影响PCR实验技术因素的分析与探讨

影响PCR的主要因素PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。

引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作，PCR 自动热循环中影响因素很多,对不同的DNA样品,PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致.现将几种主要影响因素介绍如下.一、温度循环参数在PCR自动热循环中,最关键的因素是变性与退火的温度。

如操作范例所示，其变性、退火、延伸的条件是：94℃60s，37℃60s, 72℃120s，共25～30个循环，扩增片段500bp。

在这里，每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。

在自动热循环仪内由混合液原温度变至所要求温度的时间需要30～60s,这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、反应混合液体积、热源(水浴或加热块)以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视和考虑，对每一仪器均应进行实测。

关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远,合成靶序列全长所需的时间也越长，前文给出的反应时间是按最适于合成长度500bp的靶序列拟定的。

下面就各种温度的选择作一介绍。

1．模板变性温度变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链DNA模板，PCR也就不会启动。

变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因而减少产量。

一般取90～95℃.样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。

DNA变性只需要几秒种，时间过久没有必要;反之，在高温时间应尽量缩短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高变性温度不宜超过95℃。

2．引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA 扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配,非特异性产物增加。

PCR实验室污染与对策PCR（Polymerase Chain Reaction）实验室是进行核酸分析和生物学研究的重要场所。

然而，由于PCR实验室使用高灵敏度的技术，可能会受到外源性DNA污染的影响，导致结果的失真甚至错误。

因此，PCR实验室污染的问题需要引起重视，并采取相应的对策来减少对实验结果的影响。

外源性污染主要指的是在实验室环境中引入外部DNA污染源。

这些污染源可能包括实验室用具（如罗氏管、管盖、显微镜片等）、实验材料（如引物、模板DNA等）、工作人员（如手部皮肤上的DNA）以及空气中的微生物等。

为了减少外源性污染，可以采取以下对策：1.消毒和清洁实验室：实验室应定期进行彻底的清洁和消毒，包括工作台、工具和设备等。

使用消毒剂对工作台和设备进行彻底的消毒，防止污染源的交叉感染。

3.使用无DNA污染的试剂和材料：选用经过严格筛选和检测的PCR试剂和材料，确保其无DNA污染。

同时，使用专门为PCR实验设计和包装的罗氏管和管盖，减少外源性DNA污染的可能。

4.严格的实验室操作规范：建立和执行严格的实验室操作规范，包括实验室的通风设施、培训工作人员、制定标准操作流程等。

工作人员应按照规范操作，遵守实验室操作规程，确保实验的准确性和可靠性。

内源性污染是指实验过程中引入的内源性DNA污染。

内源性污染通常是由前一PCR扩增反应的产物污染了下一PCR反应。

1.严格控制实验操作的顺序：按照从低到高浓度的样品进行PCR扩增。

首先进行阴性对照，检测PCR反应体系中是否存在污染。

然后进行低浓度样品的扩增，最后进行高浓度样品的扩增，以减少内源性污染的可能。

2.应用反转录酶酶和RNA不是DNA模板：在RNA模板的PCR扩增反应中，可以使用反转录酶酶将RNA转录成cDNA。

由于RNA是DNA的模板，反转录过程不会引入外部DNA污染，从而减少内源性污染的可能。

3.使用消除污染酶：在每一PCR扩增反应中加入消除污染酶，可以在扩增反应结束后对DNA污染进行降解。

PCR实验常见失败原因、对策分析及体系优化PCR虽然为一个简单的实验,但在实际过程中可能会出现各种问题.产生问题的原因可能来源于以下几个方面：实验操作，试剂质量，PCR反应过程中各种试剂的含量,以及反应条件，温度设置等，本文对各个方面进行了讨论，大家遇到问题后可以对号入座的查一下.当然，具体问题的解决还依靠实验者就可能的原因逐项排除,并不断的摸索才能彻底解决.假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件.寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。

⑤模板核酸变性不彻底。

在酶和引物质量好时，不出现扩增带,极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改.酶失活：需更换新酶,或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性.需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭.引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。

有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为：①选定一个好的引物合成单位。

②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。

如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带.反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。

PCR常见问题分析及对策PCR常见问题分析及对策(无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性) 问题1：无扩增产物现象：正对照有条带，而样品则无原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发生降解4.反应条件：退火温度太高，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物4.降低退火温度、延长延伸时间问题2：非特异性扩增现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.酶量过多4.Mg2+浓度偏高5.退火温度偏低现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。

其对策有：①必要时重新设计引物。

②减低酶量或调换另一来源的酶。

③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。

④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。

其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。

其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。

②减少dNTP的浓度。

③适当降低Mg2+浓度。

④增加模板量，减少循环次数。

克隆PCR产物的最优条件是什么？最佳插入片段：载体比需实验确定。

1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。

应测定比值范围。

连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。

室温保温1小时，或4oC过夜。

在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。

室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4oC过夜。

PCR产物是否需要用凝胶纯化？如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。

如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。

分子实验——影响PCR扩增因素的分析PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用于分子生物学领域的实验技术，用于扩增目标DNA片段。

PCR扩增的效果受多种因素的影响，下面将对影响PCR扩增的因素进行分析。

首先是引物设计。

引物是PCR扩增的关键，它们在PCR反应中起到引导DNA合成的作用。

引物的设计需要考虑多个因素，包括引物长度、碱基互补性、引物浓度以及引物之间的相互作用等。

引物的长度应该在18-30个碱基对之间，太短会导致非特异性扩增，太长则可能会影响扩增效率。

引物的碱基互补性要求较高，避免自身结合形成二聚体或多聚体，影响PCR反应。

引物的浓度也需要优化，过高的浓度可能会导致引物的非特异性结合，而过低的浓度则可能会影响扩增效率。

此外，引物之间的相互作用也应该考虑，避免引物之间的二聚体或多聚体形成，会导致非特异性扩增。

其次是反应条件。

PCR反应需要一定的温度和时间条件。

PCR反应的温度包括变性温度、退火温度和延伸温度。

变性温度用于将目标DNA变性为单链DNA，一般设定为95℃，时间为1-5分钟。

退火温度应该合适，使引物与模板DNA特异性结合，一般设计退火温度为5℃低于引物的结合温度，时间为30-60秒。

延伸温度用于合成新的DNA链，一般推荐为72℃，时间根据目标片段长度决定，一般为每kb1-2分钟。

另外，PCR反应的循环次数也需要优化，过多会增加非特异性扩增的风险，过少则可能无法达到预期的扩增效果。

第三是DNA模板的质量和浓度。

DNA模板的质量和浓度对PCR扩增的效果有重要影响。

模板DNA的质量应该尽可能纯净，避免有附带的细菌DNA、RNA或PCR抑制物等。

有时，模板DNA的浓度也需要优化，过高或过低的浓度都可能会影响扩增效果，一般推荐的DNA浓度为10-100ng。

第四是酶的选择和浓度。

PCR扩增需要用到聚合酶，常用的酶有Taq聚合酶和Pfu聚合酶等。

Taq聚合酶具有耐高温的特性，适用于PCR反应的变性和延伸步骤，但是它的扩增精确度较低，容易引起突变。

pcr实验报告结论与心得PCR（聚合酶链反应）是一种基因分析技术，可以在试管中扩增DNA序列，从而提供大量的DNA样本进行分析。

在进行PCR实验后，我得出了以下结论和心得体会。

结论：1. PCR技术可以有效扩增DNA序列，使得小样本量的DNA得以被扩增，从而可以进行更加精细的分析。

2. PCR反应体系中各种试剂的配比和操作步骤的精准度对PCR反应效果有重要影响，因此需要精细的操作技巧和实验设计。

3. PCR反应过程中需要对PCR产物进行实时监测，以便及时对反应条件进行调整，从而获得更好的PCR扩增效果。

4. 在PCR反应过程中，需要防止样本的污染和交叉感染，以免影响PCR反应的准确性和可靠性。

心得：1. PCR实验需要精细的操作和实验设计，因此需要提前充分准备和规划，以确保实验顺利进行。

2. 在PCR反应过程中，实时监测PCR产物的扩增情况可以及时调整反应条件，从而获得更好的PCR扩增效果。

3. 在进行PCR实验时，需要防止样本的污染和交叉感染，尽量避免使用已被污染的试剂和工具，以确保PCR反应结果的可靠性。

4. 在进行PCR实验时，需要仔细阅读实验操作手册和相关文献，了解PCR反应的基本原理和应用技巧。

5. PCR技术在生命科学研究中具有广泛的应用前景，如基因诊断、病原体检测和种群遗传学研究等方面，因此具有重要的科学意义和实际应用价值。

总之，PCR实验是一项高精度的基因分析技术，可以为生命科学研究提供精细的DNA分析和检测手段。

在进行PCR实验时，需要认真掌握PCR反应的基本原理和应用技巧，避免样本污染和交叉感染，并及时调整反应条件，以获得更好的PCR扩增效果。

通过PCR实验的学习和实践，我对PCR技术的原理和应用有了更深入的了解和认识，以及更加实际的操作技巧和经验。

荧光定量PCR循环数过高的原因有哪些1. 引物浓度过高荧光定量PCR中的引物是扩增反应的关键因素之一。

引物浓度过高会使扩增反应过于强烈，导致循环数过高。

此时，扩增产物的数量超过荧光探针的检测范围，可能会造成信号饱和，使荧光定量PCR无法准确测量扩增产物的数量。

2. 模板DNA浓度过高在荧光定量PCR中，模板DNA的浓度也是影响循环数的重要因素。

当模板DNA浓度过高时，扩增反应容易在早期循环阶段就达到饱和状态。

这会导致扩增曲线的增长速度加快，循环数过高。

3. PCR反应体系不平衡荧光定量PCR反应体系中各组分的浓度和比例对循环数也有很大影响。

例如，核酸扩增酶的浓度过高或过低，引物浓度与模板DNA浓度的比例失衡等都可能导致循环数过高。

因此，在进行荧光定量PCR实验前，需要仔细优化反应体系，确保各组分浓度的合理选择。

4. PCR条件不准确温度条件是PCR反应的关键。

如果温度过高或时间过长，扩增反应速度会增加，导致循环数过高。

此外，反应体系的pH值也需要正确调整，否则会影响酶的活性和扩增效率，导致循环数异常增多。

5. 污染或杂质存在在荧光定量PCR实验中，常常会遇到来自污染或杂质的干扰。

例如，外源性DNA污染、核酸酶污染等都可能导致循环数过高。

在实验过程中，必须严格控制实验环境的洁净度，并采取必要的防护措施，避免污染的出现。

6. 存储条件不当PCR试剂盒和引物在存储过程中，被暴露在不适宜的温度或光照条件下，可能会导致其质量下降。

在使用PCR试剂盒和引物之前，必须确保其保存在适当的温度下，并检查是否存在明显的变质现象。

否则，这些因素都可能导致荧光定量PCR循环数过高。

7. 其他未知因素除了上述列举的原因外，仍有可能存在其他未知的因素。

由于荧光定量PCR是一种复杂的实验技术，涉及多个步骤和多个试剂，可能会出现其他影响循环数的因素。

因此，在进行荧光定量PCR实验时，需要综合考虑多种因素，并进行细致的实验操作和数据分析。

PCR检测常见问题与解决途径PCR 检测常见问题与解决途径利用 PCR 方法检测转基因成分时，经常出现假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带。

尤其是假阳性和假阴性可使检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。

为了提高转基因检测的准确性和可靠性，PCR 检测应尽量减少假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带现象的发生。

一个好的PCR 方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、重现性、鲁棒性，尽量减少假阳性、假阴性和非特异性扩增。

本文对 PCR 检测中出现的假阳性、假阴性、非特异性扩增和涂抹带的原因及其解决方法予以综述。

一、假阳性：（一）假阳性现象假阳性是指检测阴性材料得到阳性结果。

如果一次实验中的几个阴性对照中出现一个或几个阳性结果，提示本次实验中其它标本的检测结果可能有假阳性。

实验中设立的阴性对照可提示有无假阳性结果出现。

（二）造成假阳性的原因1.样品间交叉污染：样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；2.PCR 试剂的污染：主要是由于在 PCR 试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被 PCR 核酸模板污染。

3. PCR 扩增产物污染：这是 PCR 贝量大 (一般为 1013 拷贝 /ml)，远远高于物污染，就可形成假阳性。

反应中最主要最常见的污染问题。

因为PCRPCR 检测数个拷贝的极限，所以极微量的产物拷PCR 产4. 气溶胶污染：在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。

据计算一个气溶胶颗粒可含 48000 拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。

5.实验室中克隆质粒的污染：由于克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。

PCR常见问题分析及对策PCR常见问题分析及对策(⽆扩增产物、⾮特异性扩增、拖尾、假阳性)问题1：⽆扩增产物现象：正对照有条带，⽽样品则⽆原因:1.模板:含有抑制物，含量低2.Buffer对样品不合适3.引物设计不当或者发⽣降解4.反应条件：退⽕温度太⾼，延伸时间太短对策:1.纯化模板或者使⽤试剂盒提取模板DNA或加⼤模板的⽤量2.更换Buffer或调整浓度3.重新设计引物（避免链间⼆聚体和链内⼆级结构）或者换⼀管新引物4.降低退⽕温度、延长延伸时间问题2：⾮特异性扩增现象：条带与预计的⼤⼩不⼀致或者⾮特异性扩增带原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过⾼3.酶量过多4.Mg2+浓度偏⾼5.退⽕温度偏低6.循环次数过多对策：1.重新设计引物或者使⽤巢式PCR2.适当降低模板或引物浓度3.适当减少酶量4.降低镁离⼦浓度5.适当提⾼退⽕温度或使⽤⼆阶段温度法6.减少循环次数问题3：拖尾现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

原因：1.模板不纯2.Buffer不合适3.退⽕温度偏低4.酶量过多5.dNTP、Mg 2+浓度偏⾼6.循环次数过多对策：1.纯化模板2.更换Buffer3.适当提⾼退⽕温度4.适量⽤酶5.适当降低dNTP和镁离⼦的浓度6.减少循环次数问题4：假阳性现象：空⽩对照出现⽬的扩增产物原因：靶序列或扩增产物的交*污染对策：1.操作时应⼩⼼轻柔，防⽌将靶序列吸⼊加样枪内或溅出离⼼管外；2.除酶及不能耐⾼温的物质外，所有试剂或器材均应⾼压消毒。

所⽤离⼼管及加样枪头等均应⼀次性使⽤。

3.各种试剂最好先进⾏分装，然后低温贮存琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物⼀．原理DNA⽚断的分离与回收是基因⼯程操作中的⼀项重要技术，例如可收集特定酶切⽚断⽤于克隆或制备探针，回收PCR产物⽤于再次鉴定等。

回收实验中两个最重要的技术指标是纯度和回收率：前者未达标时会严重影响以后的酶切、连接、标记等酶参与的反应；后者不理想时往往会⼤⼤增加前期的⼯作量。

荧光定量PCR实验的影响因素小结引物的设计和选择符合荧光PCR的探针并进行设计对于实时荧光PCR尤其重要。

可以说，不合理的设计意味着绝对的失败。

但是，好的设计并不等于好的实验结果，影响PCR和荧光PCR的因素非常多，下面择其重要进行介绍。

1、引物退火温度引物的一个重要参数是熔解温度（Tm）。

这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。

Tm对于设定PCR退火温度是必需的。

在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。

合理的退火温度从55℃到70℃。

退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。

设定Tm有几种公式。

确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。

大部分计算机程序使用近邻分析法——从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。

所有oligo软件会自动计算引物的Tm值。

在设置退火温度时可以如下进行：以低于估算的Tm5℃作为起始的退火温度，以2℃为增量，逐步提高退火温度。

较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。

为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。

引物对的Tm差异如果超过5℃，就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。

如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。

或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后再根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。

这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

2 、引物浓度引物的浓度会影响特异性。

最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。

较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。

为了确定引物浓度，可以在260nm（OD260）测量光密度值。

然后使用光吸收值和微摩消光系数的倒数（nmol/OD），通过Beers 法则（公式1）计算引物浓度。

微摩消光系数可以使用公式2计算。

与大分子双链DNA可以使用平均消光系数不同，确定引物的精确浓度必须使用计算的消光系数。