3分钟允许自由探索。然后，只予以声音刺激而无电击,其他条件同模型制作时，观察3分钟内大鼠僵立时间，僵立时间之和占总时间的百分比即为僵立时间百分比。间隔0.5-1min 后，重复上操作，连续5次。不同性别条件恐惧大鼠模型的行为比较 1.2.2.2旷场实验(Open-field test ) 于训练前1天及于训练后第1、3、7天和训练后20天时各组大鼠进行旷场实验，实验在安静、光线较暗的环境中进行, 将大鼠轻轻放入旷场行为观察箱中央小方格内，观察3min内大鼠的情感行为情况:①大鼠运动活性：穿行格数, 指三爪以上跨入邻格的次数；②探究行为: 直立次数,指两前爪腾空1cm 以上或攀附墙壁次数； 1.3数据处理 采用SPSS13.0统计软件进行分析，所有数据均由（x-±s）表示，进行t检验确定组间差异，检验结果以P <0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1恐惧记忆保持测验结果 大鼠在重新置入电击箱中呈明显僵立行为。雄性大鼠在不同的时间点僵立时间百分比均明显高于雌性大鼠。尤其在训练后训练后1天和训练后20天差异具统计学意义，结果见表1。 表1 条件恐惧大鼠模型恐惧记忆保持测试僵立百分比() 与雌性比较 * P<0.05
内质网应激氧化应激及JNK通路与2型糖尿病 侯志强李宏亮李光伟 卫生部中日友好医院内分泌代谢病中心 胰岛β细胞功能受损和外周组织胰岛素抵抗是2型糖尿病(T2DM)发病中的两个重要方面。目前研究发现T2DM时内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）和氧化应激（oxidative stress）被激活，而且二者之间可相互作用相互影响，并共同活化了c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinasse,JNK）通路参与了T2DM的发生发展。本文将内质网应激、氧化应激及JNK通路在导致胰岛β细胞功能受损及外周胰岛素抵抗中的作用及机制作一综述。 1．内质网应激与2型糖尿病 内质网（endoplasmic reticulum，ER）是真核细胞中蛋白质翻译合成和细胞内钙离子的储存场所，对细胞应激反应起调节作用。ERS 是指由于某种原因使细胞内质网生理功能发生紊乱的一种亚细胞器病理状态。目前研究发现ERS在T2DM的胰岛β细胞功能受损、调亡及外周胰岛素抵抗中占据着重要的地位[1,2]。 1.1 内质网应激与胰岛β细胞 胰岛β细胞具有高度发达的内质网，在正常生理情况下，机体可通过ERS的PERK（RNA激活蛋白激酶的内质网类似激酶）-真核细胞翻译起始子（eIF2）磷酸化途径影响胰岛素的合成，调节β细胞胰岛素分泌功能[3]。但是，过度的ERS可能导致胰岛β细胞功能受损，甚至细胞调亡。 Scheuner D等[4]研究发现eIF2α突变纯合子鼠其胚胎和新生鼠体内均存在着严重的β细胞缺乏及胰岛素含量显著降低，杂合子突变鼠在高脂喂养后尽管胰岛的大小与野生型鼠无明显差别，但单个胰岛中胰岛素含量较野生型降低，而且葡萄糖和精氨酸刺激后胰岛素的分泌也明显减弱，从而提示e IF2α在高脂诱导的胰岛功能损伤中起到了保护作用。I型跨膜蛋白激酶/核糖核酸内切酶（IRE1）是ERS中另一条重要的调节β细胞胰岛素合成的途径。Lipson KL等[5]发现急性血糖升高可活化β细胞IRE1信号通路，从而促进胰岛素的合成，而阻断IRE1通路后可明显减低胰岛素的合成，说明IRE1信号通路参与了β细胞胰岛素合成，并可能成为改善β细胞功能的治疗靶点。ERS通过CHOP，JNK和Caspases途径介导的β细胞调亡是导致糖尿病发病另一重要机制[6]。研究发现杂合子Akita小鼠，由于胰岛素2基因突变干扰了胰岛素A，B链间的二硫键形成，使胰岛素蛋白错误折叠，加重内质网应激，诱导CHOP表达增强导致β细胞调亡，促进了Akita鼠自发性糖尿病的发生，而在CHOP敲除小鼠中诱导Akita突变后，可保护β细胞数目并使得高血糖发生被延迟[7]。此外，Fornoni A等[8]在体外应用JNK的抑制性多肽（L-JNKI）处理鼠的胰岛及β细胞，发现L-JNKI可提高胰岛β细胞的存活率。 1.2 内质网应激与胰岛素抵抗 ERS不仅参与调节胰岛β细胞功能衰竭及介导β细胞调亡，而且与T2DM外周胰岛素抵抗密切相关[9,10]。Ozcan U等[1]发现肝细胞发生ERS时胰岛素受体底物1（IRS-1）的酪氨酸磷酸化明显降低，而JNK依赖性的丝氨酸磷酸化是升高的；而给于合成抑制剂SP600125或抑制性多肽-JIP阻断JNK通路后，可逆转ERS引发的上述变化，提示ERS可通过促进JNK依赖性的IRS-1丝氨酸磷酸化而影响胰岛素的受体信号通路，导致胰岛素抵抗。X-盒结合蛋白-1（XBP-1）是一种调节多种基因表达的转录因子，是调控ERS的关键因子。Ozcan U等[1]还发现高脂喂养的XBP-1基因突变杂合子（XBP-1+/-）小鼠同XBP-1+/+鼠比较，肝脏中的PERK磷酸化水平和JNK活性均显著增加，IRS-1酪氨酸磷酸化和Akt丝氨酸磷酸化均降低。进一步说明ERS可通过JNK通路活化导致细胞胰岛素受体信号通路抑制。 氧调节蛋白150（ORP150）是一种内质网分子伴侣，研究表明ORP150可保护细胞免受ERS所致损伤。Nakatani Y等[11]给予 C57BL/KsJ-dbdb肥胖糖尿病鼠表达ORP150的腺病毒（Ad-ORP）后发现肝脏中ORP150表达明显增加，而且与表达绿色荧光蛋白（GFP）的腺病毒（Ad-GFP）处理者相比肝脏中ERS水平明显降低。采用正常血糖高胰岛素钳夹试验发现肝脏中ORP150过度表达可降低胰岛素抵抗，并可改善C57BL/KsJ-db/db鼠的葡萄糖耐量。此外，Ad-ORP处理鼠较Ad-GFP者IRS-1的酪氨酸磷酸化及Akt 丝氨酸磷酸化明显增加。这些结果表明ORP150过度表达可降低肝脏中ERS水平，增强胰岛素信号，改善胰岛素抵抗和糖耐量。
细菌应激反应中的蛋白质组学研究 摘要： 蛋白质组学(Proteomics)是合并双向电泳分离和质谱分析技术，并应用生物信息学阐明生物体全部蛋白质的表达模式和功能模式的一个研究领域。它能促进我们对于特殊条件下生理现象的理解。当外部生存环境发生变化时，细菌会在短时间内发生应激反应。利用2-D技术结合生物质谱鉴定的方法对细菌蛋白表达谱变化进行研究，是细菌转录谱变化研究的深入和扩展，是细菌应激反应研究中的新热点。 关键字： 蛋白质组学，应激反应，细菌 正文： 蛋白质组学(Proteomics)是合并双向电泳分离和质谱分析技术，并应用生物信息学阐明生物体全部蛋白质的表达模式和功能模式的一个研究领域，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。自从这一概念在1994年被提出以来，就一直是是医学领域研究的前沿。 蛋白质组学研究可以提供关于蛋白质合成中的变化、降解速率、后转录突变、蛋白质相互作用、亚蛋白定位等没有价值的信息，它能促进我们对于特殊条件下生理现象的理解。许多研究被开展来研究细菌在不同生长环境下/基因生长压力下的蛋白表达，在系统生物学水平上揭示了新的潜在的途径和相对丰富的蛋白质。 当细菌的外部生存环境发生变化时，细菌会在短时间内产生应激反应，调整其蛋白表达谱，阻遏冗余蛋白或者非必需蛋白的表达，将资源尽可能的用于合成那些对于细菌应对环境所必须的蛋白质。从分子水平上讲，当细菌遭遇到一个特定的压力的时候，对环境的应激反应是一个十分复杂的反应过程，其基
因组的大部分基因都会参与这个过程，对细菌应激反应进行研究的目的，就是要找到在这些压力条件下发挥关键性作用的蛋白。 研究应激反应最直接最普遍的方法就是蛋白双向电泳结合质谱鉴定的技术，这一技术一方面可以从整体水平上研究细菌应对环境变化时发生的蛋白质谱变化，一方面可以通过研究胶块上的蛋白质点来研究参与了应激反应的单个蛋白质的表达量和蛋白性质的变化。两方面相融合，可以解释应激反应中的蛋白质变化，分析他们的生化性质，阐明应激反应中的分子调节剂机制。 目前，学术界对于细菌的应激反应造成蛋白质组变化的研究主要集中在以下几个方面 1.温度变化 大多数细菌在其自然生活史中都会遭遇到生长温度的变化，因此，细菌必须具备快速感受外界环境温度变化并通过调节代谢抵御温度变化对自身的伤害的能力。在用转录组学和蛋白质组学方法对一株蓝细菌的热休克反应进行系统的研究时，把蓝细菌的培养温度提升为44℃，20min后一些分子伴侣及蛋白酶的编码基因开始被诱导转录，60min后，一些分子伴侣和蛋白酶的表达水平也 有所提高，但是，延伸因子的的表达调控似乎主要是在蛋白水平。在对普通脱硫弧菌热休克反应的研究中，应用双向电泳和基因芯片的方法发现的 DnaK、HtpG、HtrA、AhpC等热休克蛋白的表达变化说平是一致的。此外，还发现，DnaK、AhpC、GroES、GroEL及几个周质ABC转院单摆可能存在翻译后修饰。变异链球菌在温度升高时也有特异性感受温度变化的应激蛋白的表达量上升。 在对一株湿热脂肪芽孢杆菌的冷休克反应进行蛋白质组学研究时，将其从最适的生长温度65℃培养变为37℃和25℃培养时，可发现它的葡糖基转移酶、Mrp蛋白同原体、二氢乳清酸酶、假想的转录因子、RibT蛋白、活性硫酸盐还原酶及转录激活子RsfA等的表达差异有较大变化。在产生差异表达的53种蛋白中，有6种冷休克蛋白都与细菌产生芽孢的信号转到过程有关。 2.渗透压变化