高效液相色谱法测定油脂中β-谷甾醇的含量

高效液相色谱法测定油脂中β-谷甾醇的含量

邱丰艳;丁力;曹红云

【摘 要】建立了高效液相色谱法准确、高效测定油脂混合体系中β-谷甾醇含量的方法，并对油脂混合物中β-谷甾醇的提取工艺进行了优化。采用C18反相色谱柱对β-谷甾醇含量进行测定，流动相为甲醇-水(体积比98．5：1．5)，检测波长210 nm。结果表明：β-谷甾醇在25~500μg/mL范围内，质量浓度与峰面积呈良好的线性关系(R2=0．9998)，仪器检出限为7．5μg/mL，相对标准偏差(RSD)为0．85%；油脂混合物中β-谷甾醇的最佳提取工艺条件为提取次数4次，离心转速2000 r/min，皂化温度80℃，皂化时间210 min；在最佳提取工艺条件下β-谷甾醇的回收率为93．44%~96．48%，RSD为1．70%。%The accurate and

efficient method for determing β-sitosterol content of oil mixture by HPLC

was established,and the extraction process of β-sitosterol from oil mixture

was optimized. C18 reverse-phase chromatography column was used for

the determination ofβ-sitosterol content under the conditions of mobile

phase methanol - water (volume ratio 98. 5:1. 5 ) and detection wavelength

210 nm. The re-sults showed that the mass concentration of β-sitosterol

had a good linear relationship with peak area in the range of 25-500μg/mL.

The correlation coefficient, the instrumental limit of detection and the rela-tive standard deviation (RSD) were 0. 999 8, 7. 5 μg/mL and 0. 85%

respectively. The optimal extrac-tion conditions of β-sitosterol from oil

mixture were obtained as follows:extraction times four, centrifugal speed 2

000 r/min, saponification temperature 80℃ and saponification time 210 min. Under these conditions,the recovery rate and RSD of β-sitosterol were

93. 44% -96. 48% and 1. 70%, respectively.

【期刊名称】《中国油脂》

【年(卷),期】2014(000)007

【总页数】5页(P91-94,95)

【关键词】HPLC;β-谷甾醇;油脂混合物

【作 者】邱丰艳;丁力;曹红云

【作者单位】龙岩学院 生命科学学院，福建 龙岩364012;龙岩学院 生命科学学院，福建 龙岩364012;龙岩学院 生命科学学院，福建 龙岩364012

【正文语种】中 文

【中图分类】TS225.1;TQ646

β-谷甾醇是天然植物脂质中分布最广的甾醇类物质，具有良好的生理活性和安全性，不仅可降低人体对胆固醇的吸收，还可降低血浆中总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量[1-3]。2000年美国食品和药品管理局(FDA)通过了对植物甾醇的健康声明[4]；在欧洲，植物甾醇已被广泛使用于涂抹脂、乳酪、牛奶等多种功能性食品中[5]；2010年卫生部允许β-谷甾醇及其甾醇酯作为新资源食品在食品中添加。β-谷甾醇作为新资源食品或功能性食品添加物的应用前景日益广阔[6-8]，但缺少针对不同β-谷甾醇含量的油脂基料及含水分或乳化剂的油脂混合体系中的β-谷甾醇添加量的研究。

目前，植物甾醇类物质的测定方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、薄层色谱法(TLC)[9-11]。其中GC需要用BSTFA+TMCS试剂对样品进行复杂的衍生化处理，样品检测较为耗时、试剂毒性大、检测成本高[6,10]；TLC对β-谷甾醇的测定精密度低，重复性差；HPLC不需要进行样品衍生化处理，检测准确度较高[12]。

本实验选取了原料中不含β-谷甾醇的棕榈油和含有β-谷甾醇的玉米油为基料，用HPLC测定β-谷甾醇含量，探索含有水分和乳化剂的油脂体系中β-谷甾醇的提取工艺流程，优化提取次数、离心转速、皂化温度和皂化时间对油脂混合体系中β-谷甾醇提取率的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

油脂混合物：自制，其组成为植物油基料(棕榈油和玉米油)、水、β-谷甾醇和乳化剂，其中水分含量为20%，乳化剂添加量为2%；β-谷甾醇标准品(纯度≥98%)，上海晶纯试剂有限公司；石油醚(AR)，氢氧化钾(AR)，甲醇(HPLC)，二氯甲烷(HPLC)，无水乙醇(HPLC)。

1.1.2 仪器与设备

611DI超纯水机，德国Sartorius Arium公司；Agilent 1200型高效液相色谱仪，配有紫外检测器，美国安捷伦公司；SB-1000旋转蒸发仪，东京理化器械株式会社；BS124S电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；CF16RX-Ⅱ高速冷冻离心机，日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 HPLC测定β-谷甾醇的条件

Thermo Scientific Hypersil BDS C18反相色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-水(体积比98.5∶1.5),检测波长210 nm(0～25 min),柱温50℃；流速1.0 mL/min，进样量10 μL，以1 mg/L β-谷甾醇甲醇溶液进行外标法定量[10,13]。

1.2.2 标准曲线的绘制

采用甲醇对β-谷甾醇标准溶液逐级稀释后，配制质量浓度分别为25、62.5、125、250、500 μg/mL的标准工作液。以标准工作液的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.3 油脂混合物中β-谷甾醇的提取

对杨虹等[10]建立的方法进行了改良：称取油脂混合物1.00 g(精确到0.1 mg)置于碘量瓶中，加入5 mL 氢氧化钾-无水乙醇溶液，80℃水浴加热皂化210 min，然后加入5 mL饱和氯化钠，将皂化液转移至50 mL离心管中，用石油醚对皂化液进行多次提取，每次添加石油醚30 mL，以2 000 r/min离心10 min。将上层的石油醚提取液合并，用蒸馏水洗至中性，用无水硫酸钠脱水后过滤，在旋转蒸发器中蒸干，得到的不皂化物加入二氯甲烷-甲醇(体积比1∶9)溶解，转移至50 mL容量瓶中定容，用一次性注射器吸取1 mL过0.45 μm有机微孔滤膜后，进行HPLC测定。设置3组平行实验，所得实验数据运用Origin 8.0数据分析软件进行分析处理。

1.2.4 β-谷甾醇回收率的计算

β-谷甾醇回收率

式中：m1为油脂混合物质量，g；c1为油脂混合物中β-谷甾醇的添加量,mg/g；m2为基料油质量，g；c2为基料油中β-谷甾醇的含量，mg/g;c3为油脂混合物中β-谷甾醇的提取量，mg/g。

2 结果与讨论

2.1 HPLC测定β-谷甾醇含量

2.1.1 β-谷甾醇的HPLC图谱 分别对β-谷甾醇标准品和油脂混合物中不皂化物进行HPLC测定，结果如图1所示。

图1 β-谷甾醇标准品(A)和油脂混合物中不皂化物(B)的HPLC图谱

由图1可知，油脂混合物(B)中β-谷甾醇的保留时间(13.589 min)与β-谷甾醇标准品(A)一致，峰形对称，分离效果良好。

2.1.2 β-谷甾醇标准曲线与检出限

按照1.2.2方法绘制标准曲线得到的线性回归方程为y=2 167x+8 714.5，在测定范围内(25～500 μg/mL)线性相关系数为0.999 8，线性关系良好，可依据此方程进行定量分析。以25 μg/mL的β-谷甾醇甲醇溶液进样测定，仪器的信噪比(S/N)为10，取S/N=3作为检出限计算标准，得到仪器检出限为7.5 μg/mL。

2.1.3 仪器精密度和准确度

用250 μg/mL β-谷甾醇甲醇标准工作液连续上样6次，相对标准偏差(RSD)为0.85%，表明仪器精度良好。在油脂混合物中添加β-谷甾醇标准品，当添加量在25～500 μg/mL时，油脂混合物中β-谷甾醇的加标回收率为89.2%～98.4%，RSD为0.8%～1.2%，精密度和加标回收率均能够满足日常工作的要求。

2.2 油脂混合物中β-谷甾醇提取工艺单因素实验

2.2.1 提取次数对β-谷甾醇提取量的影响

根据1.2.3，考察提取次数对β-谷甾醇提取量的影响，结果见图2。

图2 提取次数对β-谷甾醇提取量的影响

从图2可知，随着提取次数的增加，β-谷甾醇的提取量呈增加趋势，当提取次数达到4次后，β-谷甾醇的提取量变化幅度甚小，趋于平衡。因此,选择最佳提取次数为4次。

2.2.2 离心转速对β-谷甾醇提取量的影响 根据1.2.3，在提取次数为4次时，考察离心转速对β-谷甾醇提取量的影响，结果见图3。

图3 离心转速对β-谷甾醇提取量的影响

由图3可知，当离心转速达到2 000 r/min时，β-谷甾醇的提取量最高；而当离心转速低于或高于2 000 r/min时，β-谷甾醇的提取量均减小。因此,选择最佳离心转速为2 000 r/min。

2.2.3 皂化温度对β-谷甾醇提取量的影响

根据1.2.3，在提取次数为4次、离心转速为2 000 r/min时，考察皂化温度对β-谷甾醇提取量的影响，结果见图4。

从图4可知，随着皂化温度的升高，β-谷甾醇的提取量先升高后降低；当皂化温度为80℃时，皂化温度略高于氢氧化钾-无水乙醇溶液的沸点，皂化效果最佳，β-谷甾醇的提取量最高；而当皂化温度过高时，β-谷甾醇会部分氧化分解而导致提取量逐渐下降，这与文献[14]报道结果一致。因此,选择最佳皂化温度为80℃。

图4 皂化温度对β-谷甾醇提取量的影响

2.2.4 皂化时间对β-谷甾醇提取量的影响

根据1.2.3，在提取次数为4次、离心转速为2 000 r/min、皂化温度为80℃时，考察皂化时间对β-谷甾醇提取量的影响，结果见图5。

图5 皂化时间对β-谷甾醇提取量的影响

从图5可知，随着皂化时间的延长，β-谷甾醇的提取量先逐渐增加；当皂化时间达到210 min时，β-谷甾醇的提取量最大；继续延长皂化时间，β-谷甾醇由于部分氧化分解而导致提取量呈现下降趋势[14]。因此,选择最佳皂化时间为210 min。

2.3 油脂混合物中β-谷甾醇提取工艺正交实验优化

根据单因素实验结果，当提取次数为4次时，选用L9(33)正交表进行正交实验优化，正交实验因素及水平见表1，正交实验结果见表2。