酸奶的检测方法与研究进展

酸奶的检测方法与研究进展王成（中南大学化学化工学院，长沙 410083）摘要：综述了酸奶风味、新鲜度的分析检测技术。

以乳酸含量作为酸奶风味评判指标，以霉菌及酵母菌含量作为酸奶新鲜度评判指标，分别说明其分析检测标准及方法。

并列出了酸奶新产品的研究进展。

关键词：酸奶；乳酸；霉菌；酵母菌；新产品酸奶，是以新鲜的牛奶为原料，经过巴氏杀菌后再向牛奶中添加有益菌（发酵剂），经发酵后，再冷却灌装的一种牛奶制品。

酸奶的组成成分一般包括: 鲜牛奶、白砂糖、活性乳酸菌、增稠剂、安赛蜜、阿斯巴甜(含丙氨酸)、水、蛋白质、脂肪。

另外, 酸奶中还含有乳酸、维生素、叶酸和磷酸等营养成分[1]。

目前市场上酸奶制品多以凝固型、搅拌型和添加各种果汁果酱等辅料的果味型为多。

酸奶不但保留了牛奶的所有优点，而且某些方面经加工过程还扬长避短，成为更加适合于人类的营养保健品。

酸奶作为一种时尚健康的食品被越来越多的人所喜爱，而优良的风味是其被消费者接受的前提，其中有机酸是酸奶风味物质中的重要成分。

乳制品中天然有机酸的来源主要有：乳脂肪的水解，牛的生理代谢，以及细菌代谢。

乳酸菌的分解代谢也会产生这些产物，同型乳酸发酵将几乎全部的碳源经丙酮酸代谢转化为乳酸，也可以产生其它有机酸及风味代谢产物[2]。

乳酸是乳酸菌发酵代谢的主要产物，是酸奶中最主要的有机酸[3]。

因此，可以将乳酸含量作为酸奶风味评判指标。

酸奶在保藏过程中，微生物的数量会发生明显变化[4]，可根据此判定酸奶的新鲜度，确定保质期。

1 酸奶风味检测乳酸是酸奶中的主要酸味剂，合适的酸度能增进酸奶的风味、增加人们的食欲。

我国现行《食品安全国家标准发酵乳》(GB19302—2010)规定了发酵乳理化指标[5]，具体如下表2所示。

规定发酵乳和风味发酵乳的酸度≥70.0°T。

测定酸奶中乳酸的含量，对于酸奶中酸度的确定有重要意义。

1.1 乳酸的检测方法测定乳酸的主要方法有酸碱滴定法、比色法[6，7]、酶电极法[7，8]、GC法[9]以及HPLC法[7] [9，10]等。

酸碱滴定法和比色法虽然方便，但其他有机酸的存在干扰其测定；电极法需要使用乳酸脱氢酶膜片，该膜片价格昂贵，而且寿命一般只有几天；GC法需要衍生或使用顶空进样装置，操作复杂；由于乳酸紫外吸收极其微弱，以HPLC法在210nm检测，灵敏度很低，且样品前处理复杂，对杂质含量高的样品，即便进行样品处理，色谱柱也很容易污染。

毛细管电泳法(capillary electrophoresis，CE) [11]是近二十年来迅速发展起来的一种新型分离技术，具有高效、快速、运行费用低等特点。

目前，国内外还未见用毛细管电泳法检测酸奶中乳酸含量的报道。

下面进行了酸奶中乳酸含量测定方法的探讨，开发了一种快速简便地测定酸奶中乳酸含量的毛细管电泳方法。

一、材料与方法（1）仪器P/ACE MDQ型毛细管电泳仪为Beckman Coulter公司产品。

石英毛细管(内径75μm、外径375μm、总长度60cm、有效长度50cm)购自河北永年锐沣色谱器件有限公司。

S．320型pH计为Mettler Toledo公司产品。

5415D型离心机购自eppendorf公司。

微量移液器为北京金花公司产品。

WH-3型微型旋涡混合仪为上海沪西分析仪器厂生产。

双蒸水发生器为上海亚荣分析仪器厂出品。

（2）试剂2,6-吡啶二羧酸为Sigma公司产品，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)为AMRESCO分装产品，乳酸为武汉化学试剂厂产品(纯度为85%)，氢氧化钠为国产分析纯试剂。

（3）样品1号样品为友芝友草莓酸牛奶，2号为友芝友酸牛奶，3号为扬子江草莓酸牛奶，4号为扬子江原味酸牛奶，5号为光明原昧酸牛奶。

样品为实验前一天购于武汉中百超市狮子山店。

（4）样品前处理取100μl酸奶样品于1．5ml的eppendorf管中，用双蒸水稀释到1000μl，在微型旋涡混合仪充分混匀，离心(10000g、5min)后取5Oμ1上清液用双蒸水稀释到1000μl，充分混匀后再次离心(10O00g、2min)，取500μl稀释样品到样品管进行毛细管电泳测定。

（5）毛细管电泳条件以10．0mmol/L 2，6-吡啶二羧酸-0．5mmol/L CTAB(pH3．5，以lmol/L NaOH调节)为运行电解质，分离电压15kV(阳极端检测)，柱温25℃，检测波长214nm，压力进样(O．5psi×5s)，运行电解质需以0．22μm微孔滤膜过滤，样品进行批处理，每个样品重复进样3次，每次进样前运行电解质(3min)冲洗毛细管。

所有试剂均以双蒸水配制。

二、结果与分析（1）背景电解质的选择由于乳酸几乎无紫外吸收，本实验采用间接紫外法检测。

对羟基苯甲酸、2，6-萘二羧酸、2，6-吡啶二羧酸是分离中等淌度有机酸较好的背景电解质。

实验表明2，6-吡啶二羧酸分离重现性最好，因而选其为背景电解质。

（2）缓冲液浓度和pH值的选择毛细管电泳优化条件为：缓冲液为10．0mmol/L 2，6-吡啶二羧酸-0．5mmol/L CTAB(pH3．5)，分离电压：-15kV。

（3）线性范围、检测限配制1．0、5．0、l0．0、20．0、40．0、60．0、80．0、l00．0lμg/ml乳酸标准溶液，在优化条件下批处理进样，以浓度(Y，μg/m1)对峰面积(X)作回归方程，结果表明乳酸浓度在5～l00μg/m1范围内浓度与峰面积具有良好的线性关系：Y=2．074×103×X-0．003583（r=0．9993）用稀释法测得乳酸的最低检测限(以S/N=3计)为0．2lμg/ml。

（4）测定结果以稀释200倍的五种酸奶样品溶液在优化条件下批处理重复进样3次，根据标准曲线和稀释倍数计算出乳酸含量，并由软件计算出迁移时间、峰面积的相对标准偏差(RSD)。

结果表明市售酸奶中乳酸含量均达到标准，迁移时问和峰面积的RSD值分别小于1．0%、2．0%，表明该方法精密度高。

毛细管电泳法准确度高，而且快速、简便，能连续和自动地测定样品中乳酸含量。

相对于其他方法，优点较明显。

1.2 酸碱滴定法测酸度现行《食品安全国家标准乳和乳制品酸度的测定》(GB 541334-2010)中采用酸碱滴定法测定发酵乳中的酸度[12]，现将此方法介绍如下：（1）原理以酚酞为指示液，用0.1000mol/L氢氧化钠标准溶液滴定100g试样至终点所消耗的氢氧化钠溶液体积，经计算确定试样的酸度。

（2）试剂和材料除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为GB/T 6682规定的三级水。

中性乙醇-乙醚混合液：取等体积的乙醇、乙醚混合后加3滴酚酞指示液，以氢氧化钠溶液（4g/L）滴至微红色。

氢氧化钠标准溶液：0.1000mol/L。

酚酞指示液：称取0.5g 酚酞溶于75mL体积分数为95%的乙醇中，并加入20mL 水，然后滴加氢氧化钠溶液至微粉色，再加入水定容至100mL。

（3）仪器和设备天平：感量为1mg、电位滴定仪、滴定管：分刻度为0.1mL、水浴锅。

（4）分析步骤称取10g（精确到0.001g）已混匀的试样，置于150mL 锥形瓶中，加20mL 新煮沸冷却至室温的水，混匀，用氢氧化钠标准溶液电位滴定至pH 8.3为终点；或于溶解混匀后的试样中加入2.0mL酚酞指示液，混匀后用氢氧化钠标准溶液滴定至微红色，并在30s 内不褪色，记录消耗的氢氧化钠标准滴定溶液毫升数，代入公式中进行计算。

（5）分析结果的表述试样中的酸度数值以（ºT）表示，按下式计算：式中：X2——试样的酸度，单位为度（ºT）；c2——氢氧化钠标准溶液的摩尔浓度，单位为摩尔每升（mol/L）；V2——滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，单位为毫升（mL）；m2——试样的质量，单位为克（g）；0.1——酸度理论定义氢氧化钠的摩尔浓度，单位为摩尔每升（mol/L）。

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

（6）精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过1.0ºT。

2 酸奶新鲜度检测我国现行《食品安全国家标准发酵乳》(GB 19302—2010)规定了发酵乳中微生物的限量，具体如下表3所示。

现以霉菌及酵母菌含量作为酸奶新鲜度评判指标。

2.1 霉菌及酵母菌含量的检测方法我国现行《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》（GB 4789.15—2010）规定了食品中霉菌和酵母菌的计数方法[13]。

王秀娟等[14]采用平皿菌落计数法[15]对凝固型和饮料型两种酸奶制品在保质期内乳酸菌、霉菌及酵母菌的数量进行测定，判断酸奶的品质情况。

结果表明酸奶保质期[16]的限制因素主要是酵母菌和霉菌。

测定方法如下：（1）材料辉山酸奶凝固型(117g/杯)：沈阳辉山乳业有限公司生产，保质期21d；辉山原味酸奶调味酸牛乳(125g/袋)：沈阳辉山乳业有限公司生产，保质期14d。

MRS培养基：柠檬酸氢二铵20．0g，磷酸氢二钾2．0g，乙酸钠5．0g，硫酸镁0．58g，硫酸锰0．25g，葡萄糖20．0g，吐温80 1．0mL，蛋白胨10．0g，牛肉膏10．0g，酵母膏5．0g，琼脂18．0g，加蒸馏水至1000mL。

马铃薯-葡萄糖琼脂培养基：马铃薯(去皮切块)300g，葡萄糖20g，琼脂20g，加蒸馏水至1000mL。

查氏培养基：硝酸钠2．0g，磷酸氢二钾1．0g，氯化钾0．5g，硫酸镁0．5g，硫酸铁0．01g，蔗糖30．0g，琼脂20．0g，加蒸馏水至1000mL。

（2）仪器BS210电子天平：上海赛多利斯公司；SPX型智能生化培养箱：宁波江南仪器厂；YQX-2厌氧培养箱：上海新苗医疗科技公司；280不锈钢电压锅：上海三申公司；303-2电热培养箱：上海浦东荣丰科学仪器有限公司；格兰仕微波炉：佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司。

（3）实验方法用灭菌容器称取样品25mL，放人装有225mL蒸馏水的三角瓶中，充分震荡，将预处理后的样品依次进行l0倍稀释至10-7。

在已经灭菌的平皿中加适量45～50℃培养基，选择适当倍数的稀释液，各以1mL 量加入平皿中，MRS培养基培养的乳酸菌需放入厌氧培养箱中(35～37℃)培养2d，马铃薯-葡萄糖和查氏培养基需放人培养箱中（25～28℃)培养5d，计数。

3 酸奶新产品的研究进展从世界范围来看，酸奶是发展最快的乳制品产品，欧洲是开发酸奶新产品的基地[17]，每年乳制品的新产品中有7%是各种酸奶，每年约有近千种酸奶新产品问世[18]。

然而，我国酸奶开发的基础研究与世界先进水平存在差距，在开发思路上尚有局限性，基础研究投入也显得不足。

赵春枫等[19]对新型高效降胆固醇酸奶[20]进行了研究，用发酵乳杆菌SM-7与另一株降胆固醇活性为41．87%的乳酸乳球菌乳亚种LB12发酵制备酸奶，研究混菌比例、接种量、发酵温度及发酵时间4个因素对酸奶品质的影响，并通过正交试验优化发酵工艺，开发具有降胆固醇功能的新型酸奶；庞明利等[21]阐释了聚葡萄糖的应用优势及在酸奶中的应用市场现状，并分析了未来酸奶市场的发展趋势，以及聚葡萄糖应用于酸奶中的巨大市场潜力。