4H2在褐飞虱的原位杂交分析

4H2在褐飞虱的原位杂交分析摘要本研究采用原位杂交技术，对褐飞虱取食抗虫和感虫水稻后，其唾液腺基因表达发生明显变化的4H2基因进行表达分析，分析该基因产生在褐飞虱体内的具体位置。

采用将带有靶序列和SP6、T7启动子的PGEM-T-4H2质粒转入大肠杆菌DH-5α，通过氨苄青霉素抗性筛选得到重组质粒，并以ScaI限制性内切酶酶切并且纯化后得到的线性化质粒为模板，DIG RNA Labeling Mix为底物，经T7、SP6聚合酶体外转录，分别制得DIG标记的正义链和反义链RNA探针，最后进行靶基因在褐飞虱的原位杂交定位。

结果显示，4H2基因在褐飞虱的脂肪体和唾液腺表达。

与其作为卵黄蛋白在脂肪体合成卵黄，并进一步转运到卵中的作用相一致，本研究结果对于进一步分析4H2基因产物在水稻与褐飞虱互作中是否作为激发子奠定了基础。

关键词褐飞虱；原位杂交；RNA探针；石蜡切片Location of 4H2 gene in the brown planthopper tissues by RNAin-situ hybridizationHuanghanlinSchool of Life Sciences，Guangzhou UniversityAbstract: 4H2 was studied in brown planthopper(BPH) tissues by RNA in-situ hybridization because of its expression remarkable changed, when feeding the BPH-resistant rice and BPH- susceptible rice type. PGEM-T-4H2 with target sequences and SP6, T7 promoters was transfered into the Escherichia coli DH-5α, and screened recombinant plasmids by ampicillin resistance; using the product of ScaI restriction and purification as the template, the DIG RNA Labeling Mix as the substrate, through in-vitro transcription by the T7, SP6 polymerase, producing the positive-sense strand marked by DIG and the antisense strand RNA probe respectively, and then finally, it applies the in-situ hybridization technique to locate the target genes in the rice brown planthopper. The result showed that 4H2 gene expressed in the fat body and the salivary glands of the brown planthopper. It has the same role as a yolk protein becoming yolk in the fat body, which is further transported to the egg, the results of this study lay the foundation for further analysis of whether gene 4H2 is acted as elicitors in rice brown planthopper interactions.KEY WORDS the brown planthopper; in-situ hybridization; paraffin section目录1前言 (1)2材料与方法 (2)2.1 材料 (2)2.1.1 材料 (2)2.1.2 试剂 (2)2.1.3 仪器 (2)2.1.4 试剂配制 (2)2.2 方法 (4)2.2.1 组织切片的制备 (4)2.2.1.1 材料的固定 (4)2.2.1.2 材料的脱水 (5)2.2.1.3 材料的浸蜡 (5)2.2.1.4 材料的包埋 (5)2.2.1.5 组织切片的制备 (5)2.2.2 探针的制备 (6)2.2.2.1 感受态细胞的制备 (6)2.2.2.2 转化反应及单菌落的培养 (6)2.2.2.3 提取质粒 (6)2.2.2.4 酶切质粒 (7)2.2.2.5 酶切产物的纯化 (7)2.2.2.6 地高辛标记探针的制备 (7)2.2.3 杂交实验 (8)2.2.3.1 预杂交 (8)2.2.3.2 杂交 (8)2.2.3.3 杂交后处理 (8)2.2.3.4 免疫反应 (8)2.2.3.5 显色反应 (8)2.2.4 封片观察 (9)3结果与分析 (9)3.1 PMD20-T-4H2和PMD20-T-4H6的提取、酶切和检测 (9)3.2 酶切产物的纯化和检测 (10)3.3 4H2基因在褐飞虱的原位杂交结果 (10)4 讨论 (11)参考文献 (12)致谢 (13)1 前言褐飞虱是危害水稻生长的主要害虫之一[1]，而水稻是我国最主要粮食作物之一，其产量的大小对国家的发展存在着不可或缺的影响。

褐飞虱主要吸食水稻的维管组织汁液，导致其叶片的水分含量和叶绿素含量的降低，并使叶片内蛋白质分解加剧等问题[2]，最终导致水稻生长缓慢，产量降低，所以对水稻抗褐飞虱的研究显得十分的重要。

指导教师王小兰通过构建褐飞虱唾液腺的抑制差减杂交文库，得到37个表达特异的基因，而4H2基因由于表达量明显而选择进行原位杂交分析。

原位杂交开始于60年代[3]，最初使用放射性同位素标记探针进行杂交，直到80年代中期出现了非放射性标记的原位杂交，其发展一次比一次定位准确及灵敏度更高[4]。

原位杂交作为核酸分子杂交基础上产生的一项技术，能在保存组织、细胞形态的情形下原位探测DNA或RNA，已经发展成为许多领域的重要研究手段。

主要用于3个方面的研究：1、DNA或RNA病毒的检测；2、基因的细胞、染色体的定位；3、基因表达水平及细胞分化关系的研究[5]。

原位杂交是以碱基配对的基本原则，将核酸探针用放射性或非放射性的物质标记后与组织切片上的变性单链DNA或RNA进行互补使其特异结合成专一的核酸分子，并通过特定的检测系统检测最终显示出待测核酸在组织中的某些位置。

主要步骤一般分为4步，包括组织切片的制备、探针制备、探针和组织切片的杂交、探针的检测[6]，整个过程中都要避免RNA酶的存在，否则将会影响杂交结果。

原位杂交主要分为三大类，包括RNA-RNA原位杂交，DNA-DNA原位杂交和DNA-RNA原位杂交，其中RNA原位杂交经常用于检测某种特定基因的mRNA在动物及植物组织中分布状况[7]。

4H2基因片段701bp，通过blastX查找，其与褐飞虱的编码卵黄蛋白的基因同源性达89%。

卵黄蛋白是在脂肪体合成后转运到虫卵中，但通过唾液腺差减杂交文库筛选发现此基因在唾液腺中高表达，同样的，Hiroaki Noda等[8]（2008）在分析褐飞虱各种组织文库时也发现大量类卵源蛋白基因在唾液腺中表达，而在虫卵文库中却没有发现此基因的表达。

因此，进一步对4H2进行组织特异性的基因表达分析是非常有必要的，可以为发现该基因的作用提供理论基础。

本实验采用了RNA组织原位杂交，即用标记了的单链反义RNA作为探针，对褐飞虱的4H2基因表达的mRNA或rRNA进行杂交定位，最终确定该基因表达的空间位置。

其中探针使用了非放射性的地高辛标记，可以使杂交反应更安全，同时具有实验周期短、检测信号强、杂交特异性高、灵敏度高、交结果分辨率更高等特点[9]。

2 材料与方法2.1材料2.1.1材料褐飞虱、大肠杆菌菌株DH-5α、PGEM-T-4H2连接产物、石蜡2.1.2试剂ScaI限制性内切酶、Sp6聚合酶、T7聚合酶、多聚甲醛、乙醇、叔丁醇、甘油、氨苄青霉素、琼脂、溴化乙锭、RNasesin、5xbuffer、10xbuffer、DNaseI、二甲苯、氯仿、异戊醇、浓HCl、DEPC、酵母提取物、蛋白胨、NaCl、KH2PO4、KCl、NaOH、CaCl2、LiCl、甲酰胺、葡聚硫酸脂、柠檬酸钠、TritonX-100、显色剂、牛血清蛋白、中性树脂、2.1.3仪器玻璃针筒、烧杯、烘箱、切片机、酒精灯、载玻片、盖玻片、包埋纸盒、铁丝、解剖刀、小木块、锥形瓶、恒温培养箱、摇床培养箱、超净工作台、天平、离心机、移液枪、涂布棒、培养皿、离心管、恒温水浴锅、电泳槽、显微镜、电炉、电磁炉、高压灭菌锅、染缸、玻璃棒、量筒、试管、记号笔、标签纸、锡箔纸2.1.4试剂配制1)PBS缓冲液0.2g KCl，0.2g KH2PO4，8.0g NaCl，1.56g Na2HPO4·2 H2O或 3.14gNa2HPO4·12H2O，调pH至7.4，用DEPC-H20定容至1L，配置过程中应待前一种成分完全溶解后再溶解下一种成分，充分混匀后，121℃,高温高压灭菌20min2)DEPC-H21mLDEPC溶于1L ddH20，摇匀，过夜后灭菌3)LB培养基1g蛋白胨，0.5g酵母提取物，1g NaCl，1.5g琼脂（配固体时加），用NaOH调pH至7.0，然后ddH2O定容至100mL，121℃，高温高压灭菌20min4)0.1M CaCl2溶液1.47g CaCl2溶于100mLddH2O，121℃高温高压灭菌20min5)溶液I50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl（pH8.0），10mM EDTA（pH8.0)6)溶液II0.2M NaOH，1％SDS7)溶液III5M乙酸甲（60mL），乙酸（11.5mL），ddH2O（28.5mL）8)氯仿：异戊醇（24:1）24mL氯仿，1mL异戊醇，混匀，4℃保存9)DIG RNA Labeling Mix10μL rATP，10μL rCTP，10μL rGTP，10μL DIG-rUTP，混匀，-20℃保存10)0.5M EDTA186.1g EDTA-Na·2H20，20g NaOH，调pH至8.0，用ddH20定容至1L11)10％SDS10g SDS溶于100mLddH20，室温保存12)0.2mol/L HCl17mL HCL，9983mL DEPC-H2O，混匀，4℃保存13)2 0x SSPE175.3g NaCl，27.6g NaH2PO4，7.4g EDTA，调pH至7.4，用DEPC-H20定容至1L14)1M Tris-Cl12.11gTris碱溶于80mL DEPC-H2O，用HCl调pH至9.5，定容至100mL，高压灭菌后保存15)杂交缓冲液125μL 10x盐，500μL甲酰胺，250μL 50％葡聚硫酸脂，4μL酵母RNA，2.5μL 100mmLDTT，用DEPC-H2O定容至1mL,现配现用16)探针稀释液100μL 50％甲酰胺，2μL 1mDTT，198μL DEPC-H2O,混匀，现配现用17)20 x SSC（pH7.0 1L）175.3g NaCl，88.2g柠檬酸钠，调pH至7.0，用DEPC-H2O定容至1L18)缓冲液I（pH7.5）100mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl19)缓冲液II（pH9.5）100mM Tris-HCl，100mM NaCl，50mM MgCl220)缓冲液III（pH 8.0）10mM Tris-HC，1mM EDTA21)封阻液0.06g牛血清蛋白（BSA），9μL TritonX-100，用缓冲液I定容至3mL22)稀释的anti-DIG-AP0.01g牛血清蛋白（BSA），1.5μL TritonX-100，2μL Anti-DIG-AP，用1 x PBS缓冲液定容至1mL23)显色液1片显色剂溶解于10mLddH2O，分装到2mLEP管，用锡箔纸包裹保存于4℃24)10x盐3mol/L NaCl，0.1mol/L Tris-HCl，0.1mol/LNa2HPO4，50mmol/L EDTA25)1M DTT（pH5.2）0.309g DTT溶于1.8mL乙酸钠，调pH至5.2，定容到2mL26)50xTAE电泳缓冲液242gTris碱，57.1mL冰乙酸，100mL0.5M EDTA（pH8.0）2.2方法2.2.1组织切片的制备2.2.1.1材料的固定1)用试管收集水稻上的褐飞虱，然后倒入装有4％多聚甲醛固定液的玻璃针筒中使用针筒来回抽气，抽除褐飞虱体内的气体，直至褐飞虱全部沉入固定液底部2)将抽完气的褐飞虱置于装有固定液的烧杯中，4℃过夜固定2.2.1.2材料的脱水1)将固定液倒掉，并用1XPBS缓冲液洗涤材料三次，每次10min2)叔丁醇七步脱水，按以下浓度级别和时间对材料进行脱水表1 七步脱水浓度梯度浓度级别 1 2 3 4 5 6 7 95％乙醇40 50 50 40 25 0 0（mL）DEPC-H2050 30 15 5 0 0 0（mL）100％叔丁醇10 20 35 55 75 100 100（mL）脱水时间（h）12 10 5 4 3 1 0.62.2.1.3材料的浸蜡1)脱完水的材料转入另一装有100％叔丁醇的烧杯中，并置于60℃烘箱中。