当前位置：文档之家 › 发酵工程 第二章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术讲解

发酵工程 第二章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术讲解

  • 格式：ppt
  • 大小：7.88 MB
  • 文档页数：155

下载文档原格式

  / 155

合集下载

发酵工艺 第2章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术

发酵工艺 第2章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术

微生物菌种保藏机构名称和缩写
中国 缩写
ACCC
SH IA CCGMC AS-IV
CAF
IFFI
ID IV CIVBP
名称 中国农业微生物菌种保藏管理中 心 上海市农业科学院食用菌研究所 中国医学科学院抗菌素研究所 普通微生物菌种保藏管理中心 中国科学院武汉病毒研究所 中国林业科学院菌种保藏管理中 心 轻工业部食品发酵工业科学研究 所 中国医学科学院皮肤病研究所 中国医学科学院病毒研究所 中国兽医药品监察所
最常用的工业微生物
放线菌
– 链霉菌属 – 小单孢菌属 – 地中海诺卡氏菌 – 米苏里游动放线菌
藻类
藻类包括数种不同类以光 合作用产生能量的生物。 它们一般被认为是简单的 植物，并且一些藻类与比 较高等的植物有关。虽然 其它藻类看似从蓝绿藻得 到光合作用的能力，但是 在演化上有独立的分支。 所有藻类缺乏真的根、茎、 叶和其它可在高等植物上 发现的组织构造。藻类与 细菌和原生动物不同之处， 是藻类产生能量的方式为 光合自营性 ；琼脂（棕 藻）
国外重要菌种保藏机构
1、ATCC：美国模式培养物（菌）保藏中心 2、NRRL：美国农业部北方开发利用研究部 3、CSH：美国冷泉港研究所 4、IAM：日本东京大学应用微生物研究所 5、IFO：日本发酵研究所（大阪） 6、NCTC：英国国立标准菌种收藏所 7、CBS：荷兰真菌中心保藏所
三、生产中常用菌种的分离、选 育（screening ）
（一）微生物菌种的分离 四步骤： 样品采集 增值培养 纯种分离 生产性能的测定
1.施加选择压力分离法
施加选择性压力分离法
主要是利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营 养的要求不同，如温度、pH、渗透压、氧气、碳源、 氮源等，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微 生物生长，而不利于其他种类微生物的生存，以达到 使目的菌种占优势．而得以快速分离纯化的目的。如 可以控制培养时的氧，可将好氧微生物和厌氧微生物 分开；通过控制温度，可将嗜热微生物和非嗜热微生 物分开；控制pH，可将嗜酸、嗜碱微生物分离等。在 分离培养基中也可以加入不同的抗生素或试剂来增加 选择性。如在分离放线菌和细菌时，可加入抗真菌抗 生素；分离真菌时，可加入抗细菌药物。

优选第二章发酵工业微生物菌种制备原理和技术

优选第二章发酵工业微生物菌种制备原理和技术
或调节突变株或野生突变株； 5、抗噬菌体和杂菌能力强，不易被感染； 6、菌种纯粹，遗传性状稳定（不易变异退化），以保证发酵生产和产品
质量的稳定性。 7、菌体不是病源菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。
三、发酵工业用菌种的分离与筛选
（一）微生物菌种分离
1、工业用菌种的来源 ：
有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或 购买；
收集到的样品，如含目标菌株较多，可直接进行分离。如果 样品含目标菌种很少，就要设法增加该菌的数量，进行增殖 (富集)培养。
富集培养就是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不 利于其它菌型生长的条件，以促使目标菌株大量繁殖，从而 有利于分离它们。
定义：利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养要求 的不同，如碳、氮源、pH、温度、渗透压、需氧等生理因素 等，认为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物生长， 而不利于其它种类微生物的生存，以达到使目的菌种占优势， 而得以快速分离纯化的目的。
培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、
培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品 种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH 值、提取工艺等。
菌种筛选主要步骤
调查研究及查阅充分的资 料
设计实验方案
确定采集样品的生态环境
菌种纯化是指在特定环境中只让1种来自同一祖先的微生物群 体生存的技术。
菌株分离、筛选虽为两个环节，但却不能绝然分开，因为分 离中的一些措施本身就具有筛选作用。工业微生物产生菌的 筛选一般包括两大部分：一是从自然界分离所需要的菌株， 二是把分离到的野生型菌株进一步纯化并进行代谢产物鉴别。
3、分离思路

发酵工程2发酵工业菌种(精)

发酵工程2发酵工业菌种(精)

增殖、纯化和性能测定。
1、样品的采集 采样原则： 材料来源越广泛，越有可能获得新的菌种。在一 些极端环境（高温、高压、高盐等），可找到能
适应苛刻条件的微生物类群。
了解目标产物的性质和可能产目标产物的微生物
种类及其生理特征，可提高效率，事半功倍。
2、样品的预处理 目的：提高菌种分离效率。
物理方法：热处理（用于减少样品中的细菌数）；
1、退化的表现
菌落和细胞形态的改变：如苏云金芽孢杆菌的芽
孢和伴孢晶体变得小而少； 生长速度缓慢，产孢子越来越少：如细黄链霉菌 的菌苔变薄、生长缓慢，不再产生典型而丰富的 橘红色分生孢子层；
代谢产物生产能力下降：如藤仓赤霉产赤霉素
能力下降；
抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温等）能力
的减弱。
4、菌种分离
平板划线分离法
稀释分离法 涂布分离法
5、菌种的筛选 对菌株的筛选必须要有一个好的方法（最 简单的方法）来加以鉴定，如颜色的变化、抑
菌圈、透明圈等。
四、发酵工业菌种鉴定
1、经典的分类鉴定方法
形态学特征： 生理生化特性： 血清学试验与噬菌体分型： 氨基酸顺序和蛋白质分析：
2、现代分类鉴定方法
2
思考题
发酵工业菌种
1、常见的工业微生物包括哪些类群？
2、作为工业生产菌株应具备哪些基本特性？ 3 、了解发酵工业中的细菌、酵母菌、霉菌、放 线菌及其生产的产品。 4、掌握菌种分离筛选的基本过程。
5、诱变育种及其原理。
6、常用的化学诱变剂。
7、菌种退化、原因与防治。
8、菌种保藏的方法。
广义的微生物：
现象。有些霉菌如用其分生孢子传代易于衰退，
而改用其子囊孢子接种，则能避免退化。 5）采用有效的菌种保藏方法

发酵工程第二章发酵工业菌种

发酵工程第二章发酵工业菌种



④抑菌圈法 抑菌圈法所用的工具菌是一些抗生素的敏 感菌。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌的平板培养基 上进行培养，若被检菌能分泌某些抑制工具菌生长的物 质，如抗生素等，就会在被检菌的菌落周围形成工具菌 不能生长的抑菌圈，从而使被检菌很容易被鉴别出来。 采用抑菌圈法，不仅能筛选抗生素，还能筛选某些酶类。 例如，Meevootison等提出一套利用抑菌圈筛选青霉素 酰化酶产生菌的方法。工具菌是一种对6-氨基青霉烷酸 敏感而对苄青霉素有抗性的黏性沙雷氏菌，这种菌只有 当苄青霉素尚未被别种微生物的青霉素酰化酶转化为6氨基青霉烷酸时才能生长。将工具菌与苄青霉素混合于 平板培养基中，然后将待检菌涂布于平板上，进行培养， 周围出现抑菌圈的菌落就是青霉素酰化酶产生菌。


③生长圈法 生长圈法所用的工具菌是一些营 养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工 具菌并缺少工具菌所需营养物的平板培养基上， 进行培养，若某菌株能合成工具菌所需营养物， 在该菌株的菌落周围就会形成一个浑浊的生长 圈。 例如，用嘌呤缺陷型大肠杆菌作为工具菌，与 不含嘌呤的培养基混合倒平板，在平板培养基 上涂布含菌样品并恒温培养，周围出现生长圈 的菌落即为嘌呤产生菌。
养后，在数量上占优势。
分离：利用分离技术得到纯种。 菌种的筛选： 通过常规生产性能测定，进一步筛选产物合成能
力较高的菌株。
发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养
特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、 耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。

菌种保藏
等。
第二节 发酵工业菌种的分离筛选
菌种的来源

根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种 保藏部门索取或购买；

发酵工程原理与技术第二章

发酵工程原理与技术第二章
前进
23
自然突变
多因素低剂量诱变效应：自然突变实质上是由一些原 因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，如宇宙 空间各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱 变物质以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物 质(如H2O2)的作用等。
24
自然突变
互变异构效应：五种碱基第六位上的酮基和氨基， G
之几到千分之几，淘汰为数众多的
野生型菌株，可达到“浓缩” 营养 缺
陷型的目的
方法：抗生素法或菌丝过滤法
返回
53
抗生素法
原理：抗生素只杀死生长中的细菌或真菌，在基本培 养基上加抗生素，将野生型细菌杀死，营养缺陷型不 死，从而来浓缩营养缺陷型
细菌 通常 青霉素 （抑制细胞壁的合成）
真菌
制霉菌素 （破坏真菌细胞膜）
第二章 发酵工业微生物菌种
制备原理和技术
1
第一节 发酵工业微生物菌种的选育
微生物的特性及工业微生物的要求 发酵工业微生物菌种的分离和选育 发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏
2
微生物的特性及工业微生物的要求
微生物的特性
有些微生物能在厌氧的条件下生长 有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身 的生长 有些微生物能进行复杂的代谢 有些微生物能利用较复杂的化合物 有些微生物能在极端的环境下生长
返回
54
菌丝过滤法
条件：丝状真菌和放线菌 原理：在基本培养基上野生型发育成菌丝而营养缺陷
型不能，培养一段时间后，用擦镜纸等合适滤 纸过滤，重复多次过滤除去大部分野生型个体。
返回
55
检出缺陷型
A夹层培养法 B逐个检出法 C影印培养法
返回
56
夹层培养法
方法：先倒一薄层不含菌MM，冷凝后加上一层混有经过 诱变处理的菌液的MM，再浇一薄层不含菌MM，“三明 治”，培养长出菌即野生型，在皿底做上记号，再倒第四 层CM培养，野生型继续繁殖，菌落变大，营养缺陷型开 始生长，菌落较小

发酵工程第二章发酵工业微生物菌种

发酵工程第二章发酵工业微生物菌种

李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
（一）采样
1、采样对象 以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽 土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的 土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果 生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐 败物品，某些水域等。
新种分离与筛选的步骤
（五）毒性试验 自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为 生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种， 更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆 壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒 性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的 毒性试验。
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
（三）培养分离
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂
李 先 磊
Fermentation Engineering
生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培 养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一 点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离 法。
李 先 磊
化学化工学院
新种分离与筛选的步骤
发 酵 工 程
Fermentation Engineering
李 先 磊
（二）增殖培养 为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物 至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择 性培养基，选择一定的培养条件来控制。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维 素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源， 那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常 生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样 对下阶段的纯种分离就会顺利得多。

第二章发酵工业微生物菌种ppt课件

第二章发酵工业微生物菌种ppt课件

2019
-
7
(1) 曲霉属(Asprgillus)：曲霉种类繁多、分布 广泛，工业上利用曲霉生产各种酶制剂和有机 (2) 青霉属（Penicillium）：j既是使果实腐 酸。如米曲霉（ Asp. oryzae）用于酿酒和L败和实物变坏的有害菌，又是青霉素后葡萄 乳酸生产。制酱油用的酱油曲霉以及制造柠檬 糖酸的产生菌。 酸、草酸、葡萄糖酸和糖化酶、酸性蛋白酶、 (3) 根霉属（Rhizopus）：用于米酒、黄 果胶酶、单宁酶等的黑曲霉 (Asp. niger)。 酒生产。此外，广泛用作淀粉糖化菌、有机 酸发酵以及甾体转化等许多方面。 (4) 毛霉属（Mucor）：产生蛋白酶，有分 解大豆蛋白的能力。腐乳、酱油、转化甾族 化合物。土曲霉：衣康酸
11
连续培养菌种的筛选 比生长速率(u):每克菌体每小时增长的 菌体量.u=1/XdX/dt.
2019
-
12
比生长速率u
A B
r
2019 -
基质浓度
13
限 制 性 基 质
当进行流加时基质浓度<r 时,A菌先被洗出; 当进行流加时基质浓度>r 时,,B菌先被洗出;
培养液
固体培养法
2019 14
2.随机分离方法 （1）.抗生素产生菌筛选 试验菌的灵敏性，以及与抗生素有关的酶、 酶的抑制剂（例如棒酸）、激活剂、抗体 等建立起来的高灵敏度、专一的检测技术。 （2）.药理活性化合物的筛选 （3）.生长因子产生菌的筛选 （4）.多糖生产菌的筛选 （5）.免疫激活剂产生菌的分离
2019
-
3
(3) 乳酸菌：由糖类生成乳酸的一类细菌总称为乳 酸菌，有乳链球菌和乳酸杆菌之分，主要用来制 造乳制品。凡发酵产物中只有乳酸者，称为同型 乳酸发酵；凡发酵产物中除乳酸外还有乙酸等和 CO2者，称为异型乳酸发酵。肠膜状明串珠菌属 于乳酸菌族，是制药工业生产有旋糖酐的重要菌。 (4) 大肠杆菌：工业上利用大肠杆菌的谷氨酸 脱羧酶，进行谷氨酸定量分析。还可以利用 大肠杆菌制取天冬氨酸、苏氨酸和缬氨酸等。 医药方面用它制造治疗白血症的天冬酰胺酶。 另外，在研究细菌遗传变异方面，以及构建 基因工程菌时，大肠杆菌是理想的研究材料。

【发酵工程】第二章_发酵工业菌种

【发酵工程】第二章_发酵工业菌种

第一节、发酵工业菌种概述


菌种是发酵工业的灵魂，它是决定发酵 产品是否具有产业化价值和商业化价值 的关键因素。 菌种早期从自然界筛选、分离得到，后 采用常规及现代育种技术选育。

1、细菌（单细胞原核微生物）



醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌 乳酸杆菌 枯草杆菌 丙酮丁醇梭菌 大肠杆菌 谷氨酸棒状杆菌
（5）菌种初筛和复筛


目的菌株的获得需要在菌种分离的基础上，进 一步筛选产物合成能力较高的菌株。即采用初 筛和复筛的方法。 初筛：从分离得到的大量微生物中将具有目的 产物合成能力的微生物筛选出来的过程。 初筛

平板筛选 摇瓶发酵筛选
平板筛选 对于分离到的大量菌种，进行粗放的检测方法， 筛选目的菌株。 如： 1）筛选水解酶菌种： 在培养基中加入该酶的底物作为唯一的碳源 或氮源，适温培养后，根据形成的水解圈和菌落 直径的大小判断产酶活力的大小。

极端菌的筛选要根据其特殊的生理特征：
高温酶产生菌—— 南方、温泉、火山爆发处及北方的 肥堆 耐压菌——油井或海洋深处

2) 采样对象
土壤、水、空气及枯枝落叶等，以土壤为主。
从土壤中采样要考虑土壤的以下特点： A 有机质含量和通风状况
耕地、菜园微生物多； 山坡上的森林微生物多；
沙土、无植被土壤、新开垦的生土、贫瘠的土地， 微生物少。

菌种保藏
（1）含微生物样品的采集
1）采样原则 样品来源广泛 根据代谢规律（所有菌初生代谢基本相同，次 生代谢不同，丝状菌、芽孢菌） 在已适应相当苛刻环境压力的微生物类群中 寻找新菌种 充分了解目标微生物的性质（种类、生理特 征等）

发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养

发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
孢子丝盘卷成球形孢囊，内形成孢酵母菌
单细胞真核，主 分布于含糖质较多的 偏酸性环境中，如水 果、蔬菜、花蜜和植 物叶子上，以及果园 土壤中。
1、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)
又称啤酒酵母。细胞多为圆形、 卵形，能产生子囊孢子。能发酵 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和半乳糖 等多种糖类，但不发酵乳糖和蜜 二糖。
5、白地霉 ( Geotrichum candidum )
➢ 节孢子单个或连接成链。
➢ 白地霉菌体蛋白营养价值很高，可供食用和饲 料用，也可用来提取核酸，在废料废水的利用上很 用价值。
6、产黄头孢霉 ( Cephalosporium chrysogen ) 头孢霉素、先锋霉素
3、游动放线菌属 （Actinoplanes）
➢ 一般不形成气生菌丝，孢子球形，有时端生1-40 根鞭毛，能运动。 ➢ 济南游动放线菌生产创新霉素(creatmycin; 1964).
4、诺卡氏菌属 (Norcadia)
➢ 菌落较小，边缘多呈树根 毛状。 ➢ 生产利福霉素、蚊霉素等
5、孢囊链霉菌属 (Streptosporangium)
4、青霉 ( Penicillum )
产黄青霉 ( Penicillum chrysogenum ) 生产青霉素，也可用来生产葡萄
糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏 血酸。
娄地青霉 ( Penicillum roqueforti ) 属不对称青霉组，具有分解油
脂和蛋白质的能力，用于制造干酪； 该菌孢子能将甘油三酯氧化为甲基 酮。
第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
第一节 发酵工业常用微生物 第二节 菌种来源 第三节 菌种选育 第四节 种子扩大培养 第五节 菌种保藏

《发酵工程》02 工业发酵菌种选育

《发酵工程》02 工业发酵菌种选育

（2）增殖培养
➢目的： 富集目的微生物，让目的微生物在种群中 占优势，使筛选变得可能。
富集方法 1、养分 3、培养时间
2、pH条件 4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、 液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。
（３）纯种分离
•
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例： 礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微 生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
• 细菌（bacteria）：常用的有枯草芽孢杆菌、 醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。
短杆菌：GA、Gln、lys…… 枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白酶等 地衣芽孢杆菌：HASS(耐高温α-淀粉酶) αAmylase 苏云金芽孢杆菌短：杆B菌T生物农药…棒…状杆菌 梭状芽孢杆菌：丙酮、丁y酸ea等sts的发酵
啤棒酒状酵杆母菌
• 酵母菌（yeast）：属单细胞真核生物，主 要分布于含糖较多的酸性环境中。常用的 有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。
啤酒酵母：酿酒、辅酶类物质的发酵
酒香酵母：酿酒
汉逊酵母：酿酒，用于乙酸乙酯的发酵
假丝酵母：单细胞蛋白生产，石油发酵
霉菌
• 霉菌（mould）：喜偏酸性环境。可用于生产多种 酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。
黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业、糖化酶 黄曲霉：酱油生产，面酱 青霉菌：青霉素的生产 红曲霉：红曲制造，南方红曲酒（女儿红）；红色；豆腐 乳 赤霉菌：赤霉素的生产

发酵工程第二章发酵工业微生物菌种

发酵工程第二章发酵工业微生物菌种
施加选择性压力分离法 随机分离法 这两种方法都是针对菌种从样品中分离所采用的
方法，实际发酵工业上菌种分离的步骤要有很多 步骤。
新种分离与筛选的步骤
定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长 培养特性。
采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为的通过控制养分或培养条件，使所需
菌种增殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包
工业上常用的微生物菌种
③ 霉菌： 工业上常用的霉菌有根霉、毛霉、红曲 霉、青霉等，主要生产酶制剂、抗生素、有机酸 和甾体激素等。
④ 放线菌： 工业上常用的有链霉菌属、小单胞菌 属和诺卡菌属，主要用于生产多种抗生素。
⑤ 担子菌： 即常说的蕈菌，主要用于生产多糖、 药物开发。
⑥ 藻类： 工业上常用的藻类有螺旋藻、单烈藻等， 主要用于生产食品，替代能源等。
新种分离与筛选的步骤
（三）培养分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物
的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在 这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一 步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分 离的方法有划线分离法、稀释分离法。
施加选择性压力分离法
施加选择性压力分离法：利用不同种类微生物生 长繁殖对环境和营养要求不同，人为控制这些条 件，使之利于某类或者某种微生物生长，不利于 其他微生物生存，以达到使目的菌占优势，从而 快速分离纯化的目的。
括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、 发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生 长和发酵最适温度、最适值、提取工艺等。
新种分离与筛选的步骤
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的 步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示一个试样 中所包含的所有微生物总数和种类。

【发酵工程】余龙江版-第2章-发酵工业菌种

【发酵工程】余龙江版-第2章-发酵工业菌种
在不同水体的水样中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白 质等，同样可以促进水中微生物的增殖。
培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。 另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌“附着材料”，如
无菌的植物组织或土壤浸出液。 通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性细菌、
中温菌和嗜高温菌。
次代培养及纯化步骤
1. 采样
(2) 采样对象
土壤、水、空气及枯枝落叶等，以土壤为主。
从土壤中采样要考虑土壤的以下特点：
① 有机质含量和通风状况
耕地、菜园 山坡上的森林
（有机质丰富、通气保水性能好）——细菌、放线菌
（有机质丰富、阴暗潮湿）——霉菌、酵母菌
沙土、无植被土壤、新开垦的生土、贫瘠的土地
——微生物少
② 取样的土层深度：5-25cm
3. 富集培养
富集培养的策略
（2）控制培养条件
➢ 溶氧浓度——好氧/厌氧 ➢ 高温——嗜热微生物 /非嗜热微生物 ➢ PH——嗜酸性/嗜碱性
4. 菌种分离
平板划线分离法 稀释分离法 毛细管分离法 小滴分离法
• 稀释倒 平板法
稀释分离法
• 平板 涂布法
注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。
1. 采样
③ 土壤的酸碱度
偏碱——细菌、放线菌 偏酸——霉菌、酵母菌
④ 土壤的植被状况
葡萄成熟时——根部酵母菌增多
⑤ 地理条件
南方土壤比北方土壤微生物含量多
⑤ 季节条件
秋季菜土样最理想
2.样品的预处理
（1）物理方法
热处理：根据目的菌较非目的菌的耐热性高 从而增加目的
菌的比例。
膜过滤法：浓缩水中的微生物细胞。 离心法：同上。
植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出 液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂 布平板。

微生物工程发酵第二章菌种制备原理与技术

微生物工程发酵第二章菌种制备原理与技术
• Saccaromyces cerevisiae • Pichia pastoris • Candida glabrata • C. tropicals • Phaffia rhodozyma • Yarrowia lipolitica
霉菌 • 主要生产：抗生素、有机酸、酶、色素； • Penicillium chrysogenum • Aspergillus niger • A. oryzae • Rhizopus oryzae
霉菌 （蜗牛酶或纤维素酶）
2.1.5 适应性进化（菌株驯化）
• Adaptive evolution 通过人工措施使微生物逐 步适应某一条件，而定向选育微生物的方 法；
• （柠檬酸）
2.1.6 菌种的保藏
• 保藏、退化、复壮
• 菌种的退化和防止
• 菌种退化：菌株由于移接传代或保藏之后， 群体中某些生理特征或形态特征逐渐减退 或完全丧失的现象，主要表现为生长速度 变慢和目标产物生产能力的下降；
分离筛选工作在实际中应用的几个方面
• 从被污染的生产及科研用菌中分离目的菌； • 生产中长期使用的菌种的定期分离筛选 ； • 从各种育种方法处理的微生物材料中分离筛选适于
工业目的的优良菌株 ； • 从已知菌种和大自然中分离新菌株
– 寻找新的发酵产品的产生菌； – 寻找老产品的新的优良菌株。
/jpkc
2.1 发酵工业微生物菌种
2.1.1概述 菌种是微生物工程的核心； 选育、保藏、复壮
2.1.2 发酵工业常用微生物种类 细菌 主要生产氨基酸、核酸、酶、多糖、有机酸等 常用菌种： Escherichia coli; Bacillus subtilis; Lactobacillus lactis; Corynebacterium glutamicum

第二章发酵工业微生物菌种制备原理和技术

第二章发酵工业微生物菌种制备原理和技术
（一）微生物菌种分离
1、工业用菌种的来源 ：
有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或 购买；
从大自然中分离筛选新的微生物菌种。 经过诱变的菌株； 通过DNA重组的工程菌； 原生质体融合菌株。
2、菌株分离（separation）和筛选（screening）定义
分离和筛选就是将一个混杂着各种微生物的样品通过分离技 术区分开，并按照实际要求和菌株的特性采取迅速、准确、 有效的方法对他们进行分离、筛选，进而得到所需微生物的 过程。
从自然界筛选
B、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。
C、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土， 取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或 塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境 条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类 型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离 。
采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为地通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖
培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、
培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品 种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH 值、提取工艺等。
第二章发酵工业微生物 菌种制备原理和技术
第一节 发酵工业微生物菌种的选育
一、工业微生物特点： 个体小 种类多 繁殖快 分布广 代谢能力强 易变异改造
带图象分析系统的微生物菌种显微观察装置
二、发酵工业生产对菌种的要求
1、能在易得、价廉的原料制成的培养基上迅速生长，且代谢产物产量高 。
2、可以在要求不高、易于控制的培养条件下迅速生长和发酵； 3、生长速度快，发酵周期较短。发酵周期短的优点在于感染杂菌的机会

发酵工程 第2章 发酵工业菌种PPT课件

发酵工程 第2章 发酵工业菌种PPT课件

lys.HCl 2.1 g/l
F6-16 (leu -, Thr -)
20.8 g/l
F9-50 (leu -, Thr -, AEC r)
33.5 g/l
42
代谢工程的定义
利用多基因重组技术有目的地对细胞代谢途径进 行修饰、改造，改变细胞特性，并与细胞基因调 控、代谢调控及生化工程相结合，为实现构建新 的代谢途径，生产特定目的产物而发展起来的一 个新的学科领域。
13
问题： 生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例：礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微生 物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
14
的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来筛选 高产菌。
28
放线菌的分离： 以产链霉素菌种的分离为例
（从退化菌种中筛选）
取工业发酵液（含孢子）样品1环 放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀
采用稀释法制平板，获取单菌落
根据高产菌的特点，选择目的菌落
筛ห้องสมุดไป่ตู้模型：形态依据
斜面保藏
高产菌恢复
放大培养，发酵液性能测试
物理：紫外，快中子
{ 诱变剂
化学：硫酸二乙酯，亚硝基胍
35
（一）、诱变剂的作用原理（略） （二）、诱变剂处理过程中几个有关的问题
化学诱变剂使用过程的安全性
亚硝酸：0.07MNa2HPO4 亚硝基胍：1MNaOH
诱变剂量的选择
诱变剂的选择 出发菌株的选择
36
（三）、诱变育种的一般步骤 (略)

第二章 微生物菌种制备原理与技术

第二章 微生物菌种制备原理与技术

4）保存期：1年以上。

冷冻干燥法
Hale Waihona Puke 1）方法 将菌种制成悬浮液，与保护剂(一般为脱脂牛奶或血 清等)混合，用低温酒精或干冰(－15℃以下)速冻，用真 空泵抽干，最后真空密封，低温保存。 2）范围：大多数微生物
3）优点：菌种不易发生变异
4）保存期：5-10年

液氮超低温保藏法
1）方法： 菌种加10％保护剂（甘油、二甲基亚砜），以 1℃/min速度降温到-35℃，置于液氮气相中（-196℃）保 藏。 2）优点：防止菌种退化最有效的方法

原理


挑选典型菌种的优良纯种，采用其休眠体
创造适合其长期休眠的环境条件
3.工业微生物菌种的保藏

方法

斜面低温保藏法
液体石蜡油保藏法
砂土管保藏法 冷冻干燥保藏法

液氮超低温保藏法

斜面低温保藏法
将微生物在适宜的斜面培养基和温度条件下培养并生 长良好后，放入4-5℃冰箱中保藏。
1）影响因素：菌种保藏培养基和培养条件




工业微生物获得途径

向菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株 由自然界采集样品，从中进行分离筛选 从一些发酵制品中分离目的菌株
从自然界分离筛选微生物的方法

含微生物样品的采集

一般土壤采集，注意有机质含量、通气情况、酸碱度、植被情况 等 控制培养基营养成分；控制培养条件；抑制不需要的菌类 稀释涂布和划线分离法 利用平皿中生化反应（透明圈、变色圈、生长圈、抑菌圈） 组织分离法 通过控制营养和培养条件分离 初筛、复筛
3）适用菌：适用于各种微生物保藏
3）保存期：永久。
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
的水生环境中生长
种类：分属于子囊菌纲、担子菌纲及半知菌 类，目前已知的酵母菌有56属，大约500多种， 与其他类群比，种类要少得多。
分布：酵母菌主要分布在含糖质较高的偏酸 性环境，诸如果品、蔬菜、花蜜和植物叶子上， 特别是葡萄园和果园的土壤中，因而称为糖菌 （Sugar fungus）。
裂殖酵母
5. 担子菌——蘑菇（mushroom）
6. 藻类
许多国家已把藻类作为人类保健食品和饲料。 螺旋藻
可通过藻类将CO2转变为石油；国外还有从“藻 类农场”获得氢能的报道。
三、工业微生物的来源
根据资料直接向有关科研单位、高等院校、工 厂或菌种保藏部门索取或购买 从发酵制品中分离目的菌株 自然界中分离筛选新的微生物菌种 菌种选育：自然选育、人工诱变、原生质体融 合、基因工程改造
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
我们的周围存在着多种多 样的微生物，它们和我们 的生活密切相关。
目前已知微生物约有10万种，分布在以下各界中：
原核生物界：例如细菌、蓝藻 真菌界：例如酵母菌 原生生物界：例如草履虫、变形虫 病毒：例如艾滋病毒、脊髓灰质炎病毒
发酵工业对菌种的要求
能在廉价培养基上迅速生长，目的代谢产物产量高 培养条件易于控制 生长速度和反应速度快，发酵周期短 满足代谢控制的要求 抗噬菌体和杂菌的能力强 遗传性状稳定，菌种不易变异退化 发酵过程产生泡沫少 对前体物质有耐受能力，不作为碳源利用 不是病原菌，不产生有害的生物活性物质
如何在后续的操作中使这种可能性实现？
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要 和基础的步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示 一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。
在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种 类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调 整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之 微生物相适应。
第二章 发酵工业微生物菌种
制备原理和技术
发酵工程 工业生产水平的
三个决定要素
ห้องสมุดไป่ตู้
生产菌种的性能 发酵和提取工艺条件 生产设备
获得优良的生产菌种是实现高水平发酵工程工 业生产的第一环节。
本章内容
第一节 发酵工业常用的微生物菌种 第二节 自然界中微生物菌种的选择性分离 第三节 微生物菌种的选育 第四节 微生物菌种的退化、复壮和保藏 第五节 工业微生物菌种的扩大培养 第六节 种子培养基及其制备
芽殖酵母
在现代分子和细胞生物学中用作真核模式生物，其 作用相当于原核的模式生物大肠杆菌
2001年诺贝尔生理学或医学奖
Leland H. Hartwell
首次将酵母作为模式生物进 行研究，是酵母基因学的奠 基人
在研究细胞周期的关键分子 调节机制领域作出了突出贡 献
用于制作面包和馒头等食品及酿酒
一、工业发酵常见微生物种类(熟悉)
➢ 细菌 ➢ 酵母菌 ➢ 霉菌 ➢ 放线菌
1. 细菌
（1）细菌的形态
球菌 杆菌 螺旋菌
双球菌
四联球菌
链球菌
葡萄球菌
细菌的特殊形态
（2）细菌的结构
（3）细菌的繁殖方式 以二分裂方式为主
细胞伸长 DNA复制 形成隔膜 子细胞分离
（4）工业上常用的细菌
醋酸杆菌（Acetobacter）
➢ 中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统
具有准确的转录后修饰功能； 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。
问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生
生产单细胞蛋白 毕赤酵母表达系统
Pichia 能够利用甲醇作为唯一碳源和能源的酵母菌。
3. 霉菌
霉菌属真核多细胞生物，又称丝状真菌，广泛的 分布于土壤、空气、水和生物体内，喜欢潮湿偏 酸环境。
霉菌（mould，mold）：不是分类学上的名词， 是丝状真菌的一个俗称，意即“会引起物品霉变 的真菌”，通常指那些菌丝体较发达又不产生大 型肉质子实体结构的真菌。
假单孢菌（Pseudomonas）
乳酸菌 大肠杆菌
模式生物
枯草芽胞杆菌
梭状芽孢杆菌
棒杆菌、短杆菌
大肠杆菌革兰氏染色
大肠杆菌扫描电镜照片
大肠杆菌透射电镜照片
2. 酵母菌
酵母菌（yeast）：一类单细胞真菌的通俗名称， 无分类学意义。 特点： ➢ 个体一般以单细胞存在 ➢ 能发酵糖类，产能 ➢ 喜在含糖量高、酸度较大
知识拓展：常用的基因表达系统
(一)原核生物：大肠杆菌(1977年Boyer)、枯草牙胞杆菌 沙门氏菌
生长迅速、蛋白产量高;
表达蛋白的纯化、分离及分析快速； 外源基因的导入相对容易； 已建立了整套表达理论及技术.
(二) 真核细胞表达系统
➢ 酵母(既是微生物又是真核细胞) 生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
物才具有大量表达的潜力。
例： 礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微生物 中，发现了三种有潜力的新抗生素。
第二节 自然界中微生物菌种的选择性分离
菌种分离与筛选的一般过程
样品采集 → 增殖培养 → 纯种分离→ 生产性能测定
目的：高效地获取高产目的产物的微生物？ 问题： 如何使样品中所含微生物的可能性大？
种类：分属于真菌界的藻状菌纲、子囊菌纲、 半知菌类。
✓ 菌落大、质地疏松、干燥、不透明、蛛网状、 绒毛状等，不易挑取。
✓ 菌落正面和反面颜色不一致：鉴定的显著特征。
4. 放线菌
呈菌丝状生长，主要以孢子繁殖和陆生性较强的 原核生物。
发酵工业中常用的放线菌
发酵工业中常用的放线菌主要用于生产抗生素 链霉菌属 土霉素：龟裂链霉菌 四环素：金霉素链霉菌 链霉素：灰色链霉菌 红霉素：红霉素链霉菌
因此，建立一更为科学的和针对性不强的分离方 法是必要的。
一、微生物样品的采集
人体农菌人消田落体化上数微系层与生统15空态中cm气中微处清微生微洁生物生度物群物的体的关含数(系个量量/g)