实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化
【实验目的】
熟悉利用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的操作及质粒转化大肠杆菌的方法。
【实验原理】
当大肠杆菌生长到OD600约为0.2~0.4时，用冰冷的氯化钙低渗溶液处理大肠杆菌细胞，细胞膨胀成球形，可使大肠杆菌进入一种易于接受外源DNA的状态（感受态），处于此状态的细胞称为感受态细胞（competent cells）。此时，若在感受态细胞中加入质粒，则质粒DNA与Ca2+形成的复合物粘附于细胞表面，经过42℃短暂的热激处理后，DNA与Ca2+形成的复合物进入大肠杆菌细胞，在不含抗生素的培养基中短暂培养，使转入大肠杆菌质粒上的抗生素抗性基因表达，在含相应抗生素的选择培养基上可将转化菌（含质粒）与未转化细菌分开，转化细菌经过不断分裂增殖形成菌落，而未转化的细菌则不能。
【器材与试剂】
1．实验仪器培养箱，恒温摇床，超净工作台，低温台式离心机，分光光度计，水浴锅，高压灭菌锅，微孔滤器（含0.22μm滤膜），酒精灯
2．实验试剂氯化钠（AR），无水氯化钙（AR），蛋白胨，酵母提取物，1.0 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，琼脂粉，LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，800 mL 蒸馏水溶解后，用NaOH溶液调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min；LB固体培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，800 mL蒸馏水溶解后，用1.0 mol/L NaOH调pH至7.0，蒸馏水定容至1 000 mL，然后加入琼脂粉15 g，121℃高压灭菌20min，分别倒入无菌培养皿。若配制选择性培养基，当温度降至60℃左右时，加入1 mL氨苄青霉素溶液（100mg/mL），混匀，分别倒入无菌培养皿；CaCl2溶液：准确称取无水氯化钙11.1 g，用双蒸水溶解，并定容至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min，4℃保存；氨苄青霉素钠溶液：准确称取氨苄青霉素钠0.5 g，用蒸馏水溶解并定容至5 mL，用微孔滤器过滤除菌后，分装于Eppendorf管中，-20℃保存。
3.实验材料E.coli DH5α, pUC18质粒
【实验步骤】
1．接种大肠杆菌单菌落于2 mL LB液体培养基中，37℃振荡（约250r/min）培养过夜。2. 将2 mL过夜培养物转接到盛有100 mL的LB液体培养基的500 mL三角瓶中，37℃继续振荡培养至OD600约为0.2~0.4（约2 h）。
3．取1 mL培养物于一灭菌的Eppendorf 管中，冰浴放置10～30 min，4℃，1 500×g离心5 min，弃上清。
4．沉淀用0.2 mL冰冷氯化钙溶液轻轻悬浮，冰浴放置15 min，4℃，1 500×g离心5 min，弃上清。
5．沉淀再用0.2 mL氯化钙溶液轻轻悬浮，放置在冰浴中，制成大肠杆菌感受态细胞。
6. 取5 μL pUC18质粒(不超过10 ng)，加入制好的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30 min。
7. 42℃热激90 s后，迅速置于冰浴5 min。
8. 加入800 μL培养基，37℃振荡（100 r/min）温育1 h，使pUC18上的氨苄青霉素抗性基因得以表达。
9. 取200 μL涂布于含氨苄青霉素钠(100 μg/mL)的LB固体培养基上, 正向放入37℃培养箱中培养1 h，再倒置培养过夜至菌落清晰，统计菌落数量。
【注意事项】
1．应使用处于对数生长期的大肠杆菌细胞，OD600最好不超过0.4。
2．整个实验最好在低温环境下进行，以获得较高的转化效率。
3．每次悬浮沉淀细胞要轻缓，避免剧烈振荡。
【实验作业】
根据质粒的用量，计算本实验制备感受态的转化率（cfu/μg DNA）。
参考文献
1．卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京：高等教育出版社，1993. 287~289
2．刘进元等. 分子生物学实验指导. 北京：清华大学出版社，2002. 22~25
3．Cohen SN, Chang ACY, Hsu L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: Genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proc Natl Acad Sci USA, 1972,69:2110 4. 魏群.分子生物学实验指导.北京：高等教育出版社，1999.53～55
实验二质粒的提取与琼脂糖凝胶电泳分析
【实验目的】
熟悉碱法提取质粒以及DNA的琼脂糖电泳分析的原理和方法。
【实验原理】
在碱性条件下，染色体DNA发生变性，共价闭合的质粒DNA仍为自然状态。当溶液调至中性且有高浓度的盐存在条件下，变性的染色体DNA交联成不溶性的网格结构，变性的染色体DNA与蛋白质发生共沉淀，而质粒DNA仍存在于上清液中，通过离心去除沉淀，溶液中的质粒DNA可被异丙醇沉淀。
DNA在碱性的电泳缓冲溶液中因带负电荷，电泳时向正极移动，不同DNA的电泳迁移率与其分子长度与形态有关，DNA分子越大，则迁移率越小，因此，通过电泳可将不同长度的DNA分子分开。
【器材与试剂】
1．实验仪器细菌培养箱，控温摇床，高压灭菌锅，微量移液器，高速台式离心机，电泳仪，水平电泳槽，紫外分析仪，pH计，微波炉
2．实验试剂琼脂粉，100 mg/mL 氨苄青霉素钠，氯仿，异丙醇，70% 乙醇，琼脂糖，溴化乙锭，20 μg/mL RNase A， LB液体培养基，溶液I：50 mmol/L葡萄糖，10 mmol/L EDTA, 25 mmol/L Tris-Cl缓冲溶液（pH8.0）；溶液II：0.2 mol/L NaOH，1% SDS；溶液III: 3 mol/L 醋酸钾，5 mol/L 醋酸；TE缓冲溶液：10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0),1 mmol/L EDTA；TAE 缓冲溶液（50×）：2 mol/L Tris-乙酸，0.05 mol/L EDTA,pH8.0；载样缓冲溶液（10×）：0.25% 溴酚蓝，30%甘油。
3．实验材料转化pUC18的大肠杆菌（E.coli DH5α），λDNA/EcoR I, Hind III
【实验步骤】
一、质粒的提取
1．从平板上挑取转化pUC18的大肠杆菌的单菌落，接种于20 mL 含100 μg/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养基中，37℃，振荡（250 r/min）培养过夜。
2．取1.2 mL培养物置于Eppendorf管中，10 000 rpm离心1min，弃上清。
3．沉淀菌体用0.1 mL溶液I重新悬浮，加入0.2 mL溶液II，颠倒数次至溶液变得澄清，最后加入0.15 mL溶液III，轻轻颠倒Eppendorf管数次，10 000 rpm离心10 min。
4．上清液移入一个新的Eppendorf管中，加入0.2 mL氯仿，快速颠倒数次，10 000 rpm离心10 min，将上清液移入另一个Eppendorf管中，加入等体积异丙醇，混匀，10 000 rpm离
心10 min，弃上清。
5．向管中加入0.5 mL 70%乙醇，10 000 rpm，离心2 min，弃上清，室温挥干酒精，加入
20 μL 含20 μg/mL RNase A 的TE缓冲溶液溶解DNA。
二、琼脂糖凝胶电泳
1．称取1 g 琼脂糖，加入TAE缓冲溶液（1×）100 mL，微波炉加热熔化，配制 1%琼脂糖凝胶，稍微冷却后，倒入制胶模具，插好梳子，待胶凝固后，拔出梳子。
2．将凝胶连同制胶模具放入电泳槽，倒入TAE缓冲溶液（1×）使溶液没过胶面，取9 μL 提取的质粒与1 μL栽样缓冲溶液混合，用微量移液器点加到凝胶的加样孔内。
3．80～100 V 电泳，当溴酚蓝移动到距凝胶下边沿约1cm处时，停止电泳。
4．将凝胶浸泡在含0.5 μg/mL溴化乙锭的TAE缓冲溶液（1×）中染色30 min，于紫外分析仪内观察结果。
【注意事项】
1．质粒提取过程中，加入溶液II和溶液III后，要混匀，但动作要轻缓。
2．质粒沉淀后，由于量比较少，贴在管壁上，在洗涤时不要将其移走。
【实验作业】
1．说明溶液I、溶液II和溶液III的作用是什么？
2．在琼脂糖凝胶上，哪一条带为超螺旋DNA？为什么？
参考文献
1．卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京：高等教育出版社，1993. 107~108
2．刘进元等. 分子生物学实验指导. 北京：清华大学出版社，2002. 1~10
实验三重组DNA分子的构建
【实验目的】
熟悉DNA的酶切、片段回收、DNA连接、转化以及重组子的筛选的方法。
【实验原理】
DNA经限制性内切酶切割成大小不同的片段，电泳分离后，切胶回收目的片段，琼脂糖凝胶用高浓度的NaI溶液溶解后，玻璃奶（glass milk）可以吸附DNA，去除NaI后，用无菌水或TE缓冲溶液解吸附，获得DNA片段。回收的酶切质粒DNA与目的DNA片段，在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，构建重组子，重组子转化大肠杆菌后，提取重组DNA 分子进行酶切鉴定或利用其它方法如α-互补进行筛选。
【器材与试剂】
1．实验仪器细菌培养箱，恒温摇床，超净工作台，台式离心机，水浴锅，高压灭菌锅，微量移液器，电泳仪，电泳槽，紫外分析仪
2．实验试剂氯化钠（AR），蛋白胨，酵母提取物，氨苄青霉素钠，EcoR I, Hind III, 酶切缓冲液（买酶附赠），琼脂糖，TAE缓冲溶液（50×），玻璃奶（glass milk），NaI溶液（溶胶液）：称取NaI 90.8 g, Na2SO3 1.5 g，用无菌水溶解并定容至100 mL，4℃，避光保存；乙醇洗涤液：50 mL乙醇中含20 mmol/L Tris-Cl (pH7.4), 1 mmol/L EDTA，0.1 mol/L NaCl, -20℃保存；灭菌双蒸水，T4 DNA连接酶，T4 DNA连接酶缓冲液（购酶附赠），载样缓冲溶液（10×），X-gal溶液：20 mg 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）溶于1 mL二甲基甲酰胺中；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）溶液：1 g IPTG 溶于4 mL双蒸水，定容至5 mL，微孔滤器除菌，-20℃保存
3．实验材料E.coli DH5α, pUC18质粒，λDNA/EcoR I, Hind III
【实验步骤】
一、DNA的酶切
20 μL酶切体系含：2 μL 酶切缓冲液，5 μL pUC18质粒（约2μg），1 μL EcoR I ，1 μL Hind III, 11 μL无菌双蒸水。离心5 s, 混匀，37℃酶切30 min～1 h。
二、电泳分离
1．配制1%的琼脂糖凝胶，方法同前一实验。
2. 20 μLλDNA/EcoR I, Hind III（约2 μg）和酶切体系中分别加入2 μL载样缓冲溶液（10×），混匀，分别加样，电泳，具体方法如前一实验。
2．将凝胶在溴化乙锭染色液中染色30 min。
三、DNA回收
1．在紫外灯下将含线性pUC18质粒DNA和947 bp λDNA片段的凝胶分别切下置1.5 mL Eppendorf管中, 加入3倍于凝胶体积的NaI溶液溶解，50℃水浴溶胶，间或摇动，至凝胶完全溶解。
2．加入10 μL玻璃奶，混匀，室温放置5 min，8000 rpm离心1 min，弃上清。
3．沉淀用0.2 mL 的乙醇洗涤液悬浮，8000 rpm离心1 min，弃上清。
4．重复操作3
5. 将Eppendorf管开口于室温放置至玻璃粉变白，加入20 μL 无菌双蒸水悬浮，50℃水浴保温5 min。
6. 10 000 rpm离心5 min，分别取出上清置于一Eppendorf管。
四、DNA 连接
1．20 μL连接体系含：7 μL回收的pUC18质粒DNA，10 μL回收的λDNA片段，2 μL T4 DNA 连接酶缓冲液，1 μL T4 DNA连接酶。
2．12～16℃条件下，连接过夜。
五、转化
１．配制LB液体和固体培养基，方法同前。制备含100 μg/mL氨苄青霉素钠的LB培养基固体平板，将20 μL X-gal 和4 μL IPTG均匀涂布在每一平板表面，37℃，放置1 h。２. 取10 μL连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，取200 μL转化产物涂布在平板上，37℃培养过夜，观察菌落数量和颜色。
【注意事项】
1．溶胶的时候，一定要使凝胶溶解彻底，以免连接产物在12～16℃条件下重新凝固。2．操作过程中乙醇洗涤液一定要挥发干净，否则影响随后的连接反应。
【实验作业】
1．如果实验过程中进行的是单酶切，如何防止质粒的自身连接？
2．利用α-互补进行阳性克隆筛选的原理是什么？白色菌落含有重组子，还是蓝色菌落含有重组子？
参考文献
1. 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京：高等教育出版社，1993. 131, 300
2．刘进元等. 分子生物学实验指导. 北京：清华大学出版社，2002. 11~21
3. 朱玉贤，李毅. 现代分子生物学（第二版）. 北京：高等教育出版社，2002. 153
实验四聚合酶链式反应扩增DNA
【实验目的】
熟悉通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，简称PCR）体外扩增特定DNA 片段的技术原理和实验方法。
【实验原理】
PCR是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促DNA合成反应。反应分为三步：（1）变性（denaturation）: 双链DNA在高温条件下解开成单链；（2）退火（annealing）:当温度降低时，引物与单链模板DNA 的特定序列结合；（3）延伸（extension）: DNA聚合酶以单链DNA为模板，按照碱基互补配对原则，从引物的3’端按照5’→3’方向合成新链。以上述三步为一个循环，每个循环合成的DNA 都可作为下一个循环的模板，经过多个循环后，特定的DNA片段数量可以增加到2n倍。
本实验根据噬夏孢欧文氏菌（Erwinia uredovora）基因组中的crtE序列（crtE编码牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶，参与类胡萝卜素的合成），设计一对引物，从基因组中扩增该基因。
【器材与试剂】
1．实验仪器PCR仪，微量移液器，电泳仪，DNA电泳槽，紫外分析仪
2．实验试剂Taq DNA聚合酶，PCR缓冲溶液（10×），10 mmol/L dNTP 混合液，λDNA/EcoR I, Hind III，琼脂糖，DNA载样缓冲溶液(（10×），溴化乙锭染色液，TAE缓冲溶液（50×）
3．实验材料噬夏孢欧文氏菌基因组DNA，PCR专用薄壁管
引物1：5’-GAATTCCATATGACGGTCTGCGCAAAAAAAC-3’
引物2：5’-ATTCTCGAGTTAACTGACGGCAG-3’
【实验步骤】
1．在0.2 mL的PCR薄壁管中加入下列组分配成20 μL反应体系：2 μL PCR缓冲溶液（10×），1μL引物1（0.5 μmol/L），1μL引物2（0.5 μmol/L），1 μL dNTP 混合液，1 μL Taq DNA 聚合酶，1 μL噬夏孢欧文氏菌基因组DNA（约10 ng），13 μL 无菌双蒸水。
2．PCR参数设为：94℃预变性5 min，94℃变性45 s，52℃退火45 s，72℃延伸1 min，共进行35个循环，最后72℃保温10 min。
3．用1×TAE配制1%琼脂糖凝胶。
4．在PCR反应体系中加入2 μL载样缓冲溶液，混合后，上样电泳。
5．将凝胶用溴化乙锭染色30 min，于紫外分析仪内观察结果。
【注意事项】
1．本实验PCR反应体系应充分混合均匀。
2．应根据选购Taq DNA 聚合酶公司提供的使用说明，选择合适的PCR缓冲溶液，有的缓冲液中添加了Mg2+，有的则没有。
【实验作业】
影响PCR扩增产物特异性的因素有哪些？
参考文献
1. 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京：高等教育出版社，1993. 408～417 2．Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al. Short protocols in molecular Biology( 3rd ed.). John Wiley & Sons, Inc. 1995. 15-1
3. 汪靖超，孙东平，杜桂彩等. 噬夏孢欧文氏菌（Erwinia uredovora）类胡萝卜素合成相关基因crtE的克隆及其在大肠杆菌中的表达. 食品科学，2007，28（7）：276～279
实验五植物基因组DNA的制备与纯度分析
【实验目的】
熟悉植物基因组DNA的提取及其纯度的鉴定方法。
【实验原理】
植物材料经过液氮粉碎，提取液中阳离子型去垢剂十六烷基三甲基溴化铵(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide，简称为CTAB)能溶解细胞膜和核膜，解聚核蛋白，且与DNA 形成复合物，在高盐条件下，该复合物是可溶的。用氯仿等有机溶剂抽提，可使蛋白质变性，使多糖沉淀，经过离心， CTAB-DNA复合物仍保留在上清液中，降低盐浓度，则CTAB-DNA 复合物发生沉淀，沉淀用高盐TE缓冲溶液溶解后，加入异丙醇，CTAB仍在溶液中，但DNA 发生沉淀，沉淀溶于TE缓冲溶液中，即得植物基因组DNA。
DNA纯度分析常用的方法有琼脂糖凝胶电泳分析法和紫外分光光度法两种。纯净的DNA 溶液是透明的，用紫外分光光度计测定其在260 nm和280 nm处的吸光度，OD260/OD280值约为1.8，若二者比值大于1.8，表明样品中含有较多的RNA，若比值小于1.6，则说明样品中含有较多的蛋白质或酚类等杂质。
【器材与试剂】
1．实验仪器台式高速冷冻离心机，微量移液器，水浴锅，液氮罐，陶瓷研钵，紫外分光光度计，高压灭菌锅
2．实验试剂β-巯基乙醇，乙醇，异丙醇，CTAB提取液：2% CTAB，0.1 mol/L Tris-Cl,pH8.0，
20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，20 μg/mL RNase A ，室温保存；CTAB/NaCl溶液：4.1
g NaCl溶解于80 mL蒸馏水，缓缓加入10 g CTAB，边加热边搅拌至溶解，用蒸馏水定容至100 mL；CTAB沉淀溶液：1% CTAB，50 mmol/L Tris-Cl,pH8.0，10 mmol/L EDTA，pH8.0, 室温保存；氯仿/异戊醇（24：1，v/v）：按24:1的体积比配制，4℃保存；高盐TE缓冲液：10 mmol/L Tris-Cl,pH8.0，0.1 mmol/L EDTA，1 mol/L NaCl，高温灭菌后室温保存；TE 缓冲液：10 mmol/L Tris-Cl, 1 mmol/L EDTA，pH8.0，高温灭菌后室温保存。
3．实验材料新鲜的烟草叶片
【实验步骤】
1．向一定量的CTAB提取液中加入β-巯基乙醇至终浓度为2%（v/v），并在水浴锅中将溶液升温到65℃。
2．称取1 g烟草叶片，放在用液氮预冷的研钵内, 倒入液氮迅速研磨成粉末，转入无菌的
离心管。
3．加入 4 mL预热到65℃的CTAB提取液，混匀，65℃水浴中保温10～60 min，间或摇动。
4. 向上述离心管中加入4 mL氯仿/异戊醇，颠倒离心管数次，4 ℃，10 000 ×g离心10 min，取上清转移到另一个离心管中。
5. 向上清中加入1/10体积预热到65℃的CTAB/NaCl溶液，颠倒离心管数次。然后加入等体积的氯仿/异戊醇，颠倒离心管数次，室温条件下，10 000×g离心10 min，取上清转移到一个新离心管中。
6．向上清液中加入2倍体积的CTAB沉淀溶液，颠倒离心管数次，室温条件下，10 000×g 离心5 min，弃上清。
7．沉淀用0.5 mL高盐TE缓冲液溶解,然后转移到一无菌Eppendorf管中。若沉淀难于溶解，则可将离心管放在65℃水浴中处理30 min。
8．向盛有DNA溶液的Eppendorf管中加入0.6 mL的异丙醇，混匀，4 ℃，10 000×g离心15 min，弃上清。
9．沉淀用0.5 mL 80%乙醇润洗一次，室温干燥，加入0.1 mL TE缓冲液溶解沉淀，得DNA 溶液。
10．取5 μL DNA溶液加无菌水至4 mL，放入石英比色皿，用紫外分光光度计测定其在260 nm和280 nm处的吸光度，计算OD260/OD280，判断所提取DNA的纯度。
【注意事项】
1．实验时应尽量选用酚含量较低植物的幼嫩组织。
2．若加入CTAB沉淀溶液后无沉淀析出，表明盐浓度较高，应用CTAB沉淀溶液继续稀释。【实验作业】
1．影响所提取DNA质量的因素有哪些？
2．依据该方法提取的DNA在基础研究领域有何应用？
参考文献
1.王关林，方宏筠.植物基因工程原理与技术.北京：科学出版社，1998，370～375 2．Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al. Short protocols in molecular Biology( 3rd ed.). John Wiley & Sons, Inc. 1995. 2-10
实验六植物总RNA提取与琼脂糖凝胶电泳分析（也可以用第三版上的内容）
【实验目的】
熟悉植物总RNA提取及提取RNA质量的琼脂糖凝胶电泳分析方法。
【实验原理】
用含有异硫氰酸胍变性剂的提取液抽提植物组织粉末，一方面可以和β-巯基乙醇联合作用高效抑制RNase的活性，防止RNA的降解，另一方面又可使蛋白质变性并使其溶解，在酸性条件，提取液进一步经过酚/氯仿抽提去除蛋白质、DNA、多糖等杂质，RNA可被异丙醇沉淀。
【器材与试剂】
1．实验仪器高速冷冻离心机，陶瓷研钵，液氮罐，微量移液器，电泳仪，电泳槽，紫外分析仪，水浴锅，烘箱
2．实验试剂提取液：4 mol/L异硫氰酸胍，25 mmol/L柠檬酸钠（pH 7.0），0.5％十二烷基肌氨酸钠，0.1 mol/L β-巯基乙醇；醋酸钠溶液（2 mol/L ,pH 4.0），水饱和苯酚（pH 3.5），氯仿/异戊醇（24：1，v/v），乙醇，异丙醇，焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate，简称DEPC），琼脂糖，甲醛，10×电泳缓冲溶液：200 mmol/L吗啉代丙磺酸（pH7.0），20 mmol/L 醋酸钠，10 mmol/L EDTA（pH8.0），过滤除菌后避光保存；5×载样缓冲溶液：16 μL水饱和溴酚蓝，80 μL 0.5 mol/L EDTA（pH8.0），720 μL 37%甲醛，2 mL甘油，3.084 mL甲酰胺，4 mL 10×电泳缓冲溶液，加DEPC处理过的水至10 mL,4℃保存；0.5 μg/mL溴化乙锭染色液（1×电泳缓冲溶液配制）
3. 实验材料新鲜的烟草叶片
【实验步骤】
一、RNA的提取
1. 取两只10 mL离心管，各加入3 mL冰冷的提取液，置于冰上。
2. 取0.5 g新鲜的烟草叶片组织放在液氮预冷的研钵中，倒入液氮，迅速研磨成粉末。
3. 将粉末移入盛有提取液的离心管中，振荡，使植物材料和溶液充分混合，后将离心管置于冰上。
4. 向离心管中依次加入0.3 mL醋酸钠溶液、3 mL水饱和酚和1 mL氯仿/异戊醇，快速颠倒离心管数十次，冰上放置15 min。
5. 4℃，12 000×g离心30 min, 将上层水相转移到另一个离心管中，加入等体积的异丙醇，
混匀，-20℃静置30 min。
6. 4℃,12 000 ×g离心20min，弃上清，倒置离心管使溶液尽可能流干，沉淀重新溶于0.7 mL提取液，4℃,12 000 ×g离心10min，上清移入一1.5 mL Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，混匀后，-20℃静置30 min。
7. 4℃，12 000×g离心30min，弃上清，沉淀用70％乙醇润洗一次，用微量移液器吸走乙醇溶液，室温放置使残留乙醇挥发干净，加入50 μL DEPC处理的水溶解，得RNA溶液。二、变性琼脂糖凝胶电泳
1．称取1.5 g 琼脂糖，加入DEPC处理的水72 mL，加热溶化后，冷却到50～60℃，再依次加入10×电泳缓冲溶液10 mL和甲醛18 mL，混匀后制胶。
2．取16 μL RNA溶液放入一Eppendorf管中，加入4 μL 5×载样缓冲溶液，65℃保温5 min，迅速置于冰上，上样前短暂离心。
3．点样后，80V恒压电泳，溴酚蓝迁移超过凝胶的1/2处时停止电泳。
4．凝胶用溴化乙锭染色液染色30 min，紫外等下观察。
【注意事项】
1．为尽可能的避免RNA的降解，实验所用玻璃器皿洗净后必须于烘箱内于180℃烘烤8 h 以上，所用的溶液及塑料器皿必须用DEPC处理，操作环境尽量干净。
2. 为了减少RNase污染并避免DEPC、溴化乙锭、甲醛等对人体的毒害，实验过程中应戴手套操作，并经常更换。
【实验作业】
1．如何判断所提取的RNA是否完整？
2．电泳上样前，为什么要对RNA样品进行处理？
参考文献
1．王关林，方宏筠.植物基因工程原理与技术.北京：科学出版社，1998，608
2．刘进元等. 分子生物学实验指导. 北京：清华大学出版社，2002. 57~66
3．J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著. 分子克隆实验指南（第三版）.黄培堂等译. 北京：科学出版社，2002，540
实验七外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
【实验目的】
熟悉异丙基-β-D 硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，简称IPTG）诱导外源基因在大肠杆菌中表达的原理和方法。
【实验原理】
在E.coli BL21(DE3)染色体DNA中插入了T7 RNA聚合酶基因，该基因的上游为Lac 启动子，在正常条件下，大肠杆菌Lac操纵子中LacI编码的阻遏蛋白结合在该Lac启动子以及pET-15b 质粒T7启动子的附近LacO上，抑制T7 RNA聚合酶基因的表达，从而抑制了pET-15b 上T7启动子下游外源基因的表达。当培养基中存在IPTG时，IPTG与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白成为非活性形式，解除了阻遏蛋白对Lac启动子和T7启动子的抑制，T7 RNA聚合酶基因表达，它与T7启动子结合诱导其下游外源基因的转录，转录产生的mRNA经过翻译表达出目的蛋白。
本实验选用的工程菌为转化了pET-15bcrtE的E.coli BL21(DE3)。pET-15crtE是通过将噬夏孢欧文氏菌（Erwinia uredovora）编码牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶的crtE，在Nde I和Xho I位点克隆到pET-15b中而构建的，crtE的起始密码子（ATG）与pET-15b上的多聚组氨酸标签（His-tag）的编码序列融合。crtE基因全长906 bp，编码蛋白（包括His-tag）的分子量约为35 kDa。
【器材与试剂】
1．实验仪器细菌培养箱，摇床，台式离心机，微量移液器，电泳仪，电泳槽，电炉2．实验试剂蛋白胨，酵母提取物，NaCl，1 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，1 mol/L IPTG(微孔滤膜过滤除菌), 30%凝胶贮液：29%丙烯酰胺，1% N,N-亚甲双丙烯酰胺；10%十二烷基硫酸钠（SDS），N,N, N’,N’-四甲基乙烯二胺（TEMED），10%过硫酸铵，标准分子量蛋白，蛋白电泳缓冲溶液：25 mmol/L Tris, 250 mmol/L 甘氨酸，0.1% SDS,pH8.3；1.5 mol/L Tris-Cl(pH8.0)，1 mol/L Tris-Cl(pH6.8),蛋白栽样缓冲液（2×）：50 mmol/L Tris-Cl(pH6.8)，100 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT），2% SDS，10%甘油，0.1%溴酚蓝；染色液：0.2%考马斯亮蓝 R250，40%(v/v)甲醇，10%（v/v）乙酸；脱色液：40%(v/v)甲醇，10%（v/v）乙酸
3．实验材料 pET-15b，pET-15bcrtE，E.coli BL21(DE3)
【实验步骤】
1．将pET-15b，pET-15bcrtE分别转化E.coli BL21(DE3)，涂布在含100 μg/mL 氨苄青霉素
钠的LB培养基平板上，37℃，培养至菌落清楚。
2．分别挑取转化pET-15b（对照）和pET-15bcrtE的大肠杆菌单菌落，接种于20 mL含100 μg/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养基中，37℃，振荡培养（250 r/min）过夜。
3. 取2 mL过夜培养物分别接种到20 mL含100 μg/mL氨苄青霉素钠的LB液体培养基中,相同条件下继续培养3 h。
4．分别加入20 μL IPTG溶液，相同条件下，继续培养3 h。
5．分别取300 μL培养物于一Eppendorf管中，10 000 rpm离心1 min，取沉淀。
6．沉淀用20 μL蒸馏水悬浮，加入20 μL 蛋白载样缓冲液，混匀，100℃煮沸5 min。7．冷却后，剧烈震荡剪断DNA，10 000 rpm离心10 min。
8．分别取对照和工程菌样品20 μL用于SDS-PAGE分析，分离胶的浓度为12%。
9．凝胶用染色液染色1～2 h，用脱色液脱色至条带清晰。
10．比较只转化pET-15b的对照菌和工程菌蛋白条带的差异，找出外源基因编码的目的蛋白。【注意事项】
1．为了获得较高的目的蛋白表达水平，加入IPTG诱导时的工程菌培养物的OD600最好不要超过1。
2．为了获得比较好的电泳效果，在进行SDS-PAGE分析前应剧烈振荡样品，剪断DNA以降低样品黏度，并离心去除不溶性的细胞裂解物。
【实验作业】
1．影响外源基因在工程菌中表达量的因素有哪些？
2．如何提高工程菌中可溶性目的蛋白的水平？
参考文献
1. Primrose SB，Twyman RM，Old RW. Principles of gene manipulation (6th ed.). Blackwell Publishing，2001，74～75
2. 卢圣栋. 现代分子生物学实验技术. 北京：高等教育出版社，199
3. 381～384
3. 汪靖超，孙东平，杜桂彩等. 噬夏孢欧文氏菌（Erwinia uredovora）类胡萝卜素合成相关基因crtE的克隆及其在大肠杆菌中的表达. 食品科学，2007，28（7）：276～279
4. Misawa, N., Nakagawa, M., Kobayashi, K., et al. Elucidation of the Envinia uredovora carotenoid biosynthetic pathway by functional analysis of gene products expressed in Escherichia coli. J Bacreriol，1990,172: 6704～6712
* pET-15bcrtE可向青岛大学生物系索要，联系方式：lrg@https://www.doczj.com/doc/a35520349.html,
实验八亲和层析纯化重组蛋白
【实验目的】
学习利用镍离子螯合树脂亲和纯化带有多聚组氨酸标签（His-tag）的重组蛋白。
【实验原理】
利用镍离子螯合树脂特异结合多聚组氨酸的特性，若外源基因编码的目的蛋白在其N-末端或C-末端融合了His-tag，则具有His-tag的重组蛋白可特异结合在镍离子树脂上而将其纯化，经过低浓度咪唑溶液洗涤后，可用高浓度的咪唑溶液将重组蛋白从树脂上洗脱下来，纯化蛋白的纯度可用SDS-PAGE法进行检测。
【器材与试剂】
1．实验仪器摇床，高速冷冻离心机，超声波细胞破碎仪，微量移液器，电泳仪，蛋白电泳槽
2．实验试剂蛋白胨，酵母提取物，NaCl，1 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，1 mol/L IPTG(微孔滤膜过滤除菌), 0.1 mol/L NiCl2，镍离子螯合树脂（His.Bind Resin，美国Novagen公司），结合缓冲溶液：0.5 mol/L NaCl,5 mmol/L咪唑，20 mmol/L Tris-Cl，pH8.0；洗涤缓冲液：0.5 mol/L NaCl,60 mmol/L咪唑，20 m mol/L Tris-Cl，pH8.0；洗脱缓冲液：0.5 mol/L NaCl,0.5 mol/L咪唑，20 mmol/L Tris-Cl，pH8.0；30%凝胶贮液：29% 丙烯酰胺，1% N,N-亚甲双丙烯酰胺；10% 十二烷基硫酸钠（SDS），N,N, N’,N’-四甲基乙烯二胺（TEMED），10%过硫酸铵，标准分子量蛋白，蛋白电泳缓冲溶液：25 mmol/L Tris, 250 mmol/L 甘氨酸，0.1% SDS,pH8.3；1.5 mol/L Tris-Cl(pH8.0)，1 mol/L Tris-Cl(pH6.8)，蛋白栽样缓冲液（2×）：50 mmol/L Tris-Cl(pH6.8)，100 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT），2% SDS，10%甘油，0.1%溴酚蓝；染色液：0.2%考马斯亮蓝 R250,40%(v/v)甲醇，10%（v/v）乙酸；脱色液：40%(v/v)甲醇，10%（v/v）乙酸
3．实验材料转化了pET-15bcrtE的E.coli BL21(DE3)（工程菌）
【实验步骤】
1．取2 mL左右的树脂装入一小层析柱内，待凝胶沉淀且保护剂流净后，用10 mL蒸馏水冲洗凝胶，然后加入10 mL 0.1 mol/L NiCl2溶液，待其流干净后，用10 mL结合缓冲溶液平衡层析柱。
2．接种工程菌于20 mL含100 μg/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养基中，37℃，振荡培养（250 r/min）过夜。
3．将过夜培养物转接到500 mL含100 μg/mL 氨苄青霉素钠的LB液体培养基中，37℃，振
荡培养（250 r/min）3 h，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，继续培养4h。
4. 培养物在4℃，5 000×g离心10 min，收集菌体。
5．菌体重新悬浮于冰冷的20 mL结合缓冲溶液中，冰浴条件下用超声波破碎细胞15次（800W,工作时间10 s，间隔时间60 s）。
6．细胞裂解液于4℃，12 000×g离心30 min，取上清液，保留50 μL以备电泳分析。7．将其余上清液加到层析柱内，让其自然流过层析介质。
8．先用10 mL结合缓冲液冲洗层析柱，再用8 mL洗涤缓冲液洗涤层析柱。
9．用4 mL洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱液。
10．分别取10 μL细胞裂解液、洗脱液与10 μL蛋白载样缓冲液（2×）混合，煮沸5 min，SDS-PAGE分析，观察纯化效果。
【注意事项】
层析过程中所使用的溶液不应含有EDTA、二硫苏糖醇、β-巯基乙醇等能敖合金属离子的试剂，以免将树脂上的Ni2+洗掉，导致无法纯化出蛋白。
【实验作业】
1．除了超声波细胞破碎法以外，常用的细胞破碎还有哪些方法，比较这些方法的优缺点。2．如何有效降低蛋白质纯化过程中发生的降解？
参考文献
1．User protocol for His.Bind Kits，Novagen，USA.
2. 汪靖超，孙东平，杜桂彩等. 噬夏孢欧文氏菌（Erwinia uredovora）类胡萝卜素合成相关基因crtE的克隆及其在大肠杆菌中的表达. 食品科学，2007，28（7）：276～279
实验九重组蛋白的Dot-Western blot 分析
【实验目的】
熟悉利用Dot-Western blot进行微量重组蛋白鉴定分析的原理和方法。
【实验原理】
微量重组蛋白（纯化或未纯化的）固定在硝酸纤维素（NC）膜上以后，用脱脂奶粉封闭NC膜上其他结合位点，利用兔抗重组蛋白的抗体（一抗）可特异与重组蛋白结合的特点，当NC膜与一抗溶液温育时，抗体可特异结合在重组蛋白上，当NC膜再与辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG的抗体（二抗兔）溶液温育时，则该抗体可特异的与一抗结合，将NC膜浸泡在含辣根过氧化物酶底物的溶液中，HRP与二氨基联苯胺（DAB）及H2O2反应生成褐色产物，沉淀于NC膜上重组蛋白所在部位，故可以检测目的蛋白的存在。
【器材与试剂】
1．实验仪器微量移液器，脱色摇床
2．实验试剂封闭液：5%脱脂奶粉，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-Cl，pH7.5；漂洗液：150 mmol/L，NaCl 20 mmol/L Tris-Cl，pH7.5；显色液：20 mmol/LTris-Cl,pH8.0，0.1% NiCl2 ，0.01% H2O2 ，0.01% 3,3’二氨基联苯胺（DAB）
3．实验材料 1 mg/mL重组牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶，1 mg/mL牛血清白蛋白，兔抗牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶抗血清，羊抗兔IgG的抗体
【实验步骤】
1．分别取重组牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶和牛血清白蛋白（阴性对照）溶液各2 μL点在NC膜上的两处，用铅笔标记。
2．将NC膜放在一个干净培养皿中，加入20 mL封闭液于脱色摇床上温育1 h。
3．加入10 μL兔抗牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶抗血清（按照抗体效价调整一抗加入量），混匀，继续摇动2 h。
4．弃封闭液，NC膜分别用10 mL漂洗液洗膜3次，每次10 min。
5．弃漂洗液，重新加入20 mL封闭液和10 μL HRP标记的羊抗兔IgG，混匀，于脱色摇床上温育1 h。
6．弃封闭液，NC膜分别用10 mL漂洗液洗膜3次，每次10 min。
7．将NC膜转移到一个干净培养皿，加入20 mL显色液显色,待斑点清晰后，弃显色液。8．将NC膜浸于蒸馏水中终止反应。
【注意事项】
如果待检测的目的蛋白是牛奶中的某一组分，则不能使用脱脂奶粉作为封闭剂。
【实验作业】
如何提高Dot-Western blot分析的特异性和灵敏度？
参考文献
1．Makkouk KM，Hsu HT，Kumari SG. Detection of three plant viruses by dot-blot and tissue-blot immunoassays using chemiluminescent and chromogenic substrates. Journal of Phytopathology, 2008,139:97～102
２．Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, et al. Short protocols in molecular Biology( 3rd ed.). John Wiley & Sons, Inc. 1995. 10-47
实验十叶绿体DNA的制备
【实验目的】
熟悉植物叶绿体DNA的制备方法。
【实验原理】
叶绿体是绿色植物特有的进行光合作用的细胞器，内有环状双链的叶绿体DNA，在植物的能量代谢和物质代谢过程中发挥着重要的作用，如叶绿素与类胡萝卜素的合成等。绿色植物的叶片经过匀浆、过滤、离心获得叶绿体，叶绿体被SDS和蛋白酶K裂解释放DNA，裂解液经氯仿/异戊醇抽提去除蛋白等杂质，溶液中的DNA可被乙醇沉淀。
【器材与试剂】
1．实验仪器研钵，冷冻离心机，电泳仪，水平电泳槽，移液器
2. 实验试剂提取液：50 mmol/L Tris-Cl,pH8.0, 0.4 mol/L蔗糖，10 mmol/L NaCl,5 mmol/L EDTA,2 mmol/L β-巯基乙醇；悬浮液：50 mmol/L Tris-Cl,pH8.0，150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA；裂解液：4% SDS, 1 mg/mL蛋白酶K(用悬浮液配制)；氯仿/异戊醇（24：1，v/v），异丙醇，70%乙醇，琼脂糖，TE缓冲溶液：10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0),1 mmol/L EDTA；DNA 载样缓冲溶液(（10×），溴化乙锭染色液，TAE缓冲溶液（50×），λDNA/EcoR I, Hind III 3．实验材料新鲜菠菜叶片
【实验步骤】
1. 叶绿体的提取称取新鲜菠菜叶片10 g 放入研钵中，加10 mL 冰冷的提取液和少许石英沙，冰浴研磨成匀浆，再加入10 mL提取液，用4层纱布将匀浆过滤于一离心管中，4℃，700×g离心5 min，将上清液转移到另一离心管中，4℃，2 000×g离心10 min，弃上清，沉淀即为叶绿体。
2. 叶绿体DNA的提取沉淀用5 mL悬浮液重新悬浮，加入等体积的裂解液，混匀，37℃保温2 h，加入10 mL氯仿/异戊醇,颠倒离心管数次，4℃，12 000×g离心10 min，取上清，加入1/10体积的醋酸钠溶液和等体积的异丙醇，混匀，-20℃放置 2 h，4℃，12 000×g 离心10 min，取沉淀，用70%乙醇润洗后，室温干燥。
3．叶绿体DNA的电泳分析加入100 μL TE 缓冲溶液溶解沉淀，取9 μL DNA溶液和1μL DNA载样缓冲溶液混合，连同λDNA/EcoR I, Hind III一起进行琼脂糖凝胶电泳分析，观察实验结果。
【注意事项】
叶绿体提取时应控制好离心的转速和离心时间，否则可能影响到所提叶绿体的纯度，从
而影响最终所提叶绿体DNA的纯度。
【实验作业】
1．叶绿体DNA有哪些特点？它与细菌的染色体DNA有哪些相似之处？
2．叶绿体DNA在基础研究方面有哪些用途？
参考文献
1．张志良，瞿伟青. 植物生理学实验指导（第三版）. 北京：高等教育出版社，2003.87 2. 史公军，侯喜林，王彦华. 白菜叶绿体DNA的快速提取及分析.应用与环境生物学报，2005，11（3）：283～285
3．梁明山，陈斌，吴书惠. 油菜叶绿体DNA的提取和纯化.中国油料，1995，17（2）：57～58
现代分子生物学 复习提纲 第一章绪论 第一节分子生物学的基本含义及主要研究内容 1 分子生物学Molecular Biology的基本含义 ?广义的分子生物学：以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究 对象，从分子水平阐明生命现象和生物学规律。 ?狭义的分子生物学：偏重于核酸（基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调控 等过程，也涉及与这些过程相关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。 1.1 分子生物学的三大原则 1) 构成生物大分子的单体是相同的 2) 生物遗传信息表达的中心法则相同 3) 生物大分子单体的排列（核苷酸、氨基酸）的不同 1.3 分子生物学的研究内容 ●DNA重组技术（基因工程） ●基因的表达调控 ●生物大分子的结构和功能研究(结构分子生物学） ●基因组、功能基因组与生物信息学研究 第二节分子生物学发展简史 1 准备和酝酿阶段 ?时间：19世纪后期到20世纪50年代初。 ?确定了生物遗传的物质基础是DNA。 DNA是遗传物质的证明实验一：肺炎双球菌转化实验 DNA是遗传物质的证明实验二：噬菌体感染大肠杆菌实验 RNA也是重要的遗传物质-----烟草花叶病毒的感染和繁殖过程 2 建立和发展阶段 ?1953年Watson和Crick的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑。 ?主要进展包括： ?遗传信息传递中心法则的建立 3 发展阶段 ?基因工程技术作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命的新时期开始。 ? 第三节分子生物学与其他学科的关系 思考 ?证明DNA是遗传物质的实验有哪些？ ?分子生物学的主要研究内容。 ?列举5～10位获诺贝尔奖的科学家，简要说明其贡献。
分子生物学实验 MolecularBiology Experiments 【课程编号】021*******【课程类别】学科基础课 【学分数】3学分【适用专业】生物科学、生物技术 【学时数】 96学时【编写日期】 2009年6月 一、教学目标 本课程是在分子生物学及基因工程等理论课的基础上，开设的一门综合性兼设计性实验课程。该的教学内容主要突出实验技术的基础性和实用性，把目前最基本的分子生物学实验技术融入具体的系列实验中形成综合与设计性大实验。一方面让每个同学通过实际操作来达到更好地训练学生们的实验技术技能的目的；另一方面让学生全面地掌握基因工程的实验技术与方法、实验的设计原理、结果分析方法和分子生物学的基本原理，进一步培养学生的独立分析问题、解决问题的能力并学会如何利用实验手段实现科学研究的基本思维和目的，提高学生从事科学研究的综合素质。 二、教学内容和学时分配 实验一、实验总论5 学时基础性 主要内容：分子生物学基本实验技术简介和实验准备（清理仪器、试剂配置、培养基的配置与灭菌） 教学要求： 了解分子生物学实验课的目的与要求、设计思路、评分标准及仪器操作规范； 掌握试剂与培养基的配置、灭菌方法与操作技能。 重点、难点：学习试剂的配置、仪器操作规范。 实验二、碱性磷酸酶基因的克隆与筛选42学时综合性 主要内容：质粒DNA的提取与定性分析；PCR基因扩增及扩增产物的回收；DNA重组（酶切、连接、转化与筛选） 教学要求： 了解原核基因克隆与筛选的全过程与实验设计策略、载体的基本结构、基因工程酶（限制性内切酶、连接酶、Taq酶）的各种特性、DNA重组以及重组子筛选与鉴定的相关技术； 理解基因克隆与筛选的策略及其相关实验原理、碱裂解法质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想， PCR引物设计以及PCR体系设计的原则与注意事项、DNA重组时设计酶切与连接方案的一般规律、重组DNA导入受体细胞方法以及目的重组子的筛选与鉴定方法、影响DNA重组效率的因素；
分子生物学实验指导 生物技术教学室编 宁夏大学生命科学学院 2008年8月
实验一分子生物学实验技术多媒体演示 [目的要求] 通过多媒体试验录像进一步掌握分子生物学基本操作技术。 [教学方式] 多媒体光盘演示。 [实验内容] 基本的分子生物学实验操作技术包括核酸凝胶电泳技术；质粒提取；转化；重组体的筛选；PCR技术等。
实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA [目的要求] 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术 [实验原理] 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50 kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭（Ethidum bromide ,EB），在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。 琼脂糖凝胶有如下特点： (1) DNA的分子大小在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。 (2) 琼脂糖浓度一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。 (3) 电压低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 (4) 电泳温度DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。 (5) 嵌入染料荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。 (6) 离子强度电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。
一.常用贮液与溶液 1mol/L亚精胺（Spermidine）: 溶解 2.55g亚精胺于足量的水中，使终体积为10ml。 分装成小份贮存于-20℃。 1mol/L精胺（Spermine）： 溶解 3.48g精胺于足量的水中，使终体积为10ml。分装成小份贮存于-20℃。 10mol/L乙酸胺（ammonium acetate）：将77.1g乙酸胺溶解于水中，加水定容至1L后，用 0.22um孔径的滤膜过滤除菌。 10mg/ml牛血清蛋白(BSA）： 加100mg的牛血清蛋白（组分V或分子生物学试剂级，无DNA酶）于 9.5ml水中（为减少变性，须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白），盖好盖后，轻轻摇动，直至牛血清蛋白完全溶解为止。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。 1mol/L二硫苏糖醇（DTT）： 在二硫苏糖醇5g的原装瓶中加 32.4ml水，分成小份贮存于-20℃。或转移100mg的二硫苏糖醇至微量离心管，加 0.65ml的水配制成1mol/L二硫苏糖醇溶液。 8mol/L乙酸钾（potassiumacetate）：
溶解 78.5g乙酸钾于足量的水中，加水定容到100ml。 1mol/L氯化钾（KCl）： 溶解 7.46g氯化钾于足量的水中，加水定容到100ml。 3mol/L乙酸钠（sodiumacetate）： 溶解 40.8g的三水乙酸钠于约90ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至 5.2，再加水定容到100ml。 0.5mol/L EDTA: 配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液（ 0.5mol/L），混合后形成EDTA的三钠盐。或称取 186.1g的Na2EDTA·2H2O和20g的NaOH，并溶于水中，定容至1L。 1mol/LHEPES：将23.8gHEPES溶于约90ml的水中，用NaOH调pH（ 6.8- 8.2），然后用水定容至100ml。 1mol/L HCl：加8.6ml的浓盐酸至 91.4ml的水中。 25mg/mlIPGT： 溶解250mg的IPGT（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）于10ml水中，分成小份贮存于-20℃。
分子生物学技术信息 关于筹建一个分子生物学实验室所需的仪器 一、上游分子克隆 分子克隆技术是分子生物学的核心技术，这项技术的主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，从而可以深入分析基因结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体的遗传性状的目的。 1. 分子克隆的基本技术路线： 1) 分离制备目的基因或DNA片段； 2) 目的DNA与载体在体外进行连接； 3) 重组DNA分子转入宿主细胞； 4) 筛选及鉴定阳性重组体； 5) 重组体的扩增。 2. 分子克隆常用仪器：
二、核酸分子杂交 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的技术之一。其基本原理是具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下可按碱基互补原则形成双链。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使其在分子生物学领域中被广泛应用于分子克隆的筛选，基因组中特定基因序列的定量定性检测，基因表达和基因突变分析及疾病的基因诊断等。根据核酸种类分为Southern印迹法和Northern印迹法。 核酸分子杂交中常用的仪器： 三、下游蛋白的表达及分离纯化 目的基因能否发挥其效应,只能通过其表达有功能的蛋白质来实现,因此蛋白质的表达及分析方法成为分子生物学中必不可少的组成部分。 1. 蛋白的表达 大肠杆菌是自然界中最为人知的生物体之一。由于其具有操作简易，产量高和成本低廉等优点，使其成为蛋白质表达的首选宿主。缺点是：表达缺乏翻译后加工，得到的蛋白可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。 酵母作为单细胞低等真核生物，具有易培养，繁殖快，便于基因操作等优点，渐渐被开发作为目的基因的表达系统。其中甲基酵母作为外源基因的表达
实验一.质粒提取与琼脂糖电泳 一、目的 掌握质粒的提取方法及原理；琼脂糖凝胶电泳及观察评判方法。 二、原理 1.质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具 有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。在pH 12.0- 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的 质粒DNA 虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH 调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。硅基质树脂在高盐状态下，特异性吸附DNA，而在低盐状态下，DNA被洗脱下来。 2.带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛， 它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。琼脂糖凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为分离和鉴定核酸的常用方法。在pH值为8.0~8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 三、实验材料、仪器、试剂 （1）菌种：大肠杆菌DH5α （2）分子生物学试剂 10mg/ml溴化乙锭（EB）:按10mg/ml浓度将EB溶于去离子水中，剧烈搅拌，完全溶解后，室温下避光保存。 50×TAE电泳缓冲液: 24.2g Tris 5.71g 冰乙酸 10ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 加去离子水至100ml，室温保存备用，工作液为1×TAE。
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导 （补充讲义） 南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心 二OO九年十二月 目录 实验总RNA的提取、定量与RT-PCR……………………………………………… 1 实验质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定 (7) 实验蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳 (13) 附录Ⅰ相关试剂盒说明书 (19) 附录Ⅱ相关仪器使用说明书 (19) 实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR 一、总RNA的提取与定量 目的： 从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。 原理：
在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5μg RNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子（除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外），在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用 oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。 RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。 Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8－羟基喹啉、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。 Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织、5×106细胞）也适用于大量样品（≥1g组织、>107细胞）。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northern blot，dot blot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-
实验指导 目录 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用方法实验二质粒DNA的提取－碱裂解法 实验三琼脂糖凝胶电泳 实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定 实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验六动物组织细胞基因组 DNA提取 实验七 DNA的定量 实验八 PCR基因扩增 实验九琼脂糖凝胶电泳分离与纯化目的DNA 实验十 DNA重组 实验十一动物组织细胞总RNA的提取 实验一分子生物学实验室常用仪器及使用
事实证明，在科学飞速发展的今天，无论从事哪个领域的研究，要想突破，除了有良好的理论基础外，更重要的是依赖于先进的技术和优良的仪器设备以及良好的研究环境。一个标准的分子生物学实验室除了具有一般生物学实验室的常规仪器设备外，还具有一些特殊用途的仪器，这些仪器一般较精密，价格昂贵。下面介绍这些仪器的使用方法和注意事项。 一、冷冻离心机 低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术，因此低温冷冻离心机成为分子生物学研究中必备的重要仪器。在国内，有多个厂家生产冷冻离心机，本实验室的高速冷冻离心机为GL-20G-Ⅱ型（上海安亭），落地式。配有角式转头：6×50ml、12×10ml和12×1.5ml。极限转速20000rpm。 1. 安装与调试 离心机应放置在水平坚固的地面上，应至少距离10cm以上且具有良好的通风环境中，周围空气应呈中性，且无导电性灰尘、易燃气体和腐蚀性气体，环境温度应在0～30℃之间，相对湿度小于80%。试转前应先打开盖门，用手盘动转轴，轻巧灵活，无异常现象方可上所用的转头。转子准确到位后打开电源开关，然后用手按住门开关，再按运转键，转动后立即停止，并观察转轴的转向，若逆时针旋转即为正确，机器可投入使用。 2. 操作程序 （1）插上电源，待机指示灯亮；打开电源开关，调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定，温控系统的数码管显示此时离心腔的温度。 （2）设定机器的工作参数，如工作温度，运转时间，工作转速等。 （3）将预先平衡好的样品放置于转头样品架上，关闭机盖。 （4）按控制面板的运转键，离心机开始运转。在预先设定的加速时间内，其运速升至预先设定的值。 （5）在预先设定的运转时间内（不包括减速时间），离心机开始减速，其转速在预先设定的减速时间内降至零。 （6）按控制面板上的停止键，数码管显示dedT，数秒钟后即显示闪烁的转速值，这时机器已准备好下一次工作。 3. 注意事项 （1）离心机应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线，机器不使用，要拔掉电源插头。
《分子生物学》实验指导 实验1 总DNA提取 生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。 [实验目的] 学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。 [实验原理] 植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。 由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。 [实验器材] 1、高压灭菌锅 2、冰箱 3、恒温水浴锅 4、高速冷冻离心机 5、紫外分光光度计 6、剪刀 7、陶瓷研钵和杵子 8、磨口锥形瓶（50ml） 9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料 [实验试剂] 1、3×CTAB buffer（pH8.0） 100mM Tris 25mM EDTA 1.5M NaCl 3% CTAB 2% β-巯基乙醇 2、TE缓冲液（pH8.0） 10mmol/L Tris·HCl 1mmol/L EDTA 3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V） 4、95％乙醇 5、液氮 [实验步骤] 1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。 2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。 3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，
第一章绪论 2.写出DNA和RNA的英文全称。 答：脱氧核糖核酸（DNA, Deoxyribonucleic acid），核糖核酸（RNA, Ribonucleic acid）4.早期主要有哪些实验证实DNA是遗传物质？写出这些实验的主要步骤。 答：一，肺炎双球菌感染实验，1，R型菌落粗糙，菌体无多糖荚膜，无毒，注入小鼠体内后，小鼠不死亡。2，S型菌落光滑，菌体有多糖荚膜，有毒，注入到小鼠体内可以使小鼠患病死亡。3，用加热的方法杀死S型细菌后注入到小鼠体内，小鼠不死亡； 二，噬菌体侵染细菌的实验：1，噬菌体侵染细菌的实验过程：吸附→侵入→复制→组装→释放。2，DNA中P的含量多，蛋白质中P的含量少；蛋白质中有S而DNA中没有S，所以用放射性同位素35S标记一部分噬菌体的蛋白质，用放射性同位素32P标记另一部分噬菌体的DNA。用35P标记蛋白质的噬菌体侵染后，细菌体内无放射性，即表明噬菌体的蛋白质没有进入细菌内部；而用32P标记DNA的噬菌体侵染细菌后，细菌体内有放射性，即表明噬菌体的DNA进入了细菌体内。 三，烟草TMV的重建实验：1957年，Fraenkel-Conrat等人，将两个不同的TMV株系（S株系和HR株系）的蛋白质和RNA分别提取出来，然后相互对换，将S株系的蛋白质和HR株系的RNA，或反过来将HR株系的蛋白质和S株系的RNA放在一起，重建形成两种杂种病毒，去感染烟草叶片。 6.说出分子生物学的主要研究内容。 答：1，DNA重组技术；2，基因表达调控研究；3，生物大分子的结构功能研究----结构分子生物学；4，基因组、功能基因组与生物信息学研究。 第二章染色体与DNA 3.简述真核生物染色体的组成及组装过程 真核生物染色体除了性细胞外全是二倍体，DNA以及大量蛋白质及核膜构成的核小体是染色体结构的最基本单位。核小体的核心是由4种组蛋白（H2A、H2B、H3和H4）构成的扁球状8聚体。 蛋白质包括组蛋白与非组蛋白。组蛋白是染色体的结构蛋白，它与DNA组成核小体，含有大量赖氨酸核精氨酸。非组蛋白包括酶类与细胞分裂有关的蛋白等，他们也有可能是染色体的结构成分 由DNA和组蛋白组成的染色体纤维细丝是许多核小体连成的念珠状结构。 1.由DNA与组蛋白包装成核小体，在组蛋白H1的介导下核小体彼此连接形成直径约10nm的核小体串珠结构，这是染色质包装的一级结构。 2.在有组蛋白H1存在的情况下，由直径10nm的核小体串珠结构螺旋盘绕，每圈6个核小体，形成外径为30nm，内径10nm，螺距11nm的螺线管，这是染色质包装的二级结构。 3.由螺线管进一步螺旋化形成直径为0.4μm的圆筒状结构，称为超螺线管，这是染色
常用抗生素： 备注：(摘自《分子克隆》第三版附录 2 ) ①以水为溶剂的抗生素贮存液应使用0.22 ym滤器过滤除菌； ②用乙醇溶解的抗生素溶液无须过滤除菌； ③所有抗生素贮液都应放于不透光的容器中保存。 氨苄青霉素( ampicillin )(100mg/ml ) 溶解1g 氨苄青霉素钠盐于足量的水(最好是高压后的灭菌水)中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以25ug/ml? 50ug/ml 的终浓度添加于生长培养基。 羧苄青霉素( carbenicil l in )( 5 0 m g/m l ) 溶解0.5g 羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以25ug/ml?50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 甲氧西林( methicillin )(100mg/ml ) 溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。 卡那霉素( kanamycin)( 10mg/ml) 溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以10ug/ml?50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。氯霉素( chloramphenicol)(25mg/ml) 溶解250mg 氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml 。分装
成小份于-20C贮存。常以12.5ug/ml?25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 链霉素( streptomycin)(50mg/ml) 溶解0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20C贮存。常以10ug/ml?50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 萘啶酮酸( nalidixic acid )( 5mg/ml ) 溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装 成小份于-20C贮存。常以15ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 四环素( tetracyyline)(10mg/ml ) 溶解100mg 四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至10ml。分装成小份用铝箔包裹装液管以 免溶液见光，于-20C贮存。常以10ug/mI?50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
生命科学系 2011-2012学年度分子生物学实验 （0801班）
2011-2012学年度分子生物学实验指导 实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 (3) 实验二质粒DNA的转化 (4) 实验三质粒DNA的提取 (5) 实验四琼脂糖凝胶电泳检测DNA (7) 实验五PCR基因扩增 (9) 实验六DNA重组 (10) 实验七蓝白斑筛选实验 (11) 实验八DNA酶切技术 (13)
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备 一、实验目的：掌握大肠杆菌感受态细胞的制备技术 二、实验原理：感受态——细菌处在容易吸收外源DNA的状态。 我们选用经过基因改造的生物工程菌株——大肠杆菌top10菌株为材料，在0℃、CaCl2低渗溶液处理，细胞壁破坏，细胞成为球型原生质体。因而具备了吸收外源DNA的能力。 三、仪器：1.超净工作台 2.低温离心机 3.恒温摇床 4.紫外分光光度仪 四、材料与试剂： 1.大肠杆菌top10菌株 2. 0.1mol/L CaCl2溶液500mL、 0.2mol/L CaCl2溶液50mL 3..LB液体及固体培养基 4.50%甘油500mL（灭菌） 五、实验操作步骤： 1.从大肠杆菌top10菌株平板上挑取一个单菌落，接种于3mL LB液体培养基中， 37℃振荡（200r/min）培养过夜。 2.次日早上取0.4mL菌液转接到40mL LB液体培养基中，37℃震荡培养2～3h.(A600 应在0.4～0.5之间) 3.将菌液置冰浴中10min。（同时将0.1mol/L CaCl2溶液、50%甘油预冷） 4.取菌液1.5mL，4℃离心2min（3500r/min）.弃上清，再加菌液1.5mL，4℃再离 心一次，弃上清，倒置以便使培养液流尽。 5.用冰冷的0.1mol/L CaCl2溶液1mL悬浮细胞（轻轻涡旋使悬浮），立即置冰浴保 温30min。 6.4℃离心2min（3500r/min），弃上清，加入100μL冰冷的0.2mol/L CaCl2溶液、 100μL50%甘油轻轻手摇悬浮，置冰浴上，接着进行质粒DNA转化，或-70℃保存。
分子生物学实验室有毒常用药品 1.溴化乙锭（：具有强诱变致癌性，使用时一定要戴一次性手套，注意操作规范，不要随便触摸别的物品。 2（焦碳酸二乙酯：闻起来香香甜甜的，可是害人不眨眼！一种强有力的蛋白质变性剂，而且怀疑是致癌剂.开瓶时将瓶子远离你，内压可导致溅泼.操作时戴合适的手套，穿工作服，并在化学通风橱里进行. 3（苯甲基磺酰氟：老板说是神经毒!!!是一种高强度毒性的胆碱酯酶抑制剂.它对呼吸道黏膜，眼睛和皮肤有非常大的破坏性.可因吸入，咽下或皮肤吸收而致命.戴合适的手套和安全眼镜，始终在化学通风橱里使用.在接触到的情况下，要立即用大量的水冲洗眼镜或皮肤，已污染的工作服丢弃掉. 4. 乙腈，易挥发易燃，是一种刺激物和化学窒息剂，通风橱中远离热、火。 5. 放线菌素D ,是一种致畸剂和致癌剂，通风橱中操作。 6鹅膏蕈毒环肽，具有强毒性,可能致命。 7亚甲双丙烯酰胺,有毒，影响中枢神经系统，切勿吸入粉末。 8. 甲醇,有毒,能引起失明。 9. 乙酸（浓的：可能因为吸入或皮肤吸收而受到伤害，要戴手套和护目镜，最好在化学通风橱中操作。 10. 过硫酸酸铵:对粘膜和上呼吸道、眼睛和皮肤又较大危害性，吸入可致命。操作时戴手套、护目镜。始终在通风橱中操作。
11. 氯化铯:可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。操作时戴手套和护目镜。 12:很强的还原剂，散发难闻的气味。可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。当使用固体或高浓度储存液时，戴手套和护目镜,在通风橱中操作。13.甲醛:毒性较大且易挥发，也是一种致癌剂，易通过皮肤吸收，对眼睛、粘膜和上呼吸道有刺激和损伤作用。避免一如其挥发的气雾。戴手套和护目镜。始终在通风橱中操作。远离热、火花及 明火。 14 ,对眼睛有刺激性，腐蚀皮肤。有一次不小心溅出一小滴在脸上，马上就红了，过一会儿感觉到疼，一周之后才好。如果溅上，马上用大量的水冲洗。 大家在实验室里，接触到的化学试剂多半都有危害性，紫外灯，如果离心机不是很好的话的噪声污染，会导致手指需要震动，等等,所以每个人都应该注意保护自己，而不能因为图省事或者别的什么原因而放松对安全的注意。 另外就是注意规范操作，搞微生物的尤其要注意，不要实验室感染。 15. 叠氮钠,有毒,阻断细胞色素电子运送系统 16. 氟化钠,有毒可致命,通风橱中操作 17. 放射性物质（同位素标记时，要戴手套,护目镜,穿工作服,最好买试剂盒（如果有商品化的 18巯基乙醇，可致命,对呼吸道、皮肤和眼睛有伤害 19. 氨甲蝶呤,致癌和致畸
第一章、基因的结构和功能实体及基因组 1、基因定义 基因（遗传因子）是遗传的物质基础，是DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，携带有遗传信息的DNA序列，是具有遗传效应的DNA分子片段，是控制性状的基本遗传单位，通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息，从而控制生物个体的性状表现。 2、DNA修复 DNA修复（DNA repairing）是细胞对DNA受损伤后的一种反应，这种反应可能使DNA结构恢复原样，重新能执行它原来的功能；但有时并非能完全消除DNA的损伤，只是使细胞能够耐受这DNA的损伤而能继续生存。也许这未能完全修复而存留下来的损伤会在适合的条件下显示出来（如细胞的癌变等），但如果细胞不具备这修复功能，就无法对付经常在发生的DNA损伤事件，就不能生存。对不同的DNA损伤，细胞可以有不同的修复反应。3、DNA损伤 DNA损伤是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变，并导致遗传特征改变的现象。情况分为：substitutation （替换）deletion （删除）insertion （插入）exon skipping （外显子跳跃）。 DNA损伤的改变类型：a、点突变：指DNA上单一碱基的变异。嘌呤替代嘌呤（A与G之间的相互替代）、嘧啶替代嘧啶（C与T之间的替代）称为转换（transition）；嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤则称为颠换（transvertion）。b、缺失：指DNA链上一个或一段核苷酸的消失。c、插入：指一个或一段核苷酸插入到DNA链中。在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不是3的整倍数，则发生读框移动（reading frame shift），使其后所译读的氨基酸序列全部混乱，称为移码突变（frame-shift mutaion）。d、倒位或转位：（transposition）指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置、或从一处迁移到另一处。 e、双链断裂：对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件。 4、同源重组 同源重组，（Homologus Recombination)是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。同源重组需要一系列的蛋白质催化，如原核生物细胞内的RecA、RecBCD、RecF、RecO、RecR等；以及真核生物细胞内的Rad51、Mre11-Rad50等等。同源重组反应通常根据交叉分子或holiday 结构（Holiday Juncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前联会体阶段、联会体形成和Holiday 结构的拆分。 a、基因敲除 基因敲除（geneknockout），是指对一个结构已知但功能未知的基因，从分子水平上设计实验，将该基因去除，或用其它顺序相近基因取代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因的功能。这与早期生理学研究中常用的切除部分-观察整体-推测功能的三部曲思想相似。基因敲除除可中止某一基因的表达外，还包括引入新基因及引入定点突变。既可以是用突变基因或其它基因敲除相应的正常基因，也可以用正常基因敲除相应的突变基因。 b、因转移法 同源重组(homologousrecombination)是将外源基因定位导人受体细胞染色体上的方法，因为在该座位有与导人基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换有缺陷的基因片段，达到修正缺陷基因的目的。位点特异性重组是发生在两条DNA链特异位点上的重组，重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点；attachmentsite，att)和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶仅能催化特异性位点间的重组，因而重组具有特异性和高度保守性。
分子生物学实验文档
分子生物学基础实验 分子生物学实验技术已成为生物化学及分子生物学以及相关学科院系教学科研不可缺少的一部分。为提高学生在分子生物学技术方面的动手能力，生物技术综合实验室主要开设常用而基本的分子生物学实验技术。它的内容包括质粒DNA的制备；DNA的重组；PCR基因扩增等等。 实验一质粒DNA的小量制备 一、实验原理 要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。 质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。 质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增
关于分子生物学实验的体会 梁慧媛（生技01 级） 不知不觉间，一年的时间就这样流逝了，与分子生物实验相伴，对我而言，的确不同寻常。并不仅仅是学习生物学实验技术和方法的宝贵经历，它意味着更多。 首先是实验条件、实验过程、实验设计的完备性，从这里可以初步感受到生物学研究的科学性与严肃性，自己可以得到宝贵的机会，亲身体会生物学研究的苦辣酸甜。一直一直喜欢，得到正确实验结果时刻的畅快感，那是无法言明的欣慰感，一次身心彻底地放松，可以将所有一整天来积累的疲劳抛之身后，即使仅仅是小小的成功，也会让我们兴奋不已。在整理资料，将一年来保存的记录一遍一遍的翻看，重温其中的特别滋味，我，轻轻地笑了。我，喜欢这里，喜欢生物学。 失误是常有的，经历过吃惊、后悔、无奈，检讨分析，最后重新开始。一波三折的记忆清晰的印在脑海中，这种深深的挫折感，再试一次的勇气，我会一生记取的。一年间，随着对生物学实验知识和技能的进一步学习，我更坚定了自己学习生物学的志向，感谢分子生物学实验的"试炼" 。 分子生物学实验心得体会 刘东强（生科01 级） 分子生物学实验室本科生第一次接触到了真正培养实验能力的实验课，它不同于我们在大二开的植物、动物、微生物等实验课。在这些课上，主要以制备样品并观察样品的形态、结构特征为主，这是由于我们当时正值大二，专业知识还远不够。 随着以后理论课学习的深入，我们开始了分子生物学实验的学习，这无疑对于深刻巩固我们理论课上学到的知识是有帮助的，也进一步加深了对原有知识的理解，如启动子的概念、类型、PCR的原理等。另外，在实验课中，我们掌握并学会如何运用分子生物学研究中的一些基本实验技术，如质粒的提取、总RNA 的制备、PCR 技术等。 我们的实验动手能力通过亲身接触实验过程并亲自设计一些实验得到了提高，使我们不再象刚开始做分子生物学实验的时候照搬实验指导上的实验步骤，而是通过我们自己的思考，根据现有的实验条件，对原有的步骤作必要的改进。 此外，通过这门实验课的学习，我们形成了严谨的态度，如有时得出的实验结果与理论不符，我们渐渐养成了仔细分析实验结果的习惯，查找在实验设计或操作过程中出现的问题，同时对理论知识认识得更清楚。 总之，我认为，分子生物学实验课，是称得上实用、精彩、有意思的好实验，对于今后我的研究或工作很有价值 刘佳凝（生技01 级） 一学期的分子生物学实验对我来说很重要，同时通过一学期的实践让我给分子生物学有了较深入地体会： 1、很感谢由我系生化组老师们编写的这本实验指导。里面的实验原理与操作步骤都清晰易懂，有助于我
北京化工大学分子生物学实验指导
实验一 少量质粒DNA的制备 一、实验目的 （1）了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。 （2）掌握质粒DNA分离、纯化的原理。 （3）学习碱裂解法分离质粒DNA的方法。 二、实验原理 质粒（plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传得因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主地进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。从细胞生存来看，没有质粒存在，基本上不妨碍细胞的存活，因此质粒是寄生性的复制子。根据质粒的这种特性，通常采用DNA体外重组技术和微生物转化等基因工程的技术和方法，使重组到质粒的某种基因（如干扰素基因）带进受体细胞（如具有一定特性的大肠杆菌细胞等）表达它的遗传性质，改变或修饰寄主细胞原有的代谢产物，或产生新的物质（如干扰素）。目前，质粒已广泛地用作基因工程中的DNA分子无性繁殖的运载体，同时它也是研究DNA结构与功能的较好模型。 在细菌细胞中，质粒DNA通常为染色体DNA的2%左右，但是细菌质粒DNA的含量与其复制类型有关。质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制（stringent control）复制型和松弛控制型（relaxed control）复制型。严密控制复制型的质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，质粒也不复制。每个细胞内只含1个或几个质粒分子（即有1个或几个拷贝）。松弛控制复制型的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，当染色体复制已经停止时，该质粒仍然能够继续复制。该质粒在一个细胞内有许多拷贝，一般在20个以上，例如col E1 质粒（含有产生大肠杆菌素E1 基因）及其衍生质粒，在每个细胞内约有20多个拷贝。 所有分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。目前应用于质体DNA的纯化或抽取的方法众多，例如碱溶裂法（alkaline lysis）、热裂解法（boiling method）、氯化铯（CsCl）纯化法，及市售柱层析套管法等。最常用的碱裂解法具效率高、价廉、简单易学等优点。其原理是利用碱处理质粒DNA及染色体DNA，使两者双股打开呈单股状态，再加酸中和，使单股回复为双股DNA，同时在急速中和反应中，染色体DNA因分子过于庞大以致于碱基匆忙配对，形成杂乱无序的巨大分子，对水的相对溶解度低而易被沉淀下来。相反，质粒DNA因分子小，两单股DNA恢复原碱基配对快而易溶于水中，所以只要经过离心，即可将染色体DNA与质体DNA分离。本实验所使用的pUC19含有β-lactamase基因，会产生peripasmic酶，进行蓝白斑筛选，抗氨苄青霉基因ampicillin (Amp)两种抗性筛选标记。 碱裂解法：本实验是以alkaline lysis的方法进行，其原理是将大肠杆菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白质及DNA变性，然后以酸中和。小分子质粒DNA在中和后可恢复原状，但大部
常用抗生素： 备注： （摘自《分子xx》第三版附录2） ①以水为溶剂的抗生素贮存液应使用 0.22μm滤器过滤除菌；②用乙醇溶解的抗生素溶液无须过滤除菌； ③所有抗生素贮液都应放于不透光的容器中保存。 氨苄青霉素（ampicillin）（100mg/ml） 溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水(最好是高压后的灭菌水)中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 羧苄青霉素（carbenicillin）（50mg/ml） 溶解 0.5g羧苄青霉素二钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。 分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 甲氧西林（methicillin）（100mg/ml） 溶解1g甲氧西林钠于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以 37.5ug/ml终浓度与100ug/ml氨苄青霉素一起添加于生长培养基。 卡那霉素（kanamycin）（10mg/ml） 溶解100mg卡那霉素于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。
氯霉素（chloramphenicol）（25mg/ml）溶解250mg氯霉素足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以 12.5ug/ml～25ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 链霉素（streptomycin）（50mg/ml） 溶解 0.5g链霉素硫酸盐于足量的无水乙醇中，最后定容至10ml。 分装成小份于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 萘啶酮酸（nalidixic acid）（5mg/ml） 溶解50mg萘啶酮酸钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以15ug/ml的终浓度添加于生长培养基。 四环素（tetracyyline）（10mg/ml） 溶解100mg四环素盐酸盐于足量的水中，或者将无碱的四环素溶于无水乙醇，定容至10ml。分装成小份用铝箔包裹装液管以免溶液见光，于-20℃贮存。常以10ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。