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植物抗病基因作用机理及克隆研究进展袁亮1,2,张伟彬1,2(1.商丘职业技术学院农学系,河南商丘476000;2.安徽农业大学研究生学院,安徽合肥230069)摘要 综述了植物抗病基因作用机理及抗病蛋白的类别,介绍了克隆植物抗病基因的不同方法,同时对植物抗病基因克隆提出了展望。
关键词 植物抗病基因;作用机理;同源结构域;克隆中图分类号 S432.2+3 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)04-01513-03Functi onalM echanis m a nd Cloni ng of P l ant D isease resi stance Gene YUAN L i ang et al (D epart ment ofA gronomy ,Shangqiu Vocati onal College of Technology ,Shangqiu ,H enan 476000)Abstract The f uncti ona lmechanis m and cl asses of pl ant disease resistance genes were s u m up .The vari ed clone methods of p l ant di sease resistance genes were i ntroduced and the outl ook o f cl one pl ant disease resistance genes was put for ward .K ey words P lant d i sease resi st ance gene ;Functi ona lmechanis m;Conservati ve doma i n ;C l one作者简介 袁亮(1982-),男,安徽涡阳人,在读硕士,助教,从事农业生物技术方面的研究。
收稿日期 2008 11 12随着世界人口的迅速增长,粮食问题已成为人类生存的关键问题。
⽣物信息学论⽂⽣物信息学课程论⽂⼀个⽟⽶ Mlo 基因的电⼦克隆与⽣物信息学分析姓名：学号：班级：⽣科2班⼀个⽟⽶ Mlo 基因的电⼦克隆与⽣物信息学分析摘要：Mlo 基因家族在植物抗病⽅⾯有极⼤的优势，但有些 Mlo 基因的功能还未知。
经序列拼接电⼦克隆得到 1 个⽟⽶的 Mlo 基因，采⽤⽣物信息学⽅法预测分析了编码蛋⽩的⼀、⼆、三级结构，并对其功能进⾏了预测。
结果表明：⽟⽶ Mlo 基因编码的蛋⽩有⼀个保守的 DUF1084 结构域，此结构域功能在植物中尚未知。
⽣物信息学分析表明，此蛋⽩很可能是⼀种类似于 G 蛋⽩偶联受体的膜结合转运蛋⽩⽽参与到信号传递过程中。
关键词：⽟⽶；Mlo 基因；电⼦克隆；⽣物信息学植物在长期的⽣物进化中形成了⼀系列复杂⽽严密的防御机制，使⾃⾝免受病原物的侵害[1，2]。
抗病基因是植物防御体系中的最重要组成部分。
Mlo 基因最初在⼤麦中被发现，这类基因在植物中编码⼀个七次跨膜结构域的蛋⽩家族，可能起到与 G 蛋⽩偶联受体(G Protein Coupled Receptor，GPCR)类似的功能。
他们的拓扑结构、亚细胞定位和序列多样化与动物和真菌的 G 蛋⽩偶联受体很相似。
野⽣型 mlo 基因赋予⼤麦对⽩粉菌的⼴谱抗性[3]。
⽩粉病是由⽩粉菌引起的真菌性病害，⽩粉菌能侵染650 多种单⼦叶植物和 9 000 多种双⼦叶植物[4，5]。
⽬前已对拟南芥、⽔稻和杨树中的 Mlo 基因家族有深⼊的研究[6]。
电⼦克隆法是近年来基于表达序列标签(Expressed Sequence Tag，EST)和基因组数据库发展起来的基因克隆新型技术[7]，具有效率⾼、成本低、对实验条件要求低等特点。
因此可以快速获得⼀些新基因，从⽽使新基因的应⽤成为可能。
挖掘⽟⽶中未知的抗病基因对⽟⽶的抗病育种有很⼤帮助。
本研究以⽟⽶为材料，对其中的⼀个 Mlo 基因进⾏电⼦克隆，并对其进⾏部分⽣物信息学⽅⾯分析，为⽟⽶ Mlo 基因的应⽤及⽟⽶的抗病育种提供理论依据。
摘要：植物抗病性是研究植物与病原体之间相互关系中寄主植物抵抗病原体侵染的性能，这是植物的一种属性。
对于植物的抗病性,人们早就从遗传学角度进行了研究。
40 年代通过遗传分析，提出了基因对基因学说，认为抗性是植物品种所具有抗性基因和与之相应的病原体的非致病性基因结合时才得以表现，从遗传上初步说明了病原体和寄主的相互关系。
60 年代发现寄主对病原体侵染的过敏反应，认为这是寄主对病原体侵染防卫反应。
70 年代开始运用分子生物学技术分析病原体的无毒基因和致病基因，开始确定寄生的防卫基因。
80 年代研究得到寄主系统抗病反应与水杨酸相关。
90年代开始克隆寄主的抗病基因。
从病毒诱导基因沉默的遗传学和分子生物学角度来探讨植物抗病的可能机制，基因沉默是近十年来在转基因植物中发现的一种后生遗传现象。
基因沉默大体可以分为两类：位置效应引起的基因沉默和同源依赖的基因沉默。
其中，同源依赖的基因沉默又可以分为转录水平的基因默和转录后水平的基因沉默。
基因沉默的发现使得人们对植物和病毒的相互关系有了一个新的认识。
基因沉默研究中所发现的转录后基因沉默现象是植物抵御病毒入侵、保持自身基因组完整性的一种防御机制，是植物与病毒共进化的结果。
对于沉默产生的机理，尤其是转录后基因沉默，已经提出不少模型，有阈值模型、异常RNA模型、生化开关模型、反义RNA模型等，但是都未能较全面地解释基因沉默中出现的各种实验现象。
该文现就实验所取得的相关结果、转录后基因沉默机制和植物对病毒防御机制的相互关系，以及其研究进展进行综述。
植物病毒是农作物生产上的主要病害之一，据统计，全球共有几百种植物病毒。
植物病毒有时会对粮食产量和人类数量产生灾难性的影响。
仅以马铃薯为例，因马铃薯X 病毒(PVX) 造成的损失可达10 % ，马铃薯Y 病毒( PVY) 所造成的损失可高达80 %。
对病毒病的研究始于20 世纪初，1928 年Wingard[28]首次发现了“恢复”( recovery) 现象，即植物受到病毒侵染发病后，经过一定时间植株可以从病毒侵染症状中“恢复”过来，新长出的叶片不再感染病毒，具有了一定的抗性。
植物抗性机制的研究植物是自然界的重要组成部分，是维持生态平衡的重要组成部分。
然而，植物在生长的过程中，会遭受到许多病原体和害虫的侵袭，极大地威胁到了植物的生长和发展。
为了应对这些挑战，植物在长期的进化中形成了一套完整的抗病机制。
研究植物的抗性机制，对于提高植物的耐病性和培育高产高效的农作物具有重要意义。
一、化学防御植物在进化过程中，逐渐发展了一套非常有效的化学防御机制。
通过化学物质来抑制病原体和害虫的生长繁殖，以免受害。
例如，许多植物会产生挥发性有机化合物，如一些挥发性物质会使昆虫感到不适，降低其觅食的欲望，从而达到保护植物的效果。
其他植物还会产生各种植物类黄酮、类黄酮苷、萜类等化合物，这些化合物具有杀菌、抗氧化、预防UV辐射、降低体温等生理活性。
二、抗病基因的研究抗病基因是植物抵御病原体入侵的重要基因。
这些基因分为两类，一类是走向抗性（R）基因，另一类是走向敏感（S）基因。
R基因可以感知到病原体在侵袭过程中所释放的信号分子，并进一步激发植物的抵御反应，从而阻止病原体的侵入。
S基因则是保持植物的细胞壁完整性，一旦植物细胞受到病原体的侵袭，S基因便会产生反应，保持细胞壁完整性，从而阻止病原体进一步侵入。
三、抗病蛋白的研究植物在长期进化过程中还形成了一系列的抗病蛋白，通过这些蛋白质与病原体等进行相互作用，发挥抵御作用。
例如，植物在面对水稻白叶枯病的侵袭时，可产生一种抗病蛋白CMX1，该蛋白可以识别白叶枯菌的蛋白，从而阻止白叶枯菌侵入植物细胞内部。
同时，该蛋白还可以激发植物内部的免疫系统，产生其他抗病蛋白，进一步增强植物的免疫力。
四、内在免疫系统的研究植物内在免疫系统是指植物自身产生的免疫反应，包括调控生长素合成、产生抗氧化剂等方面。
在生物进化的过程中，植物会不断的改变自身的免疫系统，以适应不同的环境变化和病原体侵袭。
因此，研究植物的内在免疫系统，可以为培育抗病农作物提供重要依据。
五、生物学防治的研究除了以上研究所涉及的机制以外，生物学防治也是植物保护领域的一个热点研究方向。
青岛农业大学2012年硕士研究生招生入学考试（科目代码：339科目名称：农业知识综合一）注意事项：1、答题前，考生须在答题纸填写考生姓名、报考单位和考生编号。
2、答案必须书写在答题纸上，写在该试题或草稿纸上均无效。
3、答题必须用蓝、黑钢笔或圆珠笔，其它无效。
4、考试结束后，将答题纸和试题一并装入试题袋中。
第一部分：植物学（50分）一、名词解释（每题2分，共10分）1. 世代交替2. 侧膜胎座3.凯氏带4. 上位子房5.维管束二、单项选择题（每题1分，共10分。
）1．大豆、刺槐等蝶形花亚科植物的雄蕊是（）。
A.单体雄蕊B.二体雄蕊C.多体雄蕊D.聚药雄蕊2．卵细胞不经受精作用直接发育成胚称（）。
A.孤雌生殖B.营养繁殖C.无孢子生殖D.无配子生殖3．被子植物的芽有多种类型，按它们在枝条上的位置分：（）A.枝芽、花芽和混合芽B.活动芽和休眠芽C.顶芽和腋芽D.鳞芽和裸芽4．杨树的雄花是（）。
A.无被花B.单性花C.不完全花D.A、B和C5．仅有一属一种，并且是中国特产的裸子植物是（）。
A.杜仲B.麻黄C.银杏D.松6．胚囊发育过程中，单核胚囊（即大孢子）形成的过程是（）。
A.造孢细胞→孢原细胞→胚囊母细胞→大孢子B.胚囊母细胞→孢原细胞→造孢细胞→大孢子C.孢原细胞→胚囊母细胞→造孢细胞→大孢子D.孢原细胞→造孢细胞→胚囊母细胞→大孢子7．木本植物茎木质部中无输导能力的是（）。
A.心材B.早材C.晚材D.边材第1页（共5页）8．外胚乳来源于（）。
A.反足细胞B.基细胞C.顶细胞D.珠心组织9．鉴定细胞中的后含物，通常用（）。
A.碘液鉴定蛋白质和脂肪B.苏丹Ⅲ鉴定蛋白质和脂肪C.碘液鉴定蛋白质和淀粉D.苏丹Ⅲ鉴定淀粉和脂肪10．下列花序中，（）是无限花序。
A.肉穗花序B.伞形花序C.伞房花序D.以上均是三、填空题（每空0.5分，共10分）1. 双子叶植物的茎的形成层由（）原始细胞和（）原始细胞组成。
其中（）平周分裂，向内分裂产生（）、（）、（）和（），组合成次生木质部。
致病性：是指病原物所具有的破坏寄主和病变的能力。
抗病性：是指植物减轻或克服病原物致害作用的可遗传特性寄生性：病原物在寄主植物活体内取得营养物质而生存的能力协同进化：在长期进化中，寄主和病原物相互作用、相互适应，各自不断变异而又相互选择病原物发展出种种形式和程度的致病性，寄主也发展出种种形式和程度的抗病性。
多源进化：活体营养和死体营养并存，各自有不同的进化来源。
非寄主抗病性：某种植物的所有个体对某种病原菌表现的抗病性基因抗病性：由基因或基因型决定的抗病性，侧重品种间差异生理抗病性：植株生理生化状态决定的抗病性，侧重栽培和环境的影响。
避病:由于某种原因，使本质上并非抗病的植物，最易感病的阶段与病原物的侵染期相错，或者缩短了寄主感病部分暴露在病原物之下的时间，从而避免或减少了受侵染的机会。
耐病：植物能忍受病害，在产量和质量方面不受严重损害的性能。
被动抗病性：植物本身所具有的物理和化学物质。
主动抗病性：在病原物侵染时形成的结构抗性和化学抗性。
主效基因抗病性：几个独立的主效基因存于同一个基因型中。
微效基因抗病性：多个微效基因决定的抗病性。
毒性谱：指病原菌小种能够侵染的寄主品种数目。
侵袭力：不同小种在同一品种诱发病害强度相同，但在侵染过程中表现的差异。
毒力频率：一种病原物群体中的对一定抗病品种有毒力的菌株的出现频率。
联合致病性：一种病原物群体中对2个以上被测品种有毒力的菌株出现的频率。
典型症状：一种病害在不同阶段或不同抗病性的品种上或者在不同的环境条件下出现不同的症状，其中一种常见症状成为该病害的典型症状。
综合症：有的病害在一种植物上可以同时或先后表现两种或两种以上不同类型的症状，这种情况称谓综合症。
并发症：当两种或多种病害同时在一株植物上混发时，可以出现多种不同的类型的症状，这种现象称为并发症。
隐症现象：病害症状出现后，由于环境条件的改变，或者使用农药治疗后，原有症状逐渐减退直至消失。
被动抗病性：植物与病原物接触前所具有的抗病性。
植物学通报 2005, 22 (1): 92￣99Chinese Bulletin of Botany①国家自然科学基金（３０４７０１２２）资助项目。
②通讯作者。
Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ． Ｅ－ｍａｉｌ： ｃｈｅｎｊｑ＠ｎｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ收稿日期：２００３－１０－２９ 接受日期：２００４－０２－１６ 责任编辑：白羽红专题介绍植物抗病基因及其作用机理①王友红 张鹏飞 陈建群②（南京大学生物科学与技术系 南京 ２１００９３）摘要 综合近年国内外对植物抗病基因的研究和我们对水稻抗病基因的研究成果，对植物抗病基因进行归纳分类，并就其结构、功能、作用机理和信号传导进行分析和讨论。
根据植物抗病基因编码蛋白的保守结构，将植物抗病基因分成ＮＢＳ－ＬＲＲ、ｅＬＲＲ－ＴＭ、ｅＬＲＲ－ＴＭ－ｐｋｉｎａｓｅ、ＳＴＫ和其他五大类。
不同类型的基因在细胞水平上的分布不一样，ＮＢＳ、激酶和ＬＲＲ在不同类型的基因之间结构差异也较大，但是它们通过各不相同的作用机理参与细胞对病原体的防御。
关键词 抗病基因，ＮＢＳ，ＬＲＲ，信号传导Disease Resistance Genes and Mechanisms in PlantsＷＡＮＧ Ｙｏｕ－Ｈｏｎｇ ＺＨＡＮＧ Ｐｅｎｇ－Ｆｅｉ ＣＨＥＮ Ｊｉａｎ－Ｑｕｎ②（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｎａｎｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００９３）Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｅ ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎｔｏ ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ－ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅｓ （Ｒ－ｇｅｎｅｓ） ｗａｓｒｅｖｉｅｗｅｄ． Ｗｅ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ． Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ａ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， ｐｌａｎｔ Ｒ－ｇｅｎｅｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ｉｎｔｏ ｆｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ： ＮＢＳ－ＬＲＲ， ｅＬＲＲ－ＴＭ， ｅＬＲＲ－ＴＭ－ｐｋｉｎａｓｅ，ＳＴＫ ａｎｄ ｏｔｈｅｒｓ． Ｒ－ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ ＮＢＳ， ｐｋｉｎａｓｅ ｏｒ ｅＬＲＲ ｐｌａｙ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｂｙ ｔｈｅｉｒ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ ｐａｔｈｗａｙｓ， ａｌｔｈｏｕｇｈ ｔｈｅｉｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｗｅｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓＤｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ， Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ （ＮＢＳ）， Ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ（ＬＲＲ）， Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ几乎所有的高等植物，一旦生长在某地，通常就不会移动，而病原体则往往可以借助于外力或其他动物的活动而在环境中扩散，并侵害其他健康植株。
植物抗病基因在进化中形成了几种共有的进化形式。
植物祖先抗病基因的复制创造了新基因座。
基因间和基因内重组导致了变异，也导致了新特异性抗病基因的产生。
另外，与特异性识别相关的富含亮氨酸重复区顺应于适应性选择。
同样，类转座元件在抗病基因座中的插入加速了抗病基因的进化。
随着抗病基因的进化，抗病反应也呈现出多样化，代表着植物与病原物动态进化的不同阶段。
几种抗病基因进化模式得到提出。
重复拷贝对创造新的抗病基因起着重要的作用。
抗病基因的复制与随后序列的差异性能创造或扩大基因家族中另一基因簇。
不对等重组与基因转化（基因内）创造了基因数量上的多样性。
基因外重组与基因转化能创造新的特异性抗病基因。
而有的这些重组事件发生在高保守区域上。
LRR区域的多态性为识别、配位及防卫大量病原物提供了进化优势。
转座元件插入到某些抗病基因座中造成基因断裂或染色体重排，加速了抗病基因的进化。
基因座内的过多重组将导致抗病基因特异性丧失，而寄主植物与病原物不断相互作用——双方相互施加压力并不断适应与反适应于选择压力，进行着协同进化，那么抗病基因就必须维持着序列的特异性。
实际上，抗病基因的进化是基因变异与基因序列保守性之间的平衡。
在抗病基因不断进化的推动下，抗病基因控制下的抗病反应表现出多样化（如过敏性反应、非过敏性反应、系统过敏性反应以及极度抗病等），不同类型的抗病反应代表着植物与病原物动态进化的不同阶段。
有关与抗病基因的进化研究还存在一定困难，涂礼莉等人借助其他物种已获得的信息，利用生物信息学的方法来研究海岛棉抗病基因的抗病机制及抗病基因进化。
这种研究方法可能也适用于其他农作物，可以说对抗病机制的研究、抗病基因的转育及抗病基因进化的研究具有重要的意义。
近年来抗性基因研究的突破性进展、抗性基因的克隆和序列分析所揭示的其编码蛋白的组成、拓扑学和亚细胞定位等特征,为揭开抗性基因的作用特点提供了线索。
一般来讲,基因克隆的策略可分为两种:正向遗传学途径和反向遗传学途径。
前者以欲克隆的基因所表现的功能为基础,通过鉴定其产物或某种表型的突变进行,如功能克隆( Functional Cloning) 和表型克隆( Phenotype Cloning) ;后者则着眼于基因本身特定序列或者在基因组中的特定位置进行,如定位克隆( Positional Cloning) 和序列克隆( Sequence Cloning) 。
一、抗病基因克隆的方法（一）功能克隆功能克隆即已知基因编码产物的克隆方法。
当目的基因序列未知,但其编码产物的生理生化及代谢途径研究得比较清楚时,就可以采用这种克隆方法。
功能克隆根据克隆基因的原理又可分为两条路线,一条是分离纯化已知的蛋白质或多肽,制备该蛋白的特异抗体,利用标记的特异蛋白抗体作为探针筛选由表达型载体建立的基因组文库或者cDNA文库,通过免疫杂交筛选到重组克隆,并最终克隆目的基因;第二条路线是将蛋白质纯化后测定其N 端一段氨基酸序列,根据蛋白质密码子编码规律和密码子偏爱原则,反向推算出mRNA序列,然后据此人工合成一段寡核苷酸作探针,利用同位素或其它方法标记后筛选一般的基因组文库或cDNA 文库,筛选阳性重组克隆,并最终克隆目的基因。
随着植物抗病反应的深入研究及蛋白质分离纯化技术的发展,相信功能克隆的策略会发挥重要作用,但一部分抗病基因的产物及表达调控特性尚不清楚,因此在一定程度上也限制了该策略的应用。
（二）定位克隆定位克隆技术是根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法,目标基因精确定位在染色体特定位置之后,用目标基因两侧紧密连锁的标记筛选含有大的插入片段的基因组文库(如BAC和YAC) ,通过染色体步行筛选到含有目标基因的克隆,最后通过遗传转化和功能互补实验进行验证。
其核心任务是染色体步行,如果能找到与目标基因很近的标记,以至于二者之间的距离小于基因组文库中克隆的平均插入片段大小,就可以直接筛选到含有目标基因的克隆,最终得到候选基因,这种策略称为染色体登陆。
到目前为止,利用定位克隆策略,单基因性状相关基因的鉴定方法已较完善且取得了一个系列成果,已使几十种重要的基因得到了分离。
但定位克隆技术需要寻找与目标基因座位连锁的遗传标记或部分功能信息。
有时需连锁作图,较费时费力。
而且在植物的基因组中,大量存在DNA 重复序列经常是染色体步移难以逾越的障碍。
（三）序列克隆序列克隆即已知所克隆基因序列或同源基因的序列时采用的方法。
这种情况下,可以从DNA 序列数据库(如GenBank 数据库) 中查找有关基因的序列,然后可以设计并合成一对寡核苷酸引物,提取所要分离基因的植物染色体DNA 或者用RNA 在逆转录酶的作用下合成cD NA 的第一条链,以此为模板,采取PCR 或RT-PCR 的方法来克隆基因。
扩增的片段经纯化后,连接到合适的载体上,经酶切和序列分析并与已知的基因序列作比较。
此方法简便快速,国内利用此方法已经克隆了豌豆外源凝集素基因。
有时要从其他的种、属中克隆同源基因时,可以先比较序列已知的基因序列,寻找比较保守的区域,根据此区域的序列设计并合成探针,然后从cDNA 文库或者基因组文库中筛选到目的基因的克隆。
如利用酵母菌乙酰乳酸合成酶的基因序列,已从烟草和拟南芥中克隆出抗除草剂的乙酰乳酸合成酶基因。
Payne G. 等根据烟草中酸性几丁质酶和碱性几丁质酶的氨基酸序列C 端的同源率为65 % ,以已知的碱性几丁质酶的核酸序列为探针,从烟草的cDNA 文库中筛选了两种酸性几丁质酶的基因PR-P 和PR-Q。
（四）表型克隆表型克隆是与定位克隆相对的一种克隆基因的策略,它是对因突变而导致的某一特殊表型的目的基因直接进行克隆。
1995 年Weissman 在前人的工作基础上首先提出了表型克隆的概念,由于它能较好地解决定位克隆策略所遇到的困难,因此被称作是分子遗传学观念上的一次革新。
它可对因突变而导致的某一特殊表型的目的基因直接进行克隆分析并分离该基因,而不必事先知道其生化功能及在染色体上的精确位置,也不需知道假设基因的数目或其作用方式,将表型与基因结构或基因表达的特征联系起来从而分离特定表型相关基因。
表型克隆与定位克隆相比,省去了用大量遗传标记进行定位分析的繁琐程序,可较容易地检测基因组之间差异或相同区域,大大加快基因克隆的速度。
二、应用较多的几项技术（一）鸟枪克隆法（Shotgun Cloning）该方法是随机切割供体基因组DNA ,再转化到受体基因组中,根据对转化子的表型鉴定,然后找出所需克隆的基因,鸟枪克隆战略成功地应用于分离细菌的无毒基因。
Staskawica B. J . 等利用这一策略,从大豆病原菌Pseudomonas Syringae pv.Glycinea中克隆到了它的无毒基因。
但是在高等植物中,由于基因组很大,因而应用这种方法克隆基因非常困难。
例如,如果将此方法应用于番茄的抗病基因筛选,需要以双元载体构建抗病品种的基因文库,然后通过农杆菌等将它们导入感病品种之中,然后筛选抗病转化体来分离抗病基因。
但这样鉴定一个单拷贝的基因,需要筛选105株转基因植株,工作量非常大。
(二) 消减杂交法（Subtractive Hybridization）消减杂交法是利用DNA复性动力学来富集一个样品中有，而另一个样品没有的DNA。
消减杂交可以是cDNA 。
用来寻找两样品中差异的基因，也可以是基因组DNA，用于样品中特异存在的基因。
其方法是将过量的driver DNA和样品中的目的DNA退火，然后复性，样品中的共同序列形成双链，而目的DNA序列大多数为单链。
用羟基磷灰石柱或者生物素标记结合等方法不断除去双链DNA序列。
经过多轮变性和复性，样品中的特异性目的DNA 序列得以富集，或者用PCR进行体外扩增。
通过遗传学分析验证富集的克隆DNA。
负性杂交法比其他基因克隆法省时省力。
但目前还不能用于复杂的基因组植物的抗病基因克隆。
（三）转座子标签法（Transposon Tagging）就植物抗性基因的克隆工作来讲,转座子标签技术( Transposon Tagging) 可能是应用最为普遍的一种方法。
它是利用转座子来克隆基因的技术,其显著特点是可以分离预先不清楚表达产物的基因。
其基本原理是:当转座子插入到植物基因组中某个基因或者基因的邻近位点时,会破坏该基因的结构,引起基因突变使植物表型发生变异,因此可以用转座子作为探针从被标记的突变体植物的基因文库中, 克隆出突变的基因,然后再利用突变基因作为探针从野生型植物中克隆出野生型基因。
（四）图位克隆法(Map - based cloning)图位克隆法是根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法,在目标基因精确定位到染色体的特定位置以后,运用与目标基因紧密连锁的分子标记筛选含有目标基因的大片段基因组文库(BAC或YAC) ,再通过染色体步行筛选到含有目标基因的亚克隆,最后通过遗传转化和功能互补实验进行验证。
图位克隆法是以高密度的分子标记图谱为基础,其关键是寻找与目标基因紧密连锁的分子标记,核心任务是染色体步行。
但是对于基因组较大,重复序列较多的一些植物,采用该方法分离克隆抗病基因不仅投资大而且效率低,因此,该方法也受到一定的限制。
除了上面介绍的几种技术，在植物抗病基因克隆工作上还会用到的有: DNA 转染法(DNA Transfection) 、代表性差异分析技术(Representational Difference Analysis) 、mRNA 差异显示(mRNA Differential Display) 、抑制消减杂交法(Suppression Subt ractive Hybridi zation)、产物导向法、插入诱变法、作图克隆法等。
将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术（Transgene technology）。
人们常说的"遗传工程"、"基因工程"、"遗传转化"均为转基因的同义词。
经转基因技术修饰的生物体在媒体上常被称为"遗传修饰过的生物体"（Genetically modified organism，简称GMO）。
转基因植物：优点是开发周期较动物短；种子易于保存；易于放大；表达量高；基因结构清楚；无植物病毒影响人类；生产费用低。
转基因植物的生态风险转基因植物在减少化学农药对环境的影响、提高作物产量、改善品质和保持水土等多方面具有潜在优势。
转基因作物的应用为农业生产带来了一次新的革命，但以重组DNA技术为代表的现代生物技术在带来巨大利益和效益的同时，也可能对人类健康和生态环境安全造成不必要的负面影响。
