前
言
基因工程是现代生物技术的核心， 也是现代分子生物学研究的重 要手段。 掌握基因工程技术对于生物技术专业及其它生物学相关专业 学生都很重要。 基因工程本身是由一系列分子生物学操作技术组成的系统性技 术体系，本实验指导侧重于 DNA 重组操作，将基因工程操作的常用 和核心技术组织起来， 以为我校生物技术本科生及有关专业研究生基 因工程实验提供简单而明确的指导。 为适应基因工程的飞速发展，一些生物技术公司匠心独运，开发 出专门的试剂盒，使一些复杂的实验操作简单化了。这对于实验者来 说自然是好事，但也使实验者动手胜于用脑。对于实验人员来说，一 定应知其然并知其所以然， 才会在实验中运用自己的知识予以创新性 的发展。期望本实验指导不成为实验中的教条。
编
者
2007 年 4 月
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目
实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八 实验九 实验十 附录:
录
大肠杆菌的对照培养、单菌落的分离及菌种保存 ...............3 强碱法小量制备质粒 DNA.....................................................5 琼脂糖凝胶电泳......................................................................7 植物总 DNA 的提取、纯化和检测 ........................................9 DNA 的 PCR 扩增................................................................. 11 植物总 RNA 的分离 .............................................................15 RT-PCR..................................................................................17 体外重组分子的构建、筛选及检测.....................................21 植物表达载体的构建、筛选及检测.....................................22 植物遗传转化技术 ................................................................23 实验中常用的仪器与器皿 .....................................................24
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实验一
大肠杆菌的对照培养、单菌落的分离及菌种保存
大肠杆菌(Escherichia coli)是分子遗传学实验、 基因工程操作中广泛采用的一种 受体菌，它的遗传背景研究的比较详细， 常用做寄主进行基因扩增及外源基因的 表达。 一. 实验目的: 掌握大肠杆菌的对照培养、单菌落的分离及菌种保存方法。 二. 实验原理: 大肠杆菌除本身的核染色体外，往往还含有质粒(Plasmid)DNA， 这是一种双链闭合环状的 DNA 分子， 大小在 1Kb-200Kb 左右， 通常质粒 DNA 带有利于细菌在某一特定环境下生存的酶的基因，而使寄主菌表现以下一些 表现型: 1．对抗生素的抗性 4．产生大肠杆菌素 2．产生抗生素 5．产生内毒素 3．降解有机复合物 6．产生限制修饰酶
pUC19 质粒上带有一个与大肠杆菌抗氨苄青霉素(Ampecillin)有关的基因，它 能编码一种β-内酰胺酶，这种酶降解氨苄青霉素，从而消除了抗生素对细胞壁 形成的抑制作用，不含这种质粒的细菌则不能在含抗生素的培养基上存活。
三．实验材料:
E．coli InvaF'
E．coli InvaF'(pUC19)
四．实验仪器、器皿及试剂: 仪器:超净工作台 等 器皿:(见附录) 试剂:琼脂 等 酵母抽提物 胰蛋白胨 Nacl 氨苄青霉素 NaOH 恒温培养箱 高压灭菌锅 恒温水浴锅 微波炉
五．实验步骤: 1. 配制培养基： ａ．LB(Lurib-Bertani) media 酵母抽提物 胰蛋白胨 Nacl
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(Yeast extract) (trytone)
5g/L 10g/L 10g/L
加蒸馏水定容至 1000ml 调节 pH 值至 7.0。 配制 750ml 固体培养基: 在上述液体培养基中， 15 g/L 加入琼脂加热至充分熔 按 化，即成固体培养基。 ｂ：50%的丙三醇: 取 50ml 丙三醇加入 50mlddH2O 至 100ml。 将上述培养基和丙三醇溶液高温蒸汽消毒 15 磅 20min 2. 倒平板:将固体培养基加热至充分熔化，待温度降至 50℃以下凝固前，加入 Amp 至 100ug/ml 摇动混匀， 每平皿倒入 25ml 左右， 此过程应进行无菌操作， 另倒一不含 Amp 的 LB 平板。 3. 待培养基凝固以后，用接种环(灼烧消毒后)分别接种各一环贮存菌种:E.coli InvaF' 和 E.coli InvaF'(pUC19)于不含 Amp 的 LB 平板上和含 Amp 的 LB
平板上,划线接种要防止划破培养基，划线方法如图所示:
第一次划线后接种环灼烧 再进行第二次划线
第二次划线起点与第一次 划线交叉，接种环灼烧后再 进行第三次划线
如此在平板上 划线 5-6 次
4. 接种完成后将培养皿倒置入培养箱 37℃培养过夜，运用这种划线方法接种， 可以较好地保证单菌落的形成。 5. 比较两菌系在培养基上的不同反应。挑取:E.coli InvaF'E.coli InvaF'(pUC19)的 单菌落分别接种至含 Amp 和不含 Amp 的 5ml LB 液体培养基中， 37℃振荡培 养过夜。 6. 分别吸取 0．5 ml 菌液在无菌条件下，加入 0．5 ml 50%丙三醇，置一灭菌的 冻干管中，混匀至-20℃保存。 思考题: 1. 平板培养细菌为什么要倒置培养? 2. 细菌的继代繁殖为何要强调单菌落分离? 3. 在固体培养基中怎样加入抗生素? 4. 简述单菌落分离的接种过程。
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实验二
强碱法小量制备质粒 DNA
一．实验目的:了解基因工程操作中运载基因的载体，掌握最常用的提取质粒 DNA 的方法。
二．实验原理: 碱变性抽提质粒 DNA 是基于染色体 DNA 的变性与复性的差异 而达到分离的目的。利用溶菌酶、强碱(NaOH)及表面活性剂(SDS)使细胞破壁、 膜，释放出胞内染色体 DNA，质粒 DNA 及其它物质，通过一系列的纯化过程: 高盐除核 DNA，苯酚-氯仿抽提变性蛋白和脂类，最后用异丙醇(或乙醇)沉淀出 质粒 DNA 和 RNA 等， RNA 再经 RNase 消化，得到质粒 DNA，这种质粒 DNA 可用作基因工程的载体，更广泛地用于重组子的鉴定。 三. 实验材料: Ecoli InvaF'(pUC19)
四. 实验仪器、器皿及试剂: 仪器、器皿(见附录) 试剂:1．溶液 1(GTE) 50 mmol/l 10 mmol/l 25 mmol/l 4mg/ml 2．溶液 2 200 mmol/l 1% SDS 3．溶液 3 5 mol/l KAC 冰乙酸 ddH2O 4．苯酚-氯仿 5. 异丙醇(或 95%乙醇，100%乙醇) 6. 70%乙醇 7. TE (pH 8.0): 10 mmol/l 1 mmol/l 8．RNase 1mg/ml Amp Tris-Cl EDTA-Na 2 100ug/ml (pH 8.0) 60 ml 11．5ml 28．5ml NaOH 葡萄糖 EDTA-Na 2 Tris-Cl 溶菌酶 (pH 8.0)
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五. 实验步骤: 1. 挑取一单菌落的 Ecoli InvaF'(pUC19)菌种接种到含 Amp100ug/ml 的 LB 液 体培养基中，37℃振荡培养过夜。 2. 吸 1． 菌液至 eppendorf 管中， 4ml 在高速台式离心机上 5， 000g 离心 2min， 倒去培养基。 3. 重复 1 次，尽可能倒出培养基并将管倒置于纸帕上，以吸干管壁上残留 的培养基，收集细菌。 4. 将细菌悬于 500ul 冰冷的溶液 1 中，于离心机上 5，000g 离心 2min。 5. 倒去溶液 1，再悬于 200ul 冰冷的溶液 1 中。 6. 加入 300 ul 新配制的溶液 2，冰浴 5 min。 7. 加入 300ul 冰冷的溶液 3，中和，轻轻振荡 10sec，至冰浴 5 min。 8. 于离心机上，10，000 g 离心 5min。 9. 取上清转移至一新管中，并加入 RNase 酶至 50ug/ml，于 37℃水浴中温 浴 30 min。 10. 加入等体积的饱和酚抽提 1 次，10，000 g 离心 5min 取上清液。 11. 再加入等体积的氯仿抽提 1 次， 10，000 g 离心 5min 取上清液。 12. 加入 750ul 异丙醇，沉淀质粒 DNA， 10，000 g 离心 10min。 13. 倒去异丙醇，用 70%乙醇洗涤沉淀，10，000 g 离心 5min。 14. 置冰箱内开盖干燥，悬浮至 40ul 去离子水或 TE 中。
思考题: 1. 有机溶剂抽提为什么可以达到除蛋白，脂类杂质的目的? 2. 异丙醇沉淀 DNA 后为什么要经过 70%乙醇清洗这一步? 3. 逐步说明强碱法提取质粒 DNA 的原理。
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实验三
琼脂糖凝胶电泳
一．实验目的: 学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳技术，检测 DNA 的纯度，DNA 的构型，含 量以及分子量的大小。
二．实验原理: 琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，它具有亲水性且不含带电荷的基团， 是一 种很好的电泳支持物，DNA 分子在碱性环境中带负电荷，在电场作用下向正极 泳动，不同的 DNA 片段由于电荷、分子大小及构型不同，在电场中所受的动力 及琼脂糖交联分子的阻力不同，小分子及构型紧密的分子泳动较快， 大分子则较 慢，大小相同的分子形成一条带，于是达到了分离 DNA 分子的目的。
三．实验材料: 菌种 Ecoli．INVαF ，(pUC19)
四．实验仪器、器皿及试剂: 仪器、器皿(见附录) 试剂:1．电泳缓冲液: 5×TBE pH8．0(使用浓度为 0．5×) 配制:称取 54．0gTris，27．5g 硼酸，加入 20ml 500mmol/l 的 EDTA， 先加 800ml 重蒸水，加热溶解后，再加重蒸水定容至 1000ml。 2．1mg/ml 溴化乙锭溶液 (EB) 配制:带手套谨慎称取 1mg 溴化乙锭，溶于 1ml 重蒸水中，置 4℃冰箱 备用。(EB 是 DNA 的诱变剂，亦是强致癌屋，操作时应小心!) 3．琼脂糖:视实验要求制不同浓度的胶，用 0．5×TBE 作溶剂配制。 4．0．2% 溴酚蓝，50%蔗糖指示剂(Loading buffer) 配制: 称取溴酚蓝 100mg，加重蒸水 5ml，在室温下过夜，待溶解后 再称蔗糖 25g， 加重蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中， 摇匀后加重蒸水定容至 50ml， 加 NaOH1-2 滴调至蓝色。
五．实验步骤:
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1. 琼脂糖凝胶的制备: 琼脂糖凝胶的浓度一般为 0．5%-1．5%， 称取 1g 琼脂 糖于 250ml 的三角瓶中，加入 100ml 0．5×TBE 于微波炉内充分加热煮沸， 慢慢冷却至 50℃以下， 电泳平板洗净后晾干， 两端封上胶布， 置于水平板上， 架上梳子后倒入凝胶液 4-5mm 厚，待凝胶充分凝固后，撕下两端胶布，置于 电泳槽内， 加入电泳缓冲液至浸没胶 0． 5mm 左右， 轻轻拔出梳子， 接上电源， 明确电源极性。 2. 样品准备:电泳样品 DNA 的量由电泳所跑的带的数量而定，一般为 2-800ng， 质粒 DNA 一般为两条带， 这是由同种分子构型差异而形成的， 点样量为 300ng 左右。 吸取质粒 DNA TE 或重蒸水 Loading buffer 3. 点样 4. 开稳压电源，电压调整至 1-5V/cm，电泳 3-4 小时。 5. 染色: 电泳后的凝胶，置于含溴化乙锭 0．5ug/ml(EB)的蒸馏水或 TBE 染色 0．5h，为方便起见，常在电泳时在电泳液中加 EB 或直接在凝胶中加入 EB。 6. 观察电泳结果:将凝胶置于透射式紫外检测仪上，在紫外灯下可见荧光带。 7. 绘出电泳带草图。 pUC19 12ul 4ul 4ul
思考题: 1. 简述 DNA 分子大下电泳确定法。 2. 凝胶电泳为什么能分离不同构型或分子大小 DNA? 3. 你认为迁移率与分子大小是否成直线关系。
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实验四
植物总 DNA 的提取、纯化和检测
植物 DNA 是进行分子遗传研究的基本对象， 提取完整， 高纯度的 DNA 是研究中很重要的 一环，在近年来兴起的分子育种中运用尤为广泛，掌握植物 DNA 的提取方法，了解其原理有 其重要意义，本实验在着重于原理的前提下，介绍一种可适用于多种植物的简便方法。
一．实验目的:学习植物总 DNA 的提取、纯化及检测方法
二．实验原理:植物 DNA 的提取首先是机械破碎植物细胞，可采用石英砂或氧化铝研磨法， 液氮冷冻研磨法等，在研磨液中含有 SDS 破细胞膜，蛋白酶水解除 DNA 结合蛋白，再以有机 溶剂除去蛋白、脂类和杂质，乙醇沉淀 DNA，这时的 DNA 为粗制品，含 RNA、少量蛋白质、 多糖等杂质， RNase 处理再以有机溶剂抽提和乙醇沉淀， 经 可得到较纯的 DNA 适用于一般的 分子育种工作。
三．实验材料: 幼嫩植物苗或幼叶
四．实验仪器、器皿及试剂: 仪器、器皿(见附录) 试剂: 研磨液: 0.45mol/l 0.1 mol/l 0.1mol/l 1% SDS 70%乙醇 95%乙醇 NaCl Tris-Cl (pH7.0)
EDTA-Na2
氯仿-异戊醇 (24:1) 5mol/l 3mol/l TE: 高氯酸钠 NaAC 10mmol/lTris-Cl (pH7.6) 1mmol/l EDTA--Na2 (pH 7.6) RNase: 10mg/ml
五．实验步骤:
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1. 称取植物材料 10g，野外采材要经清洗，再以 70%乙醇表面消毒后凉干。 2. 将材料置于研钵中，倒入适量液氮捣碎材料并研磨至粉状。 3. 加入 20ml 研磨液，继续研磨至糊状。 4. 加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)充分混匀，分装于离心管中，平衡。 5. 离心除渣，4，000g 10min，将上清移至一新管。 6. 72℃水浴保温 3-4min，加入 5mol/l 的高氯酸钠(体积比为 4:1) 7. 加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)充分混匀，4，000g 离心 10min。 8. 加入 2 倍体积的 95%低温乙醇，沉淀 DNA，可见白色丝状物。 9. 用玻棒搅起丝状物(搅不起的，可离心收集沉淀物)，用适量 TE 溶解。 10. 加 RNase 至终浓度为 50ug/ml，37℃保温 30min。 11. 加入等体积的氯仿-异戊醇(24:1)， 4，000g 离心 10min。 12. 吸取上层水相，加入 1/10 体积的 3mol/l NaAC 及 2 倍体积经预冷的 95%乙醇，混匀，在 -20℃放置 30min，DNA 形成纤维状沉淀。 13. 沉淀加入 1ml70%乙醇洗涤 1 次，4，000g 离心 8min 去上清，纸帕吸干。 14. DNA 沉淀真空干燥后溶于 TE 中。 15. 将 DNA 粗制品和纯化品点样电泳，设 DNA 分子量标准，观察 DNA 纯度，分子大小。 16. 对纯化后 DNA 样品进行紫外吸收测定，计算 DNA 浓度和纯度，用坐标纸绘出 DNA 吸收曲 线。 附: DNA 纯度鉴定公式: A260nm/A230nm≥1.8 A260nm/A280nm≥1.8 DNA 浓度(ug/ml)=A260nm×50 稀释倍数
思考题: 1. 研磨液中 EDTA 的作用是什么? 2. 沉淀粗 DNA 时不要加 NaAc，而纯化后再沉淀时则要加入 NaAc，为什么?
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实验五
DNA 的 PCR 扩增
一．PCR 扩增的原理 聚合酶链式反应（polymerease chain reaction， PCR）即在 DNA 聚合酶催化 下，通过引物延伸核酸的某个区域而进行的重复双向 DNA 合成。扩增反应一般 包括 DNA 模板变性、引物与模板退火、引物延伸合成三步反应的重复过程。经 过多次循环，使一个模板分子的特定区域得以等比级数地扩增。耐热 DNA 聚合 酶（Taq DNA 聚合酶）的应用，使聚合酶能耐受 DNA 变性的高温，因而避免了 每次热变性后聚合酶失活，使扩增的三步反应实现了连续的循环， 在此基础上产 生了自动 PCR 仪。 PCR 扩增的产物是由两引物界定的一段双链 DNA。 通常的 PCR 引物是一段 人工合成的寡核苷酸，在反应体系中成对存在，与 DNA 模板一定区域的两条链 分别互补。在 DNA 模板变性后的退火过程中，两引物与模板上的互补序列发生 退火复性，为 DNA 的合成提供了带 3'-OH 的引物序列，在聚合酶的催化下便可 进行引物延伸合成 DNA。 PCR 反应的原理可由下图所示：
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二.实验目的 了解 PCR 的基本原理； 掌握 PCR 实验的操作方法； 运用 PCR 方法检验克隆质粒。 三.实验材料、药品及仪器 寡 核 苷 酸 引 物 ， 为 pUC 质 粒 的 通 用 引 物 ， 正 向 为 ： GTAAAACGACGGCCAGT；反向为：CAGGAAACAGCTATGAC。 两引物的互补序列位于 pUC 质粒多克隆位点的两端，因此可将克隆 在多克隆位点的插入片段扩增出来。 Taq DNA 聚合酶及其最适缓冲液（10X） 15mM MgCl2 2mM dNTPs（pH 7.0） 去离子水 PCR 薄壁管 PCR 仪 琼脂糖凝胶电泳装置 凝胶成像系统 四．实验步骤 按以下比例和浓度在 PCR 反应管中按下列顺序配制反应体系： 去离子水 10X Taq DNA 聚合酶 缓冲液 质粒 DNA 模板 正向引物 mol） 反向引物 mol） dNTPs MgCl2
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11ul 2ul 1ul 1ul（25p 1ul（25p 1ul 2ul
Taq DNA 聚合酶 总体积 20ul，混匀后置于 PCR 仪中进行自动 PCR ②PCR 仪的设置： 预变性 95℃ 变性 退火 延伸 94℃ 52℃ 72℃ 4 min 1min 1min 1min 5 min
1ul（1 U）
循环 35 次
最后延伸 72℃ ③电泳检查：
扩增结束后，在体系中直接加入 4ul 电泳载样缓冲液，在预加 了 EtBr 的 1.0%琼脂糖凝胶上点样电泳（见实验 4） 。5V/cm 电场强度 电泳 45min 后，紫外线下观察凝胶，正确扩增反应可观察到目的分子 带。
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实验六
植物总 RNA 的分离
一．实验原理 真核生物的 RNA 包括 rRNA、tRNA 和 mRNA。一个典型的真核细胞约含 有 10-5~10 -6μg 的 RNA，其中 80-85%为 rRNA，其余 15-20%主要由各种低分子 量 RNA 组成（如 tRNA、核内小分子 RNA 等） ，细胞的 RNA 大多都与蛋白质结 合在一起，但这种结合很容易在变性剂存在下打破。在经有机溶剂抽提后，用乙 醇或异丙醇可将其从上清中沉淀出来。 RNA 提取中要严格避免 RNA 酶的污染， 因为 RNA 酶极稳定， 通常的消毒 方法难以将其灭活，而空气中细菌、真菌和操作者都有可能成为 RNA 酶的污染 源。RNA 酶污染会使分离的 RNA 大量降解。 对于 rRNA 和 tRNA 分子具有确定的大小和核苷酸序列， 当总 RNA 分离出 来后还能用电泳、密度梯度离心、层析等方法加以进一步分离纯化。而 mRNA 的分离将在后续实验中做到。
二．实验目的 认识真核生物 RNA 的组成及分离的原理； 学习 RNA 提取过程中抑制 RNA 酶活性的方法；
三．实验材料 水稻幼苗，剪取幼芽。
四．实验器具及药品 瓷研钵（组织捣碎机） 、eppendorf 离心管、冷冻台式离心机、液态氮、剪刀、 一次性手套、恒温水浴锅、真空干燥仪、紫外分光光度计、凝胶电泳装置、凝胶 成像系统等。 进行 RNA 提出的所有器皿必须保证未受 RNA 酶的污染，玻璃、瓷器和金属 耐热器皿应先以 0.1%DEPC（二乙基焦碳酸盐）水溶液浸泡 2hr，然后以铝箔包 裹后在 180℃烘烤过夜。使用新的塑料制品，并将其在 0.1%DEPC 中浸泡 2hr 并 经高压蒸汽消毒 30min。操作过程中还应严格避免外源 RNA 酶的污染。
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药品：异硫氰酸胍、CSB（柠檬酸/十二烷基肌氨酸钠/β-巯基乙醇）缓冲液、 2mol/L NaAc pH 4.0、酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 、异丙醇、75%乙醇、DEPC H2O 等。
五．实验步骤 1．称取材料 0.1g，剪成约 2mm 长段，加入液氮研磨成细粉状。 2．加入 0.2g 异硫氰酸胍和 2ml CSB 缓冲液，继续研磨成匀浆。 3．将匀浆转移至两个 eppendorf 管中，加入 0.12ml NaAc，加盖后反复颠倒离心 管 20 次。 4．每管加入 1ml 酚：氯仿：异戊醇，混匀后剧烈震动 10sec，冰浴 15min。 5．10，000g，4℃离心 15min。 6．小心将上层水相转移至新管中，注意不要吸动中间层。中间层富含蛋白质和 DNA。 7．加入等体积的异丙醇，混匀后置-20℃放置 30min 以沉淀 RNA。 8.10，000g，4℃离心 20min 沉淀 RNA。 9.弃上清，将 RNA 沉淀悬浮到 0.5ml CSB 溶液中，摇动溶液至 RNA 溶解。 10.加入等体积的酚:氯仿:异戊醇重新抽提一次，即重复④—⑧的步骤。 11．离心后弃上清，沉淀用 0.5ml 预冷的 75%乙醇漂洗一次。离心后弃上清，真 空初步干燥沉淀。 12．RNA 溶解在 0.2ml DEPC 水中，用紫外分光光度计测定 260nm、280nm、及 230nm 波长的光密度，获得 RNA 的浓度和纯度。
注：1.RNA 的浓度 C=A260×40×测定稀释倍数（ug/ml） ， 纯 RNA 的 A 260/A280 比值在 1.7-2.0 之间， 若低于该值范围， 表明有蛋白质污染， 应重新进行有机溶剂抽提。若高于该范围，可能有异硫氰酸胍的残留或有核 酸的严重降解，应重新进行醇沉淀的步骤。 2．当前有很多生物技术公司生产分离 RNA 的试剂盒，如 Trizol 试剂，将异 硫氰酸胍、CSB 及苯酚混合在一起，按一定的体积与材料研磨后，即可通过 氯仿抽提和乙醇沉淀 RNA，可很方便地进行 RNA 的分离。
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实验七
RT-PCR
一．原理 RT-PCR 即逆转录 PCR，过程由两部分组成：cDNA 的合成：以 mRNA 为模板， 在逆转录酶的作用下，以 Oligo（dT）或特异的下游引物合成与 mRNA 为互补的 cDNA 片段；PCR 扩增：以已合成的 cDNA 为模板，在耐热的 DNA 聚合酶和上、下 游引物作用下进行标准的 PCR 扩增。 PCR 和 RT-PCR 技术操作简单，敏感性高，已广泛应用于基因结构分析、基因表 达和基因克隆研究。
二．试剂和样品： 1．模板 RNA：根据实验二（哺乳动物细胞 RNA 的分离）的方法，提取总 RNA，适 当稀释后备用。 2．四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs，包括 dATP、dCTP、dGTP、dTTP） ：用 pH7.0 的 中性水溶液先分别配成 100mmol/L 储备液， 储存于-20℃。 使用时， dATP、 取 dCTP、 dGTP、dTTP 贮备液等分混匀，并适当稀释，使 dNTPs 工作液的浓度为 10mmol/L。 3．标准 PCR 缓冲液：10×缓冲液组成为：200mmol/L Tris-HCl (pH8.3，25℃)， 15mmol/LMgCl2 ，250mmol/LKCl，0.5%Tween20，1mg/mlBSA(或 gelatin)。 4．引物 （1）Oligo(dT) 16，合成后用水溶解，使其浓度为 500ng/ul。 （2）PCR 扩增引物 本实验所用引物根据-actin mRNA 的序列设计，扩增产物的长度为 260bp。上游 引 物 ： 5’-TGACGGTCAGGTCATCACTATCGGCAATGA-3’ 下 游 引 物 ：
5’-TTGATCTTCATGGTGATAGGAGCGAGGGCA-3’ 。引 物 合 成 后 用 水 溶 解， 配 制 成 100umol/L 贮备液，使用时稀释成 10umol/L 或 2umol/L。 5．TaqDNA 聚合酶：浓度为 3U/ul，为了便于准确取样，实验前稀释成 1。5U/ul （也可以不稀释） 。 6．AMV 逆转录酶，缓冲液。 7．DEPC 处理的无菌双蒸水。
三．操作步骤
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cDNA 的合成 总 RNA ≤1ug（约 5—10ul） Oligo(dT)16 RNasin 5xRT 缓冲液 10mmol/LdNTPs AMV 逆转录酶 加水到 0.5ug（也可使用特异下游引物 50—100pmol） 20U 4ul 1ul 10ul 20ul
42℃保温 30—60 分钟，冰上冷却，离心数秒钟，然后进行 PCR。 PCR 5ml 反应管中，按照以下顺序加入各种成分，使反应总体积为 50μl: H2O 10×PCR 缓冲液 10×dNTPs（2.0mmol/L） 28μl 5μl 5μl
扩增引物混合物（2μmol/L） 5μl cDNA 模板 TaqDNA 聚合酶（1.5U） 5μl 2μl
在冰上轻轻混匀后，离心数秒钟，放置于冰上，准备上机扩增。 ⒉上机 先在 DNA 扩增仪上设置好循环程序：94℃预变性 2 分钟；94℃变性 30 秒，60℃ 退火 30 秒，72℃延伸 40 秒，共 30 个循环；72℃延伸 5 分钟。反应管放在 DNA 扩增仪的插孔中。按“START”键，循环开始。 ⒊循环完毕，取出反应管，放置于 4℃冰箱备用。 ⒋ PCR 产物电泳 PCR 扩增完毕，需要用凝胶电泳的方法检测扩增效果。扩增片段长度一般在 0.2kb～1.0kb，宜用 1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，以φX174/HaeⅢ作为分子量标 准。如扩增片段的长度在 1.0kb～3.0kb 范围，宜用 1.0%琼脂糖凝胶进行电泳， 以λ/HindⅢ+EcoRⅠ作为分子量标准。 ⑴1.5％琼脂糖凝胶的制备 称取 1.5g 琼脂糖放于洁净的 250ml 三角烧瓶中，加 100ml0.5×TBE，放入微 波炉或水浴锅内，加热至琼脂糖完全溶化透明。取出冷却至 55℃左右。加 5μ
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l10mg/ml 溴乙锭于琼脂糖溶液中，混匀后倒胶。放置半小时以上。 ⑵ 点样及电泳 将制备好的凝胶放入电泳槽中，加入适量 0.5×TBE（缓冲液高于凝胶平面 2mm） ， 取出梳板。 在 PCR 反应管中加等体积氯仿，混匀后，离心 2 分钟，吸出上层 PCR 产物于 另一离心管中。取 5μl 或 10 μl PCR 产物与上样缓冲液（50％甘油，10mmol/L EDTA，0.05％溴酚蓝，0.05％二甲苯蓝）混匀，加入到凝胶的点样孔中，左侧点 φX174/HaeⅢ分子量标准（100ng） ，在 100V 稳压条件下电泳 1～1.5 小时。 ⑶ 观察结果 将凝胶放置于紫外检测仪上观察。必要时可照相，记录实验结果。 （主要分析： ①是否有扩增产物。②如有拖尾或有几条区带，说明有非特异性扩增。③分子量 标准电泳后区带是否分开。④与分子量标准比较，PCR 产物的长度是否正确。⑤ PCR 产物的产量） 。
注意事项 为了防止皮肤上的 RNase 对样品 RNA 的降解以及脱落的细胞可能导致的假阳性结 果，做 RT-PCR 反应时应戴手套，并洗去滑石粉，擦干净。 加入试剂的量一定要准确。
常见问题及解决方法 无 PCR 产物。可能由以下原因导致： (1)无模板 DNA。 （2）无 TaqDNA 聚合酶：TaqDNA 聚合酶无活性。 （3）无引物或引 物已降解。 （4）变性温度和时间是否已使模板 DNA 解链。 （5）PCR 仪的热传递效 率。 （6）Mg 2+浓度是否合适。 PCR 产物呈拖尾现象。可通过下列方法解决： 提高退火温度。 （2）减少 Taq DNA 聚合酶的用量。 （3）试用二步法进行 PCR 扩
增。 （4）调节 Mg2+浓度，使之最优化。 （5）减少延伸时间。 （6）减少循环次数。 （7）设计新的引物。 （8）采用热启动法进行 PCR。 引物二聚体。 解决方法： （1） 防止引物 3'端互补。 （2）设计较长的引物。 （3）增大模板的量。 （4）降
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低引物的浓度。 （5）减少循环的次数。 （6）提高退火温度。 阴性对照（不加模板 DNA）有扩增带，说明试剂已污染，可通过下述方法解决： (1) 操作时带手套。 （2）不要重复使用 Tip，Eppendorf 管。 （3）重新配制有关 试剂。 （4）为防止交叉感染，可在 Eppendorf 管中加入除模板 DNA 以外的其他试 剂，充分混匀后，分到各管中，再加模板，滴石蜡油，进行 PCR 循环。该法在同 时做多个样品时尤为适用，可省时省力。 （5）用 dUTP 替代 dTTP 进行 PCR 扩增。 实验前用脲嘧啶 N 糖苷酶 （UNG） 来清除上一次 PCR 产物中的 dUTP， 最终消除 PCR 产物对反应试剂的污染。
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分子生物学与基因工程复习重点 第一讲绪论 1、分子生物学与基因工程的含义 从狭义上讲，分子生物学主要是研究生物体主要遗传物质-基因或DNA的结构及其复制、转录、表达和调节控制等过程的科学。 基因工程是一项将生物的某个基因通过载体运送到另一种生物的活体细胞中，并使之无性繁殖和行使正常功能，从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。 2、分子生物学与基因工程的发展简史，特别是里程碑事件，要求掌握其必要的理由 上个世纪50年代，Watson和Crick提出了的DNA双螺旋模型； 60年代，法国科学家Jacob和Monod提出了的乳糖操纵子模型； 70年代，Berg首先发现了DNA连接酶，并构建了世界上第一个重组DNA分子； 80年代，Mullis发明了聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术； 90年代，开展了“人类基因组计划”和模式生物的基因组测序，分子生物学进入“基因组时代”； 目前，分子生物学进入了“后基因组时代”或“蛋白质组时代”。 3、分子生物学与基因工程的专业地位与作用：从专业基础课角度阐述对专业课程的支 撑作用 第二讲核酸概述 1、核酸的化学组成（图画说明） 2、核酸的种类与特点：DNA和RNA的区别 （1）DNA含的糖分子是脱氧核糖，RNA含的是核糖； （2）DNA含有的碱基是腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T），RNA含有的碱基前3个与DNA完全相同，只有最后一个胸腺嘧啶被尿嘧啶（U）所代替； （3）DNA通常是双链，而RNA主要为单链；
（4）DNA的分子链一般较长，而RNA分子链较短。 3、DNA作为遗传物质的直接和间接证据； 间接： （1）一种生物不同组织的细胞，不论年龄大小，功能如何，它的DNA含量是恒定的，而生殖细胞精子的DNA含量则刚好是体细胞的一半。多倍体生物细胞的DNA含量是按其染色体倍数性的增加而递增的，但细胞核里的蛋白质并没有相似的分布规律。 （2）DNA在代谢上较稳定。 （3）DNA是所有生物的染色体所共有的，而某些生物的染色体上则没有蛋白质。（4）DNA通常只存在于细胞核染色体上，但某些能自体复制的细胞器，如线粒体、叶绿体有其自己的DNA。 （5）在各类生物中能引起DNA结构改变的化学物质都可引起基因突变。 直接：肺炎链球菌试验、噬菌体侵染实验 4、DNA的变性与复性：两者的含义与特点及应用 变性：它是指当双螺旋DNA加热至生理温度以上（接近100oC）时，它就失去生理活性。这时DNA双股链间的氢键断裂，最后双股链完全分开并成为无规则线团的过程。简而言之，就是DNA从双链变成单链的过程。增色效应：它是指在DNA的变性过程中，它在260 nm的吸收值先是缓慢上升，到达某一温度后即骤然上升的效应。 复性：它是指热变性的DNA如缓慢冷却，已分开的互补链又可能重新缔合成双螺旋的过程。复性的速度与DNA的浓度有关，因为两互补序列间的配对决定于它们碰撞频率。DNA复性的应用-分子杂交：由DNA复性研究发展成的一种实验技术是分子杂交技术。杂交可发生在DNA和DNA或DNA与RNA间。 5、Tm的含义与影响因素 Tm的含义：是指吸收值增加的中点。 影响因素： 1）DNA序列中G + C的含量或比例含量越高，Tm值也越大（决定性因素）；2）溶液的离子强度 3）核酸分子的长度有关：核酸分子越长，Tm值越大
现代分子生物学 复习提纲 第一章绪论 第一节分子生物学的基本含义及主要研究内容 1 分子生物学Molecular Biology的基本含义 ?广义的分子生物学：以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究 对象，从分子水平阐明生命现象和生物学规律。 ?狭义的分子生物学：偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调控 等过程，也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。 1.1 分子生物学的三大原则 1) 构成生物大分子的单体是相同的 2) 生物遗传信息表达的中心法则相同 3) 生物大分子单体的排列（核苷酸、氨基酸）的不同 1.3 分子生物学的研究内容 ●DNA重组技术（基因工程） ●基因的表达调控 ●生物大分子的结构和功能研究(结构分子生物学） ●基因组、功能基因组与生物信息学研究 第二节分子生物学发展简史 1 准备和酝酿阶段 ?时间：19世纪后期到20世纪50年代初。 ?确定了生物遗传的物质基础是DNA。 DNA是遗传物质的证明实验一：肺炎双球菌转化实验 DNA是遗传物质的证明实验二：噬菌体感染大肠杆菌实验 RNA也是重要的遗传物质-----烟草花叶病毒的感染和繁殖过程 2 建立和发展阶段 ?1953年Watson和Crick的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑。 ?主要进展包括： ?遗传信息传递中心法则的建立 3 发展阶段 ?基因工程技术作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命的新时期开始。 ? 第三节分子生物学与其他学科的关系 思考 ?证明DNA是遗传物质的实验有哪些？ ?分子生物学的主要研究内容。 ?列举5～10位获诺贝尔奖的科学家，简要说明其贡献。
综述：进化论与进化生物学的发展自达尔文1859年发表《物种起源》（The Origin of Species）一书以来，“进化”（evolution）已逐渐成为生物学文献中出现频率最高的词汇之一，进化生物学（evolutionary biology）则成为当今生命科学中一个重要的前沿领域。 纵观150年来，随着科学界对生物进化现象的认识不断深化，人们对达尔文进化论的理解也随之不断深入，进化论自身也走过了曲折的发展之路。除了像其他任何一种科学理论一样需要补充和修正外，进化论还经受了来自科学领域之外的一次又一次挑战。今天，分子水平的生物进化研究正在蓬勃兴起，人们对进化论的兴趣有增无减，同时也提出了更高的要求，即以进化论为核心的进化生物学研究不仅应能够解释各种复杂生命现象，重建生物的自然历史，而且还应具有一定的预测性和应用潜力。因而，藉纪念达尔文（C. Darwin）诞辰200周年和《物种起源》出版150周年之际，回顾进化论与进化生物学的发展历程，将有助于我们全面了解该领域的科学理论与知识，并用于指导21世纪生命科学的研究。 进化论的科学本质 进化论从本质上改变了人们对地球生命现象的理解。进化论围绕生物多样性的起源与发展，引导人们探索各种生物之间的亲缘关系（或称进化谱系）。例如，作为地球生物的一员，人类究竟何时又是如何在地球上出现的？不同人种或不同人群之间关系如何？人类与其他生物（如细菌）有何种进化上的关联？如此等等，进化论为我们提供了科学的解释。 在进化论中，具有有益性状的生物存在差异的繁殖优势被称为自然选择（natural selection），因为是自然来“选择”提高生物生存与繁殖能力的性状。如果生物的突变性状降低其生存与繁殖能力的话，自然选择就会减少这些性状在生物群体中的扩散。人工选择也是一个类似的过程，但在这种情况下是人而不是自然环境使生物交配以选择理想的性状。最常见的莫过于通过人工选择来获得人们所需的家畜品系和园艺植物品种等。 迄今为止，支持进化论的证据层出不穷，从中华龙鸟化石的发现到酵母实验进化的分析，不胜枚举[1]。近年来比较突出的例子有加拿大北部“大淡水鱼”化石的发现。科学家们根据进化理论和化石分析预测出浅水鱼类向陆地过渡阶段的大致时间，随后他们将目光投向加拿大北部努维特地区的埃尔斯米尔岛，那里有大约37 500万年前的沉积岩。通过四年的努力，科学家们终于从岩层中发掘出命名为“Tiktaalik”（因纽特人的语言中意为“大淡水鱼”）的生物化石，它既具有许多鱼类特征，又具有早期四足动物的典型特征，而它的鳍包含骨骼，可形成类似于有肢动物的肢体，用来移动和支撑躯体[2]。“大淡水鱼”的发现证实了科学家们基于进化论的预测。反过来，对于进化论预测的证实也提高了达尔文理论的可信度。的确，每一种科学理论本质上都要具备对尚未观察到的自然事件或现象作出预测的能力。 另一个经典的例子是科学家们对特立尼达岛阿立波河中的虹鳉鱼进行的观察与实验。按照进化理论，不同时间尺度上的自然选择可能产生全然不同的进化效应。在仅仅几个时代的周期内，生物个体就有可能产生小规模的变异，可称之为微进化（microevolution）。科学家们发现，生活在阿立波河中的虹鳉鱼无论是其幼体还是成体均遭受较大鱼类的捕食，生活在河流上游小溪中的虹鳉鱼只有其幼体会被较小鱼类捕食，因而长期的进化过程导致该河流中的虹鳉鱼个体较小（更易于躲避捕食者），而溪流中的虹鳉鱼则个体较大（不易被较小的鱼类捕食）。科学家们将河流中的虹鳉鱼置于原来没有虹鳉鱼种群的溪流中，发现它们仅仅在20代后就进化出了溪流中虹鳉鱼的特性[3]。 毋庸讳言，在科学上，我们不可能绝对肯定地证明某种解释是完美无缺的，或者是终结性的。然而，迄今为止，许多科学解释已经被人们反复检验，不断增添的新观察结果或新的实验分析很难对其作出重大改变。换言之，科学界已广泛接受这些解释，它们是以观察自然世界获得的证据为基础的。进化理论就是其中一个代表。从这一点出发，我们可以明确地将
分子生物学复习题(有详细答案)
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绪论 思考题：（P9） 1.从广义和狭义上写出分子生物学的定义？ 广义上讲的分子生物学包括对蛋白质和核酸等生物大分子结构与功能的研究，以及从分子水平上阐明生命的现象和生物学规律。 狭义的概念，即将分子生物学的范畴偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA结构与功能、复制、转录、表达和调节控制等过程。其中也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。 2、现代分子生物学研究的主要内容有哪几个方面？什么是反向生物学？什么是 后基因组时代？ 研究内容： DNA的复制、转录和翻译；基因表达调控的研究；DNA重组技术和结构分子生物学。 反向生物学：是指利用重组DNA技术和离体定向诱变的方法研究已知结构的基因相应的功能，在体外使基因突变，再导入体内，检测突变的遗传效应，即以表型来探索基因结构。 后基因组时代：研究细胞全部基因的表达图式和全部蛋白质图式，人类基因组研究由结构向功能转移。 3、写出三个分子生物写学展的主要大事件（年代、发明者、简要内容） 1953年Watson和Click发表了“脱氧核糖核苷酸的结构”的著名论文，提出了DNA的双螺旋结构模型。 1972~1973年，重组DNA时代的到来。H.Boyer和P.Berg等发展了重组DNA 技术，并完成了第一个细菌基因的克隆，开创了基因工程新纪元。 1990~2003年美、日、英、法、俄、中六国完成人类基因组计划。解读人类遗传密码。 4、21世纪分子生物学的发展趋势是怎样的？ 随着基因组计划的完成，人类已经掌握了模式生物的所有遗传密码。又迎来了后基因组时代，人类基因组的研究重点由结构向功能转移。相关学说理论相应诞生，如功能基因组学、蛋白质组学和生物信息学。生命科学又进入了一个全新的时代。 第四章 思考题：（P130） 1、基因的概念如何？基因的研究分为几个发展阶段？ 概念：基因是原核、真核生物以及病毒的DNA和RNA分子中具有遗传效应的核苷酸序列，是遗传的基本单位和突变单位以及控制形状的功能单位。 发展阶段：○120世纪50年代以前，主要从细胞的染色体水平上进行研究，属于基因的染色体遗传学阶段。 ○220世纪50年代以后，主要从DNA大分子水平上进行研究，属于分
《分子生物学大（综合）实验》课程介绍 课程代码（学校统一编制） 课程名称分子生物学大（综合）实验 英文名称MolecularBiologyBigExperiment 学分：3修读期：第七学期 授课对象：生物科学、生物技术 课程主任：姓名、职称、学位 关洪斌，副教授，博士 课程简介 21世记是生命科学的世记,而分子生物学是带动生命科学的前沿科学。分子生物学是在生物大分子水平上研究细胞的结构、功能及调控的学科,在现代生物学学科发展中的重要性与不容置疑的带头作用是众所周知的。许多重大的理论和技术问题都将依赖于分子生物学的突破。随着分子生物学研究工作的不断深入,相关实验技术方法和技术日新月异的发展。为了适应分子生物学研究工作日益发展的需要,满足培养从事现代生物学研究,尤其是进行分子生物学研究的人才的需要,特设置分子生物学大（综合）实验课程。本课程的教学目标和基本要求是使学习者基本掌握分子生物学实验技术的基本原理和方法,教学内容包括TRIZOL试剂盒提取RNA、RNA质量的检测、RT-PCR和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测cDNA。通过本实验可提高学生的动手能力和创造性思维能力,较好地掌握分子生物学实验操作和技能，为今后独立进行科研工作打下坚实基础。 实践教学环节（如果有） 实验内容包括TRIZOL试剂盒提取RNA、RNA质量的检测、RT-PCR和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测cDNA。 课程考核 实验报告 指定教材 自编 参考书目 1.分子生物学实验指导高等教育出版社施普林格出版社，1999 2.彭秀玲,袁汉英等.基因工程实验技术.湖南科学技术出版社,1997 3.吴乃虎.基因工程原理(上下册).科学出版社,1998 4.F.奥斯伯等著:颜子颖,王海林译.分子克隆实验指南(第二版).科学出版社,1998 5.J.萨姆布鲁克等著:金冬雁,黎孟枫等译.精编分子生物学实验指南.科学出版社,1993
分子生物学笔记 ? ?第一章基因的结构第一节基因和基因组 一、基因(gene) 是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列． 一个典型的真核基因包括 ①编码序列—外显子(exon) ②插入外显子之间的非编码序列—内合子(intron) ③5'-端和3'-端非翻译区(UTR) ④调控序列(可位于上述三种序列中) 绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene)，外显子不连续。 二、基因组(genome) 一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和， 基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。 人基因组3X1 09(30亿bp)，共编码约10万个基因。 每种真核生物的单倍体基因组中的全部DNA量称为C值，与进化的复杂性并不一致(C-value Paradox)。 人类基因组计划（human genome project, HGP） 基因组学（genomics）,结构基因组学（structural genomics）和功能基因组学（functional genomics）。蛋白质组（proteome）和蛋白质组学（proteomics）
第二节真核生物基因组 一、真核生物基因组的特点：， ①真核基因组DNA在细胞核内处于以核小体为基本单位的染色体结构中． ②真核基因组中，编码序列只占整个基因组的很小部分(2—3％)， 二、真核基因组中DNA序列的分类？ (一)高度重复序列(重复次数>lO5) 卫星DNA(Satellite DNA) (二)中度重复序列 1．中度重复序列的特点 ①重复单位序列相似，但不完全一样， ②散在分布于基因组中． ③序列的长度和拷贝数非常不均一， ④中度重复序列一般具有种属特异性，可作为DNA标记． ⑤中度重复序列可能是转座元件(返座子)， 2．中度重复序列的分类 ①长散在重复序列(long interspersed repeated segments．)LINES ②短散在重复序列(Short interspersed repeated segments)SINES SINES：长度<500bp，拷贝数>105．如人Alu序列 LINEs：长度>1000bp(可达7Kb),拷贝数104-105，如人LINEl (三)单拷贝序列(Unique Sequence) 包括大多数编码蛋白质的结构基因和基因间间隔序列， 三、基因家族(gene family)
现代分子生物学 第一章 DNA的发现： 1928年，英国Griffith的体内转化实验 1944年，Avery的体外转化实验 1952年，Hershey和Chase的噬菌体转导实验 分子生物学主要研究内容（p11） DNA的重组技术 基因表达调控研究 生物大分子的结构功能研究——结构分子生物学 基因组，功能基因组与生物信息学研究 第二章 DNA RNA组成 脱氧核糖核酸 A T G C 核糖核酸 A U G C 原核生物DNA的主要特征 ①一般只有一条染色体且带有单拷贝基因； ②整个染色体DNA几乎全部由功能基因与调控序列组成； ③几乎每个基因序列都与它所编码的蛋白质序列呈线性对应状态。 染色体作为遗传物质的特点： （1）分子结构相对稳定（贮存遗传信息） （2）通过自我复制使前后代保持连续性（传递遗传信息） （3）通过指导蛋白质合成控制生物状态（表达遗传信息） （4）引起生物遗传的变异（改变遗传信息） C值以及C值反常 C值单倍体基因组DNA的总量 C值反常C值往往与种系进化的复杂程度不一致，某些低等生物却有较大的C值。如果这些DNA 都是编码蛋白质的功能基因，那么，很难想象在两个相近的物种中，他们的基因数目会 相差100倍，由此推断，许多DNA序列可能不编码蛋白质，是没有生理功能的。 DNA的中度重复序列，高度重复序列 中度各种rRNA，tRNA以及某些结构基因如组蛋白基因都属于这一类 高度卫星DNA 核小体 是由H2A H2B H3 H4 各2分子生成的八聚体和约200bp的DNA构成的，H1在核小体外面。 真核生物基因组的结构特点 ①基因组庞大； ②大量重复序列； ③大部分为非编码序列，90％以上； ④转录产物为单顺反子； ⑤断裂基因； ⑥大量的顺式作用元件； ⑦DNA多态性：SNP和串联重复序列多态性； ⑧端粒（telomere）结构。
基于特定引物PCR的DNA分子标记技术研究进展 摘要： PCR是一种选择性体外扩增DNA的方法，分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种比较理想的遗传标记技术。SSR、SCAR、SRAP 和TRAP是四种最新发展的基于特定引物PCR的新型DNA分子标记技术，具有简便、高效、重复性好等优点，已在遗传育种的种质资源等各个方面得到广泛应用。介绍了这四种分子标记的基本原理和特点，综述了它们在分子生物学研究中的应用。 关键词：分子标记SSR SCAR SRAP TRAP DNA分子标记技术的研究始于1980年，本质上是指能反映生物个体或种群间基因组某种差异的特异性DNA片段，DNA分子标记大多以电泳谱带的形式表现生物个体之间DNA差异，通常也称DNA的指纹图谱。与其他几种遗传标记相比具有的优越性有：大多数分子标记为显性，对隐性的农艺形状的选择十分便利;基因组变异及其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标形状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。目前DNA分子标记技术已有数十种，主要可分为4大类:基于分子杂交的DNA 分子标记技术;基于随机/特定引物PG R的DNA分子标记技术;基子限制性酶切与PCR技术的分子标记技术;基于芯片技术的DNA分子标记技术。概述新型的基于特定引物PCR的DNA分子标记技术，包括SSR,SCAR,SRAP和TRAP。目前这些I3;VA分子标记技术的应用仍具有相当的局限性，如何将它们有效地利用于分子生物学研究是函待解决的问。 1序列特异扩增区域SCAR 1. 1 SCAR标记的原理 序列特异扩增区域(sequence characterised am-plifiedreginn)简称SCAR标记，是1993年Paran和Michelma记[1]]建立的一种可靠、稳定、可长期利用的RAPD 标记技术。SCAR标记的基本流程:先用随机引物进行RAPD筛选，获取特异的RAPD标记，然后对标记进行克隆和测序，根据测定RADII标记两末端的序列设计一对引物，此引物通常包含有原来的RAPD引物序列，多为20-24，再用该引物对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，这样就可以把与原来的RAPI3片段相对应的单一位点鉴定出来。 1. 2 SCAR标记的特点 SCAR标记方便、快捷、可靠，适合于大量个体的快速检测，结果稳定性好，重复性高。由干SCAR标记使用的引物长，因而试验的可重复性高，它克服了RAPD重复性欠佳的弱点，同时具有STS标记的优点，因此比RAPn及其他利用随机引物的方法在基因定位和作图中的应用要好，在分子标记辅助育种、种质资源鉴别等方面有着潜在的应用前景，SCAR标记是共显性遗传的。待检DNA间的差异可直接通过有无扩增产物来显示，这甚至可省却电泳的步骤。由于RAPD 扩增过程中错配几率较高，RAPD标记片段同源性高导致SCAR标记的转化成功
第一章绪论 2.写出DNA和RNA的英文全称。 答：脱氧核糖核酸（DNA, Deoxyribonucleic acid），核糖核酸（RNA, Ribonucleic acid）4.早期主要有哪些实验证实DNA是遗传物质？写出这些实验的主要步骤。 答：一，肺炎双球菌感染实验，1，R型菌落粗糙，菌体无多糖荚膜，无毒，注入小鼠体内后，小鼠不死亡。2，S型菌落光滑，菌体有多糖荚膜，有毒，注入到小鼠体内可以使小鼠患病死亡。3，用加热的方法杀死S型细菌后注入到小鼠体内，小鼠不死亡； 二，噬菌体侵染细菌的实验：1，噬菌体侵染细菌的实验过程：吸附→侵入→复制→组装→释放。2，DNA中P的含量多，蛋白质中P的含量少；蛋白质中有S而DNA中没有S，所以用放射性同位素35S标记一部分噬菌体的蛋白质，用放射性同位素32P标记另一部分噬菌体的DNA。用35P标记蛋白质的噬菌体侵染后，细菌体内无放射性，即表明噬菌体的蛋白质没有进入细菌内部；而用32P标记DNA的噬菌体侵染细菌后，细菌体内有放射性，即表明噬菌体的DNA进入了细菌体内。 三，烟草TMV的重建实验：1957年，Fraenkel-Conrat等人，将两个不同的TMV株系（S株系和HR株系）的蛋白质和RNA分别提取出来，然后相互对换，将S株系的蛋白质和HR株系的RNA，或反过来将HR株系的蛋白质和S株系的RNA放在一起，重建形成两种杂种病毒，去感染烟草叶片。 6.说出分子生物学的主要研究内容。 答：1，DNA重组技术；2，基因表达调控研究；3，生物大分子的结构功能研究----结构分子生物学；4，基因组、功能基因组与生物信息学研究。 第二章染色体与DNA 3.简述真核生物染色体的组成及组装过程 真核生物染色体除了性细胞外全是二倍体，DNA以及大量蛋白质及核膜构成的核小体是染色体结构的最基本单位。核小体的核心是由4种组蛋白（H2A、H2B、H3和H4）构成的扁球状8聚体。 蛋白质包括组蛋白与非组蛋白。组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体，含有大量赖氨酸核精氨酸。非组蛋白包括酶类与细胞分裂有关的蛋白等，他们也有可能是染色体的结构成分 由DNA和组蛋白组成的染色体纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构。 1.由DNA与组蛋白包装成核小体，在组蛋白H1的介导下核小体彼此连接形成直径约10nm的核小体串珠结构，这是染色质包装的一级结构。 2.在有组蛋白H1存在的情况下，由直径10nm的核小体串珠结构螺旋盘绕，每圈6个核小体，形成外径为30nm，内径10nm，螺距11nm的螺线管，这是染色质包装的二级结构。 3.由螺线管进一步螺旋化形成直径为0.4μm的圆筒状结构，称为超螺线管，这是染色
分子生物学手段 在土壤污染生物修复中的应用 摘要: 污染土壤的修复技术主要有物理修复、化学修复和生物修复，文章 综述了分子生物学技术包括环境微生物群落降解基因分析、16S rRNA序列 分析技术以及荧光原位杂交技术在生物修复技术中跟踪污染土壤中降解微 生物行为、监测降解基因和微生物群落变化，揭示了其中的分子机制的应 用现状，对各项技术应用中需要注意的问题进行了讨论并对其发展前景进 行了展望。 关键词: 分子生物学；降解基因；16S rRNA；FISH Molecular biology techniques in bioremediation of soil: Current status and future Abstract：This review starts with a brief overview of the molecular biology techniques applied to the bioremediation of soil. The principles of the catabolic gene probe analysis of microbial community, 16S rRNA sequence analysis and fluorescent in situ hybridization (FISH) and their applications to monitoring the fate of contaminant-degrading microorganisms, detecting catabolic gene and analyzing the changes of microbial community in contaminated soil are highlighted. The problems and prospects of these techniques are discussed. Key words: molecular biology; catabolic gene; 16S rRNA; FISH
分子生物学笔记第一章基因的结构 第一节基因和基因组 一、基因(gene)是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列. 一个典型的真核基因包括 ①编码序列—外显子(exon)②插入外显子之间的非编码序列—内合子(intron)③5'-端和3'-端非翻译区(UTR) ④调控 序列(可位于上述三种序列中) 绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene) ，外显子不连续。 二、基因组(genome) 一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和，基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。人基因组3X1 09(30亿bp)，共编码约10万个基因。 每种真核生物的单倍体基因组中的全部DNA量称为C值，与进化的复杂性并不一致(C-value Paradox)。 人类基因组计划( human genome project, HGP ) 基因组学( genomics ),结构基因组学( structural genomics )和功能基因组学( functional genomics )。 蛋白质组( proteome )和蛋白质组学( proteomics ) 第二节真核生物基因组 一、真核生物基因组的特点：， ①真核基因组DNA在细胞核内处于以核小体为基本单位的染色体结构中. ②真核基因组中，编码序列只占整个基因组的很小部分(2 —>% ), 三、基因家族(gene family) 一组功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因. 可能由某一共同祖先基因(ancestral gene) 经重复(duplication) 和突变产生。 基因家族的特点： ①基因家族的成员可以串联排列在一起，形成基因簇(gene cluster)或串联重复基因(tandemly repeated genes)，如 rRNA、tRNA和组蛋白的基因；②有些基因家族的成员也可位于不同的染色体上，如珠蛋白基因；③有些成员不产生 有功能的基因产物，这种基因称为假基因(Pseudogene) . ￥ a1表示与a1相似的假基因. 四、超基因家族(Supergene family ，Superfamily) 由基因家族和单基因组成的大基因家族，结构上有程度不等的同源性，但功能不同． 第四节细菌和病毒基因组 一、细菌基因组的特点。 1 ．功能相关的几个结构基因往往串联在—起，受它们上游的共同调控区控制，形成操纵子结构，2．结构基因中没有内含子，也无重叠现象。 3 .细菌DNA大部分为编码序列。 二、病毒基因组的特点 1 .每种病毒只有一种核酸，或者DNA，或者RNA ; 2 .病毒核酸大小差别很大，3X10 3 一3X106bp ; 3.除逆病毒外，所有病毒基因都是单拷贝的。 4 .大部份病毒核酸是由一条双链或单链分子(RNA或DNA)，仅少数RNA病毒由几个核酸片段组成. 5. 真核病毒基因有内含子，而噬菌体(感染细菌的病毒)基因中无内含子. 6. 有重叠基因. 第五节染色质和染色体 (二)组蛋白(histone): 一类小的带有丰富正电荷<富含Lys，Arg)的核蛋白，与DNA有高亲和力. (二).端粒(telomere) ：真核生物线状染色体分子末端的DNA 区域端粒DNA的特点： 1、由富含G的简单串联重复序列组成(长达数kb). 人的端粒DNA重复序列：TTAGGC。
分子生物学（molecular biology ）从分子水平研究作为生命活动主要物质基础的生物大分子结构与功能，从而阐明生命现象本质的科学。 重点研究下述领域： （1）蛋白质（包括酶）的结构和功能。 （2）核酸的结构和功能，包括遗传信息的传递。 （3）生物膜的结构和功能。 （4）生物调控的分子基础。 （5）生物进化。 分子生物学是第二次世界大战后，由生物化学,`遗传学,微生物学,病毒学,结构分析及高分子化学等不同研究领域结合而形成的一门交叉科学。目前分子生物学已发展成生命科学中的带头学科。 随着DNA的内部结构和遗传机制的秘密一点一点呈现在人们眼前，特别是当人们了解到遗传密码是由RNA转录表达的以后，生物学家不再仅仅满足于探索、提示生物遗传的秘密，而是开始跃跃欲试，设想在分子的水平上去干预生物的遗传特性。 如果将一种生物的DNA中的某个遗传密码片断连接到另外一种生物的DNA链上去，将DNA 重新组织一下，就可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型，这与过去培育生物繁殖后代的传统做法完全不同。 这种做法就像技术科学的工程设计，按照人类的需要把这种生物的这个“基因”与那种生物的那个“基因”重新“施工”，“组装”成新的基因组合，创造出新的生物。这种完全按照人的意愿，由重新组装基因到新生物产生的生物科学技术，就称为“基因工程”，或者说是“遗传工程”。 生物学的研究可以说长期以来都是科研的重点，惟其所涉及的方方面面与人类生活紧密相连。本世纪50年代以前的生物学研究，虽然有些已进入了微观领域，但总的来说，主要是研究生物个体组织、器官、细胞或是亚细胞这些东西之间的相互关系。50年代中期，随着沃森和克里克揭示出DNA分子的空间结构，生物学才真正开始了其揭开分子水平生命秘密的研究历程。到70年代，重组DNA技术的发展又给人们提供了研究DNA的强有力的手段，于是分子生物学就逐渐形成了。顾名思义，分子生物学就是研究生物大分子之间相互关系和作用的一门学科，而生物大分子主要是指基因和蛋白质两大类；分子生物学以遗传学、生物化学、细胞生物学等学科为基础，从分子水平上对生物体的多种生命现象进行研究；分子生物学在理论和实践中的发展也为基因工程的出现和发展打下了良好的基础，因此可以说基因工程就是分子生物学的工程应用。现在基因工程所展现出的强大生命力和巨大的经济发展潜力完全得益于分子生物学的迅猛发展，而且有证据表明，基因工程的进一步发展仍然要依赖于分子生物学研究的发展。 分子生物学是从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学。自20世纪50年代以来，分子生物学一直是生物学的前沿与生长点，其主要研究领域包括蛋白质体系、蛋白质-核酸体系和蛋白质-脂质体系。 生物大分子，特别是蛋白质和核酸结构功能的研究，是分子生物学的基础。现代化学和物理
分子生物学课程论文
PCR技术发展与应用的研究进展 王亚纯 09120103 摘要：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)是最常用的分子生物学技术之一，通过变性、退火和延伸的循环来完成核酸分子的大量扩增．定量PCR技术是克服了原有的PCR技术存在的不足，能准确敏感地测定模板浓度及检测基因变异等，快速PCR技术快速PCR在保证PCR反应特异性、灵敏性和保真度的前提下，在更短时间内完成对核酸分子的扩增．mRNA 差异显示PCR技术是在基因转录水平上研究差异表达和性状差异的有效方法之一．近年来已经开展了许多这三方面的研究工作，本文就定量PCR技术、快速PCR技术、mRNA差异显示PCR技术作一综述，以便更好地理解及应用这项技术。 关键字：定量PCR；荧光PCR；快速PCR；DNA聚合酶；mRNA差异显示PCR 0 前言 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术由于PCR简便易行、灵敏度
高等优点，该技术被广泛应用于基础研究。但是，由于传统的PCR技术不能准确定量，且操作过程中易污染而使得假阳性率高等缺点，使其在临床上的应用受到限制[1]。鉴于此，对PCR产物进行准确定量便成为迫切的需要。几经探索，先后出现了多种定量PCR (quantitative PCR，Q-PCR)方法，其中结果较为可靠的是竞争性PCR和荧光定量PCR(fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR)。 随着生命科学和医学检测的不断发展，人们越来越希望在保证PCR反应特异性、灵敏性、保真度的同时，能够尽量缩短反应的时间，即实现快速PCR(Rapid PCR or Fast PCR)。快速PCR 技术不仅可使样品在有限的时间内可以尽快得到扩增，而且可以显著增加可检测的样品数量，显然，在大批量样本检测和传染病快速诊断等方面将会有重要的应用前景。例如，快速PCR在临床检测中可大大加快疾病的诊断效率；在生物恐怖袭击时能有效帮助快速鉴定可疑物中有害生物的存在与否；同时，由于PCR已经渗入到现代生物学研究的各个方面，快速PCR的实现必然可以使许多科学研究工作的进展显著加快，最终影
列〃一个典型的真核基因包括 ①编码序列—外显子(exon) ②插入外显子之间的非编码序列—内合子(intron) ③5'-端和 3'-端非翻译区(UTR) ④调控序列(可位于上述三种序列中) 绝大多数真核基因是断 裂基因(split-gene)，外显子不连续。二、基因组(genome) 一 特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和，基因组的大小 用全部 DNA 的碱基对总数表示。 人基因组 3X1 09(30 亿 bp)，共编码约 10 万个基因。 每种真核生物的单倍体基因组中的全部 DNA 量称为 C 值，与进化的复杂性并不一致(C-value Paradox)。 人类基因组计划（human genome project, HGP）基因组学（genomics）,结构基因组学（structural genomics）和功能基因组学（functional genomics）。 蛋白质组（proteome）和蛋白质组学（proteomics） 第二节真核生物基因组一、真核生物基因组的特 点：， ①真核基因组 DNA 在细胞核内处于以核小体为基本单位的染色体结构中〃 ②真核基因组中，编码序列只占整个基因组的很小部分(2—3％)， 二、真核基因组中 DNA 序列的分类 • (一)高度重复序列(重复次数>lO5) 卫星 DNA(Satellite DNA) (二)中度重复序列 1〃中度重复序列的特点
①重复单位序列相似，但不完全一样， ②散在分布于基因组中〃 ③序列的长度和拷贝数非常不均一， ④中度重复序列一般具有种属特异性，可作为 DNA 标记〃 ⑤中度重复序列可能是转座元件(返座子)， 2〃中度重复序列的分类 ①长散在重复序列(long interspersed repeated segments〃) LINES ②短散在重复序列(Short interspersed repeated segments) SINES SINES：长度<500bp，拷贝数>105〃如人 Alu 序列 LINEs：长
第一章、基因的结构和功能实体及基因组 1、基因定义 基因（遗传因子）是遗传的物质基础，是DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，携带有遗传信息的DNA序列，是具有遗传效应的DNA分子片段，是控制性状的基本遗传单位，通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现。 2、DNA修复 DNA修复（DNA repairing）是细胞对DNA受损伤后的一种反应，这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能；但有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能够耐受这DNA的损伤而能继续生存。也许这未能完全修复而存留下来的损伤会在适合的条件下显示出来（如细胞的癌变等），但如果细胞不具备这修复功能，就无法对付经常在发生的DNA损伤事件，就不能生存。对不同的DNA损伤，细胞可以有不同的修复反应。3、DNA损伤 DNA损伤是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变，并导致遗传特征改变的现象。情况分为：substitutation （替换）deletion （删除）insertion （插入）exon skipping （外显子跳跃）。 DNA损伤的改变类型：a、点突变：指DNA上单一碱基的变异。嘌呤替代嘌呤（A与G之间的相互替代）、嘧啶替代嘧啶（C与T之间的替代）称为转换（transition）；嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为颠换（transvertion）。b、缺失：指DNA链上一个或一段核苷酸的消失。c、插入：指一个或一段核苷酸插入到DNA链中。在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不是3的整倍数，则发生读框移动（reading frame shift），使其后所译读的氨基酸序列全部混乱，称为移码突变（frame-shift mutaion）。d、倒位或转位：（transposition）指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。 e、双链断裂：对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件。 4、同源重组 同源重组，（Homologus Recombination)是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。同源重组反应通常根据交叉分子或holiday 结构（Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。 a、基因敲除 基因敲除（geneknockout），是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 b、因转移法 同源重组(homologousrecombination)是将外源基因定位导人受体细胞染色体上的方法，因为在该座位有与导人基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换有缺陷的基因片段，达到修正缺陷基因的目的。位点特异性重组是发生在两条DNA链特异位点上的重组，重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点；attachmentsite，att)和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶仅能催化特异性位点间的重组，因而重组具有特异性和高度保守性。
中国因大豆最新研究进展报告（专题三） 摘要：大豆是重要的油料作物和饲料作物，也是人类的主要食用蛋白和工业原料的来源。而转基因是一种将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰的现代技术。目前，越来越多的转基因技术运用到食品医药行业当中。大豆的转基因研究是国内外植物分子生物学研究的热点之一，通过将目的基因整合到大豆基因中，可获得抗虫大豆，其出油率也高于普通大豆。转基因大豆已成为世界大豆主产国大豆产业发展的主要动力。本文概述转基因大豆依据的主要理论，目前国内研究进展，转基因大豆的现状及其安全问题等等。 关键词：转基因大豆食品安全研究进展外源基因现状 前言：大豆是重要的油料作物和高蛋白粮饲兼用作物，含有丰富的蛋白质、脂肪和多种人体有益的生理活性物质。随着基因工程研究的升入，用转基因来改变大豆的性状已被广泛应用。转基因大豆最早的报道是1984年De Bloke等和Horsch 等的研究结果。1988年，McCabe和Hinchee分别用基因枪轰击大豆未成熟胚生长点和用农杆菌侵染大豆子叶节的方法获得转基因植株。1994年5月，美国孟山都公司培育的抗草甘膦除草剂转基因大豆首先获准在美国商业化种植。1997年，杜邦公司获得美国食品药物管理局批准推广种植高油酸转基因大豆。1998年AgrEvo公司研制的抗草丁膦大豆被批准进行商业化生产。转基因大豆品种的育成和推广是世界大豆科技史上具有里程碑意义的重大突破，已成为世界大豆发展生产的主流趋势。 1转基因大豆简介 转基因大豆最早来源于美国，1996年春，美国伊利诺伊西部许多农场主种植了一种大豆新品种，这种大豆是移植了矮牵牛的一种基因。这个新大豆品种可以抵抗杀草剂——草甘膦（毒滴混剂）。草甘膦会把普通大豆植株与杂草一起杀死。这是人类历史上第一次成功培育转基因大豆。 转基因大豆包括抗草胺膦转基因大豆，抗磺酰脲类除草剂转基因大豆，抗草甘膦转基因大豆等等。目前以抗草甘膦为目标而创制出的抗除草剂作物占绝对优势，其中尤以抗草甘膦大豆在世界范围内种植面积最广。 2转基因大豆的主要理论 2.1 转基因技术理论
现代分子生物学考研复习资料整理 第一章绪论 分子生物学：是研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构及其重要性、规律性和相互关系的科学 分子生物学的主要研究内容 1、DNA重组技术 2、基因表达调控研究 3、生物大分子的结构功能研究——结构分子生物学 4、基因组、功能基因组与生物信息学研究 5、DNA的复制转录和翻译 第二章染色体与DNA 半保留复制：DNA在复制过程中碱基间的氢键首先断裂，双螺旋解旋并被分开，每条链分别作为模板合成新链，产生互补的两条链。这样新形成的两个DNA分子与原来DNA分子的碱基顺序完全一样，因此，每个子代分子的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，所以这种复制方式被称为DNA半保留复制 DNA半不连续复制：DNA双螺旋的两条链反向平行，复制时，前导链DNA的合成以5′-3′方向，随着亲本双链体的解开而连续进行复制；后随链在合成过程中，一段亲本DNA单链首先暴露出来，然后以与复制叉移动相反的方向、按照5′-3′方向合成一系列的冈崎片段，然后再把它们连接成完整的后随链，这种前导链的连续复制和后随链的不连续复制称为DNA 的半不连续复制 原核生物基因组结构特点：1、基因组很小，大多只有一条染色体2、结构简练3、存在转录单元，多顺反子4、有重叠基因 真核生物基因组的结构特点：1、真核基因组庞大，一般都远大于原核生物的基因组2、真核基因组存在大量的重复序列3、真核基因组的大部分为非编码序列，占整个基因组序列的90％以上，该特点是真核生物与细菌和病毒之间最主要区别4、真核基因组的转录产物为单顺反子5、真核基因是断裂基因，有内含子结构6、真核基因组存在大量的顺式作用元件，包括启动子、增强子，沉默子等7、真核基因组中存在大量的DNA多态性8、真核基因组具有端粒结构 DNA转座（移位）是由可移位因子介导的遗传物质重排现象 DNA转座的遗传学效应：1、转座引入插入突变2、转座产生新的基因3、转座产生的染色体畸变4、转座引起生物进化 转座子分为插入序列和复合型转座子两大类 环状DNA复制方式：θ型、滚环型和D-环型 第三章生物信息的传递（上）从DNA到RNA 转录：指拷贝出一条与DNA链序列完全相同的RNA单链的过程 启动子：是一段位于结构基因5′段上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合并具有转录起始的特异性 原核生物启动子结构：存在位于-10bp处的TATA区和-35bp处的TTGACA区，其是RNA聚合酶与启动子的结合位点，能与σ因子相互识别而具有很高的亲和力 终止子：是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列（促进转录终止的DNA序列） 终止子的类型：不依赖于ρ因子和依赖于ρ因子 增强子：能增强或促进转录起始的序列 增强子的特点：1、远距离效应2、无方向性3、顺式调节4、无物种和基因的特异性5、具