pET-41b(+) 编号 名称 北京华越洋VECT--‐540 pET--‐41b(+) pET41b载体基本信息 别名: pET41b, p ET 41b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5932 b p 5' 测序引物: T7或pGEX--‐5‘ 5' 测序引物序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3'; pGEX--‐5': 5'--‐GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG--‐3' 载体标签: N--‐GST, N--‐His, N--‐Thrombin 载体抗性: Kanamycin 备注: Encodes GST fusion tag; Nterm thrombin cleavage site; Nterm enterokinase c leavage s ite; P shAI b lunt c loning s ite; a,b,c v ary b y M CS 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pET41b载体质粒图谱和多克隆位点信息
Feature N ame Start End T7_terminator 120 1 T7_Terminal_primer 69 87 EK 278 264 S15 353 309 6xHIS 413 396 GST (variant) 1094 444 T7_transl_en_RBS 1119 1103 lacO 1164 1137 T7_promoter 1182 1164 tet (300 --‐ 563) 1218 1481 pBRrevBam_primer 1289 1270 lacI 1564 2655 ROP 3227 3418 pGEX_3_primer 3434 3412 pBR322_origin 4452 3833
之所以首先介绍Novagen公司的产品是因为用过它的pET系列载体，感觉很好用。Novagen的母公司是德国默克（Merck）公司，它是国际著名的化学及制药公司总部位于德国的Darmstadt，已有300多年的历史。已在全世界55个主要国家设立了分公司，其中在28个国家建有62个生产基地。 Novagen公司出品的pET系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。pET系列载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体，其表达原理见下图。 T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。T7噬菌体基因编码的T7 RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。它是一种高活性的RNA聚合酶，其合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。 T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA聚合酶，因此T7 RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。噬菌体DE3是λ噬菌体的衍生株，一段含
有lacⅠ，lacUV5启动子和T7 RNA聚合酶基因的DNA片段倍插入其int基因中，用噬菌体DE3的溶源菌，如BL21(DE3)、HMS174(DE3)等作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学信号诱导型，类似于Lac表达系统。 从开始涉及表达的时候可以根据是否要用基因本身的起始密码子进行选择，Novagen公司仅提供三个载体：pET-21(+)，pET-24(+)和pET-23(+)。如果你打算利用载体的起始密码子，那么就有许多选择。 根据是否要可溶性表达，选择加有不同标记的载体。一般说来在大肠杆菌中不加标记外源蛋白都会以不溶的包涵体形式表达。为了让外源蛋白融合表达一般说来有三个策略： 1.与一个高度可溶的多肽联合一起表达，比如：谷胱甘肽S转移酶（glutathione S transferase, GST）、硫氧还蛋白（thioredoxin, Trx）和N利用质A（N utilization substance A, NusA）。 2.转入一个酶催化二硫键的形成，如：硫氧还蛋白，DsbA，DsbC。 3.插入一个定位到周质空间的信号序列。 不同载体提供不同的标记，有的可以同时带有多个标记。如果你不希望在蛋白的N末端加入任何的多肽，你也可以选择用NdeⅠ直接从起始密码子后插入外源片断，或者在得到表达产物后利用蛋白氨基酸的酶切位点把多余的多肽切除。 以下是Novagen载体带有标记及抗性的列表：
pET-SUMO 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4790 pET--‐SUMO pETsumo载体基本信息 载体名称: pET--‐SUMO 质粒类型: 大肠杆菌表达载体 高拷贝/低拷贝: 低拷贝 启动子: T7 和 lacO 克隆方法: TA C loning 载体大小: 5643bp 5' 测序引物及序列: T7 F orward 3' 测序引物及序列: --‐--‐ 载体标签: His T ag(6x)；SUMO T ag 载体抗性: 卡那霉素 筛选标记: --‐--‐ 备注: 宿主菌株BL21(DE3)；IPTG诱导 稳定性: --‐--‐ 组成型: 诱导型 病毒/非病毒: 非病毒 pETsumo载体质粒图谱和多克隆位点信息
pETsumo载体简介 The Champion pET--‐SUMO Expression System produces the highest levels of soluble protein i n E. c oli. I t u tilizes a s mall u biquitin--‐related m odifier (SUMO) f usion, b elonging t o the growing family of ubiquitin--‐related proteins, to enhance the solubility of expressed fusion proteins. In contrast to ubiquitin, SUMO is involved in the stabilization and localization of proteins in vivo. After expression, the 11 kd SUMO moiety can be cleaved by the highly specific and active SUMO (ULP--‐1) protease at the carboxyl terminal, producing a native protein*. The Champion pET SUMO Protein and Peptide Expression System o ffers: Greatly enhanced solubility with an N--‐terminal SUMO fusionHighly efficient cleavage--‐ produces n ative p rotein o f i nterest w ith S UMO (ULP--‐1) p rotease*Highly s pecific c leavage--‐ eliminates the chance of your protein of interest being internally digested, regardless of its a mino a cid s equenceSignificantly i ncreased s tability w ith S UMO f usion--‐can b e u sed f or small peptide productionT7lac promoter for high--‐level protein expressionN--‐terminal 6xHis t ag f or p rotein d etection a nd p urification. pETsumo载体序列
pET-48b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4670 pET--‐48b(+) pET48b载体基本信息 别名: pET48b, p ET 48b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5605 b p 5' 测序引物序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3'; Trx--‐F: 5'--‐TTCCTCGACGCTAACCTG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐TGCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐Trx, N--‐His,N--‐HRV 3C, C--‐S, C--‐Thrombin 载体抗性: Kanamycin (卡那霉素) 备注: Same as pET47 but also has Nterm Trx Tag; contains HRV 3C Protease cleavage site for fusion tag removal at low temperatures; Cterm thrombin c leavage s ite. 稳定性: 瞬时表达 组成型: 组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pET48b载体质粒图谱和多克隆位点信息
pET48b载体简介 pET--‐48b载体含有N端Trx和His标签，在标签后面紧跟着的是HRV 3C蛋白酶切位点。HRV 3C蛋白酶能够高特异性的识别LEVLFQ↓GP蛋白序列，能够在低温下高效切割掉融合标签序列。pET--‐48b载体还含有一个可选择的C端Thrombin蛋白酶切位点，紧接着位点后是S标签。 pET48b载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够
植物基因在大肠杆菌中的原核表达 通过大肠杆菌表达目的基因大量获得重组蛋白是一个方便快捷的方法。植物中克隆的目的基因被克隆到特异设计的质粒载体上，受噬菌体T7强启动子控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。 当需要表达蛋白时，在细菌培养基中加入IPTG来启动表达。不同载体在邻近克隆位点处具有编码不同的多肽“标签”的序列，在定位、检测或纯化目的蛋白时提供方便。 以pET-32a(+)为例，介绍将目的基因克隆进载体并进行表达获得重组蛋白的过程，从而熟悉根据自己的要求采用不同的载体进行原核表达的全过程。 1.准备工作（试剂配置和器材准备） 1)操作流程示意图 主要步骤操作 ①制备pET-32a(+)载体用限制性酶消化，去磷酸化后胶纯化回收 ②制备插入DNA PCR装入质粒后进行限制性消化，再回收 ③插入片段克隆到pET-32a(+)载体插入片段与pET连接，转化 ④转化表达宿主菌BL21 转化带有T7RNA聚合酶基因的菌株 ⑤诱导表达目的蛋白 SDS-PAGE，Western 印迹、定量分析确定目的蛋白 ⑥放大试验纯化目的蛋白放大试验，制备粗提物，亲和纯化，切除融合标签 2)配制生长培养基如LB，和100mM IPTG,50μg/ml 卡那霉素存储液。 3)宿主菌的保存。长期存放菌株和pET重组子应保存于甘油中。 4)感受态细胞的制备，参照其它试验手册。 2.操作步骤 [1] 制备载体 1）载体消化和胶纯化 3μg pET载体 3μl 10×限制性内切酶buffer 10-20U 两种酶（是否共用buffer; 酶体积不要超过反应体系的10%） 3μl 1mg/ml乙酰BSA（根据需要 补足水到30μl
pET-22b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT5200 pET--‐22b(+) pet22b载体基本信息 别名: pET22b, p et 22b, p ET--‐22b(+) 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5500bp 5' 测序引物及序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐GCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐pelB; C--‐His 载体抗性: 氨苄 备注: pET22b载体含有PelB信号肽序列， 能够将表达的目的蛋白定位在细胞外周质腔。 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pet22b载体质粒图谱和多克隆位点信息
pet22b载体简介 pET--‐22b(+)载体携带有一个N端的pelB信号肽序列，能够将表达的目的蛋白定位于外周质腔，同时载体含有C端His标签。载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列的作用下终止蛋白翻译。 pet22b载体序列 ORIGIN 1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA 61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT 121 TGTTAGCAGC CGGATCTCAG TGGTGGTGGT GGTGGTGCTC GAGTGCGGCC GCAAGCTTGT 181 CGACGGAGCT CGAATTCGGA TCCGAATTAA TTCCGATATC CATGGCCATC GCCGGCTGGG 241 CAGCGAGGAG CAGCAGACCA GCAGCAGCGG TCGGCAGCAG GTATTTCATA TGTATATCTC 301 CTTCTTAAAG TTAAACAAAA TTATTTCTAG AGGGGAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCCC 361 TATAGTGAGT CGTATTAATT TCGCGGGATC GAGATCTCGA TCCTCTACGC CGGACGCATC 421 GTGGCCGGCA TCACCGGCGC CACAGGTGCG GTTGCTGGCG CCTATATCGC CGACATCACC 481 GATGGGGAAG ATCGGGCTCG CCACTTCGGG CTCATGAGCG CTTGTTTCGG CGTGGGTATG 541 GTGGCAGGCC CCGTGGCCGG GGGACTGTTG GGCGCCATCT CCTTGCATGC ACCATTCCTT 601 GCGGCGGCGG TGCTCAACGG CCTCAACCTA CTACTGGGCT GCTTCCTAAT GCAGGAGTCG
Pichia酵母表达系统使用心得 摘要：Pichia酵母表达系统广泛应用于外源基因表达。 生物通编者按：甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 + 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多 EasySelect Pichia Expression System
产品性能： 优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化 缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题 全面产品报告及心得体会： 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K 无法比拟的。 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。 基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等情况后，当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上，我的表达蛋白有些恐怖，有100KD，本来当然应该放在大肠杆菌中表达，但是为了分泌表达（其实后来发现大肠杆菌pET系列分泌表达系列也不错）和糖基化修饰（主要是这个方面，因
pET 原核表达 pET 载体中，目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达。Novagen 的pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。 优点 ·是原核蛋白表达引用最多的系统 ·在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低 ·真正的调节表达水平的“变阻器”控制 ·提供各种不同融合标签和表达系统配置 ·可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌 ·许多载体以LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR 产物 ·许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化 阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。 pET 系统概述 pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统，Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。 控制基础表达水平 pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。 宿主菌株 质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λDE3 溶原菌）中表达目标蛋白。在λDE3 溶原菌中，T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。pLys 质粒编码T7 溶菌酶，它是T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。pLysS 宿主菌产生低量T7 溶菌酶，而pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的λDE3 溶原菌。 有11 种不同DE3 溶原化宿主菌。使用最广泛的为BL21 及其衍生菌株，它的优点在于缺失lon 和ompT 蛋白酶。B834 菌株为甲硫氨酸营养缺陷型，因此可用35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸对目标蛋白进行高特异活性标记。BLR 为recA - 衍生菌株，改善了质粒单体产量，有助于稳定含有重复序列的目标质粒。两个硫氧还蛋白还原酶( trxB ) 突变菌株(AD494,BL21 trxB ) ，有利于大肠杆菌胞浆中二硫键形成。Origami TM 和OrigamiB 菌株为trxB/gor 双突变，这两个酶是主要还原途径的关键酶。Origami 和OrigamiB 宿主菌的主要优点是能形成正确折迭的含有二硫键的蛋白。新的Rosetta TM 菌株补充了四种大肠杆菌稀有密码子的tRNA ，改善了由于密码子使用频率不同而引起的一些真核蛋白低表达。其它菌株背景包括K-12 菌株HMS174 和NovaBlue ，象BLR 一样为recA - 。这些菌株可稳定表达其产物可能导致DE3 噬菌体丢失的某些目标基因。由于存在F 附加体编码
原核表达步骤 原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到 JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋白，然后进行蛋白纯化。本实验方案的前提是，目的基因已克隆到载体，并已转进入JM109菌株中。 1．鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌JM109或BL21中大量表达 （1）制样 1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加入0.7ul Amp（100mg/mL），37o C200r/min摇床培养，过夜活化。 2. 以1：50比例（200ul），将活化的过夜培养物加入10mL LB液体培养基中，加入10uLAmp（100mg/ml），37o C200r/min摇床扩大培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。(一般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第一次实验时需要确定这个最佳时间) 3. 从10ml扩大培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空白对照（CK），其余7ml菌液加入7ul IPTG（储存浓度为0.5mol/l），使IPTG 终浓度达到0.5mmol/l。以200r/min的转速，37o C摇床培养3h。 4. 以5000r/min离心2min收集菌体，倾倒上清，每个离心管收集3ml培养物。 5. 加入1ml dH2O，将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤，8000r/min 离心2min，倾倒上清。 6. 重复步骤5。将离心管中的水倒干净。 （二）菌落SDS-PAGE 1. 在收集的菌体中加入200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，一般200ul比较合适)。用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。 2. 将样品于100℃恒温加热器上开盖加热10min（Marker也要加热）。样品凉后，12000r/min离心3min，取每管的上清点样。上样量一般30ul—40ul，marker 20ul。 （3）SDS-PAGE分析 1. 根据目的片段的大小，制作不同浓度的分离胶 蛋白分子量 (kDa)凝胶浓度 (%) 4-4020
pET-3a(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT5510 pET--‐3a(+) pet3a载体基本信息 别名: pET3a, p et 3a 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 4640bp 5' 测序引物: T7 5' 测序引物序列: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3' 载体标签: N--‐T7 载体抗性: Ampicillin 备注: Same a s p ET9 b ut a mpR; a,b,c,d v ary b y M CS. 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pet3a载体质粒图谱和多克隆位点信息
pet3a载体简介 The maps for pET--‐3b, pET--‐3c and pET--‐3d are the same as pET--‐3a (shown) with the following exceptions: pET--‐3b is a 4639bp plasmid; subtract 1bp from each site beyond BamH I a t 510. p ET--‐3c i s a 4638bp p lasmid;subtract 2bp f rom e ach s ite b eyond B amH I a t 510. pET--‐3d is a 4637bp plasmid; the BamH I site is in the same reading frame as in pET--‐3c. An Nco I site is substituted for the Nde I site with a net 1bp deletion at position 550 o f p ET--‐3c. A s a r esult, N co I c uts p ET--‐3d a t 546. F or t he r est o f t he s ites,subtract 3bp from each site beyond position 551 in pET--‐3a. Nde I does not cut pET--‐3d. The pET--‐3a--‐d vectors carry an N--‐terminal T7?Tag? sequence and BamH I cloning site. These vectors are the precursors to many pET family vectors; the pET--‐23a--‐d(+) series corresponds to pET--‐3a--‐d but incorporates several additional features. Unique sites are shown on the circle map.Note that the sequence is numbered by the pBR322 convention, so the T7 expression region is reversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding s trand t ranscribed b y T7 R NA p olymerase i s s hown a bove.
原核生物及其多样性 【摘要】：原核生物是由原核细胞构成的生物【1】，其多样性在维持生物圈生态平衡和为人类提供广泛的、大量的未开发资源方面起着重要的作用。原核生物生活在各种生境中，包括在其他生物无法生存的条件下，其仍能进行多种形式的物质循环，并以我们初步了解的方式同其他生命形式相互作用。原核微生物的多样性在形式和分化上表现并不突出，而主要表现在物种和基因水平上。因此，研究原核微生物及其重要性具有主要的意义。 【关键字】：原核生物多样性 【正文】： 1.原核生物 原核生物最早是由Chatton提出的，原核生物是指一类无真正细胞核的单细胞生物或类似于细胞的简单组合结构的微生物【2】。20世纪70年代，Woese和Fox根据不同生物类群细胞中的ssuRNA的序列同源性提出了生物的三域学说，即地球上所有的细胞生物由细菌域、古菌域和真核生物组成，细菌和古菌都是原核生物。原核生物是由原核细胞构成的生物，原核细胞中无膜围的核和其他细胞器。 原核生物是没有成形的细胞核或线粒体的一类单细胞生物。原核生物对人类生活的影响，有利也有弊。植物病原原核生物是仅次于真菌和病毒的第3大类病原生物，浸染植物可引起许多重要的病害，造成农作物的严重减产，例如国内外普遍发生的茄科植物的青枯病、水稻白叶枯病、白菜软腐病；有国外危害严重，国内尚未发生的检疫性病害梨火疫病和玉米枯萎病，还有在国内较普遍的泡桐丛枝病和枣疯病等【3】。但是原核生物也有着许多对人类有益的地方，比如，中国的泡菜制作，就需要利用乳酸菌来发酵。现在，已经发现越来越多的原核生物的有利之处。例如，近年来的研究表明，致突变、致畸和致癌这三者之间具有较强的相关性，即多数的致癌物就是细菌诱变剂，而且通常的致畸剂量就可引起致突变，加之各种环境因子对原核生物的致突变作用与它对哺乳动物的潜在致癌作用有关【4】，原核生物rRNA在分子生物学研究中也得到了越来越广泛的应用【5】，对冰河消退时土壤微生物碳含苗的研究表明，微生物生物量与冰河峰面消退程度和植被盖度均呈正相关【6】。总的说来，原核生物对人类的利大于弊。 目前全球已描述的已描述的原核微生物种数约7000种，许多原核生物所生存的环境，一般生物都无法生存。位于中国西南边陲的腾冲的大滚锅(DGG)和龙陵的大沸泉(DFQ)相距约70km，两泉泉水出口温度均在96℃左右，据研究又如细菌和古茵在腾冲的大滚锅(DGG)和龙陵的大沸泉(DFQ)2个高温热泉中均有一定数量的存在【7】。 2.原核微生物的多样性 不同人对原核生物多样性的定义不一。根据世界自然保护联盟(1UCN)提出的定义，原核微生物的生物多样性包括所有原核微生物的生命形式、生态系统和生态过程以及有关在遗传、分类和生态系统水平上的知识概念【8】。而 Watve等则认为，微生物多样性可细致划分为生活环境多样性、生长繁殖速度多样性、营养和代谢类型多样性、生活方式多样性、基因多样性和微生物资源开发利用多样性等【9】。微生物多样性的分析主要集中在土壤、海洋和地表水【10】，本文主要探讨原核生物的生态多样性、代谢多样性和遗传多样性。
pET-41a(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4930 pET--‐41a(+) pET41a载体基本信息 别名: pET41a, p ET 41a 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5933 b p 5' 测序引物: pGEX--‐5': 5'--‐GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG--‐3' 3' 测序引物: T7t: 5'--‐GCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐GST, N--‐His, N--‐Thrombin, N--‐EK, N--‐S 载体抗性: 卡那 备注: 载体带有GST蛋白纯化标签，pET41 a,b,c 的差异是在于多克隆位点。 稳定性: 瞬时表达 组成型: 组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pET41a载体质粒图谱和多克隆位点信息
pET41a载体简介 pET41系列载体是设计用来克隆和高水平表达蛋白质的载体，载体融合表达一个含有220 个氨基酸的GST标签蛋白纯化片段。pET41a载体的单一的多克隆位点见上面的环状质粒 图谱。注意：载体序列是以pBR322质粒的编码规矩进行编码的，所以T7蛋白表达区在 质粒图谱上面是反向的。 T7 RNA聚合酶启动的克隆和表达区域在质粒图谱中也被标注了出来。质粒的F1复制子 是被定向的，所以在T7噬菌体聚合酶的作用下，包含有蛋白编码序列的病毒 粒子能够 产生，并启动蛋白表达，同时蛋白表达将被T7终止子序列(Cat. N o. 69337--‐3)的作用下终 止蛋白翻译。 pET--‐41a载体上面含有一个EK蛋白酶切位点，当将目的基因使用载体上面的PshAI限制 性内切酶位点插入进去时，可以通过EK蛋白酶将载体上的融合的所有氨基酸序列包括GST标签序列，全部切除掉。
pET-14b 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4150 pET--‐14b pET14b载体基本信息 别名: pET14b, p et 14b 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 4671bp 5' 测序引物: T7 5' 测序引物序列: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3' 载体标签: N--‐His, N--‐thrombin 载体抗性: Ampicillin 备注: Hosts: E.coli. R elated v ectors: p BR322. 稳定性: 瞬时表达 Transient 组成型: 组成型 Constitutive 病毒/非病毒: 非病毒 pET14b载体质粒图谱和多克隆位点信息
pET14b载体简介 The p ET--‐14b v ector (Cat. N o. 69660--‐3) c arries a n N--‐terminal H is?Tag? s equence f ollowed b y a thrombin site and three cloning sites. Unique sites are shown on the circle map. Note that thesequence i s n umbered b y t he p BR322 c onvention, s o t he T7 e xpression r egion i s r eversed on the circular map. The cloning/expression region of the coding strand transcribed by T7 RNA p olymerase i s s hown b elow. pET14b载体序列 ORIGIN 1 TTCTCATGTT TGACAGCTTA TCATCGATAA GCTTTAATGC GGTAGTTTAT CACAGTTAAA 61 TTGCTAACGC AGTCAGGCAC CGTGTATGAA ATCTAACAAT GCGCTCATCG TCATCCTCGG 121 CACCGTCACC CTGGATGCTG TAGGCATAGG CTTGGTTATG CCGGTACTGC CGGGCCTCTT 181 GCGGGATATC GTCCATTCCG ACAGCATCGC CAGTCACTAT GGCGTGCTGC TAGCGCTATA 241 TGCGTTGATG CAATTTCTAT GCGCACCCGT TCTCGGAGCA CTGTCCGACC GCTTTGGCCG 301 CCGCCCAGTC CTGCTCGCTT CGCTACTTGG AGCCACTATC GACTACGCGA TCATGGCGAC 361 CACACCCGTC CTGTGGATAT CCGGATATAG TTCCTCCTTT CAGCAAAAAA CCCCTCAAGA 421 CCCGTTTAGA GGCCCCAAGG GGTTATGCTA GTTATTGCTC AGCGGTGGCA GCAGCCAACT 481 CAGCTTCCTT TCGGGCTTTG TTAGCAGCCG GATCCTCGAG CATATGGCTG CCGCGCGGCA 541 CCAGGCCGCT GCTGTGATGA TGATGATGAT GGCTGCTGCC CATGGTATAT CTCCTTCTTA 601 AAGTTAAACA AAATTATTTC TAGAGGGAAA CCGTTGTGGT CTCCCTATAG TGAGTCGTAT 661 TAATTTCGCG GGATCGAGAT CTCGATCCTC TACGCCGGAC GCATCGTGGC CGGCATCACC 721 GGCGCCACAG GTGCGGTTGC TGGCGCCTAT ATCGCCGACA TCACCGATGG GGAAGATCGG 781 GCTCGCCACT TCGGGCTCAT GAGCGCTTGT TTCGGCGTGG GTATGGTGGC AGGCCCCGTG 841 GCCGGGGGAC TGTTGGGCGC CATCTCCTTG CATGCACCAT TCCTTGCGGC GGCGGTGCTC 901 AACGGCCTCA ACCTACTACT GGGCTGCTTC CTAATGCAGG AGTCGCATAA GGGAGAGCGT 961 CGACCGATGC CCTTGAGAGC CTTCAACCCA GTCAGCTCCT TCCGGTGGGC GCGGGGCATG 1021 ACTATCGTCG CCGCACTTAT GACTGTCTTC TTTATCATGC AACTCGTAGG ACAGGTGCCG 1081 GCAGCGCTCT GGGTCATTTT CGGCGAGGAC CGCTTTCGCT GGAGCGCGAC GATGATCGGC 1141 CTGTCGCTTG CGGTATTCGG AATCTTGCAC GCCCTCGCTC AAGCCTTCGT CACTGGTCCC 1201 GCCACCAAAC GTTTCGGCGA GAAGCAGGCC ATTATCGCCG GCATGGCGGC CGACGCGCTG 1261 GGCTACGTCT TGCTGGCGTT CGCGACGCGA GGCTGGATGG CCTTCCCCAT TATGATTCTT 1321 CTCGCTTCCG GCGGCATCGG GATGCCCGCG TTGCAGGCCA TGCTGTCCAG GCAGGTAGAT 1381 GACGACCATC AGGGACAGCT TCAAGGATCG CTCGCGGCTC TTACCAGCCT AACTTCGATC 1441 ACTGGACCGC TGATCGTCAC GGCGATTTAT GCCGCCTCGG CGAGCACATG GAACGGGTTG 1501 GCATGGATTG TAGGCGCCGC CCTATACCTT GTCTGCCTCC CCGCGTTGCG TCGCGGTGCA 1561 TGGAGCCGGG CCACCTCGAC CTGAATGGAA GCCGGCGGCA CCTCGCTAAC GGATTCACCA 1621 CTCCAAGAAT TGGAGCCAAT CAATTCTTGC GGAGAACTGT GAATGCGCAA ACCAACCCTT 1681 GGCAGAACAT ATCCATCGCG TCCGCCATCT CCAGCAGCCG CACGCGGCGC ATCTCGGGCA 1741 GCGTTGGGTC CTGGCCACGG GTGCGCATGA TCGTGCTCCT GTCGTTGAGG ACCCGGCTAG 1801 GCTGGCGGGG TTGCCTTACT GGTTAGCAGA ATGAATCACC GATACGCGAG CGAACGTGAA 1861 GCGACTGCTG CTGCAAAACG TCTGCGACCT GAGCAACAAC ATGAATGGTC TTCGGTTTCC 1921 GTGTTTCGTA AAGTCTGGAA ACGCGGAAGT CAGCGCCCTG CACCATTATG TTCCGGATCT 1981 GCATCGCAGG ATGCTGCTGG CTACCCTGTG GAACACCTAC ATCTGTATTA ACGAAGCGCT
pET-37b(+) 编号 载体名称 北京华越洋生物VECT4740 pET--‐37b(+) pET37b载体基本信息 别名: pET37b, p et 37b, p ET--‐37b(+) 质粒类型: 大肠杆菌蛋白表达 表达水平: 高 克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶 载体大小: 5932 b p 5' 测序引物及序列: T7: 5'--‐TAATACGACTCACTATAGGG--‐3' 3' 测序引物序列: T7t: 5'--‐GCTAGTTATTGCTCAGCGG--‐3' 载体标签: N--‐Signal, N--‐CBD, N--‐S, N--‐Thrombin, N--‐EK, C--‐His 载体抗性: 卡那 备注: --‐--‐ 稳定性: 瞬时表达 组成型: 组成型 病毒/非病毒: 非病毒 pET37b载体质粒图谱和多克隆位点信息
pET37b载体简介 载体含有N端纤维素结合结构域(N--‐CBD), 是分泌性蛋白表达载体。 pET37b载体序列 ORIGIN 1 ATCCGGATAT AGTTCCTCCT TTCAGCAAAA AACCCCTCAA GACCCGTTTA GAGGCCCCAA 61 GGGGTTATGC TAGTTATTGC TCAGCGGTGG CAGCAGCCAA CTCAGCTTCC TTTCGGGCTT 121 TGTTTAGCAG CCTAGGTATT AATCAATTAG TGGTGGTGGT GGTGGTGGTG GTGCTCGAGT 181 GCGGCCGCAA GCTTGTCGAC GGAGCTCGAA TTCGGATCCG ATATCGCCAT GGCCAGAGGA 241 GAGTTAGAGC GACCCTCAAT ACCGGAGCCA CCACCGGTAC CCAGATCTGG GCTGTCCATG 301 TGCTGGCGTT CGAATTTAGC AGCAGCGGTT TCTTTCATAC CAATTGCAGT ACTACCGCGT 361 GGCACCAGAC CCGCGGAACC TGGTGCCGTG GGGCTGGTCG TCGGCACGGT GCCCGTGCAG 421 GTGGTGCCGT TGAGCGAGAA CGACGCCGGC GTCGGGTTGG ACCCGGCCCA CGAGCCGTTG 481 AACCCGAACG ACGCCGTGCC GCCGGTCGGG ATGCTGCCGT TCCAGGGCAG GCTGGTGACG 541 GAGACCTGGC CGCCGTTGGT CGAGGCGGTG CCGTTCCACA GCTGCTGGAT ACGCTGGCCT 601 GCGGTGTAGG TCCAGTCGAG CTTCCACGAC GAGACGGGGT CGCCGAGGTT GGTGATCGTG 661 ACGTTGGCGC CGAAGCCGCC GGGCCACTGG TTGGTGACGG CGTAGTCGAC GCGGCAGCCG 721 GGACTAGCGG CCTGGGCGGG CAGCACGACC GTGGCGCCGA CGACGAGCGT CGCCGCCGCG 781 GCGGCGAGCG TCGTGCGCAG AGCGGTGCGG GCGCCGCGGG CCGGGTGGCC GGGTGCGGGC 841 GTGGTACGAG GGTCCATATG TATATCTCCT TCTTAAAGTT AAACAAAATT ATTTCTAGAG 901 GGGAATTGTT ATCCGCTCAC AATTCCCCTA TAGTGAGTCG TATTAATTTC GCGGGATCGA 961 GATCGATCTC GATCCTCTAC GCCGGACGCA TCGTGGCCGG CATCACCGGC GCCACAGGTG 1021 CGGTTGCTGG CGCCTATATC GCCGACATCA CCGATGGGGA AGATCGGGCT CGCCACTTCG 1081 GGCTCATGAG CGCTTGTTTC GGCGTGGGTA TGGTGGCAGG CCCCGTGGCC GGGGGACTGT 1141 TGGGCGCCAT CTCCTTGCAT GCACCATTCC TTGCGGCGGC GGTGCTCAAC GGCCTCAACC 1201 TACTACTGGG CTGCTTCCTA ATGCAGGAGT CGCATAAGGG AGAGCGTCGA GATCCCGGAC 1261 ACCATCGAAT GGCGCAAAAC CTTTCGCGGT ATGGCATGAT AGCGCCCGGA AGAGAGTCAA 1321 TTCAGGGTGG TGAATGTGAA ACCAGTAACG TTATACGATG TCGCAGAGTA TGCCGGTGTC 1381 TCTTATCAGA CCGTTTCCCG CGTGGTGAAC CAGGCCAGCC ACGTTTCTGC GAAAACGCGG 1441 GAAAAAGTGG AAGCGGCGAT GGCGGAGCTG AATTACATTC CCAACCGCGT GGCACAACAA 1501 CTGGCGGGCA AACAGTCGTT GCTGATTGGC GTTGCCACCT CCAGTCTGGC CCTGCACGCG 1561 CCGTCGCAAA TTGTCGCGGC GATTAAATCT CGCGCCGATC AACTGGGTGC CAGCGTGGTG 1621 GTGTCGATGG TAGAACGAAG CGGCGTCGAA GCCTGTAAAG CGGCGGTGCA CAATCTTCTC 1681 GCGCAACGCG TCAGTGGGCT GATCATTAAC TATCCGCTGG ATGACCAGGA TGCCATTGCT 1741 GTGGAAGCTG CCTGCACTAA TGTTCCGGCG TTATTTCTTG ATGTCTCTGA CCAGACACCC 1801 ATCAACAGTA TTATTTTCTC CCATGAAGAC GGTACGCGAC TGGGCGTGGA GCATCTGGTC 1861 GCATTGGGTC ACCAGCAAAT CGCGCTGTTA GCGGGCCCAT TAAGTTCTGT CTCGGCGCGT