毕赤酵母表达系统使用心得
PichiaPichiaPichiaPichia酵母表达系统使用心得甲醇酵母表达系统有不少优点其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高但是在实际操作中并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题收集了部分用户在使用EasySelectPichiaExpressionSystem这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中XiangYang是来自美国乔治城大学GeorgetownUniversityLombardi癌症中心LombardiCancerCenter部分用户来自国内。甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较1.属于真核表达系统具有一定的蛋白质翻译后加工有利于真核蛋白的表达优点-2.AOX强效启动子外源基因产物表达量高可以达到每升数克表达产物的水平3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物远较真核系统简单非常适合大规模工业化生产。4.可以诱导表达也可以分泌表达便于产物纯化。5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源生产成本低表示优胜于-表示不如表示差不多EasySelectPichiaExpressionSystem产品性能优点——使用简单表达量高His-tag便于纯化缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题全面产品报告及心得体会巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种一方面由于其是属于真核生物因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰另一方面毕赤酵母生长速度快可以将表达的蛋白分泌到培养基中方便蛋白纯化。毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点MCR3端带有his-tag和c-mycepitopes这些tag有利于常规检测和纯化而且在MCR5端引入了
alphafactorα-factor用以增加表达并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候如果你选择的是EcoRI那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序
列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。第一步————————构建载体XiangYangpPICZ系列有许多克隆位点可供选择同时也有三种读码框以便不用的用户需要。红叶山庄有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列pPIC9K属于穿梭质粒也可以在原核表达而pPICZ系列比较容易操作大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选PIC9K操作麻烦一点大肠用amp抗性而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆在利用G418筛选多拷贝而且对于大小合适30—50KD的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。leslie要做毕赤酵母表达实验首先当然就要了解这个可爱的酵母了椭圆形肥嘟嘟的十分可爱她和大肠杆菌长得有较大区别大肠杆菌是杆状的因此在培养的过程中要区别这两种菌体除了气味浓度颜色以外也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧表达过程中染菌我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌那真是一段可怕的经历如果在不知情的情况下继续做下去那可以就是浪费大把的时间了。基本熟悉了毕赤酵母了解了她生长的喜好多糖偏酸环境生长的周期等等情况后当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上我的表达蛋白有些恐怖有100KD本来当然应该放在大肠杆菌中表达但是为了分泌表达其实后来发现大肠杆菌pET系列分泌表达系列也不错和糖基化修饰主要是这个方面因为我的蛋白是人源的表达出来用于酵母双杂因此需要有完备的糖基化修饰。这样我的DNA片段由于较长所以在做克隆的时候也要非常小心需要注意的是?酶切位点不能出现在目的DNA片段中——如果片段长无法避免可以采用平末端连接?虽然α-factor可以自动切除但是在设计表达的时候如果在N端不能出现任何多余的aa比如
药物蛋白表达需要特别留意说明书上有详细说明P13?有三种不同的读码框对于pPICZα系列来说就是对上α-factor序列在设计克隆的时候要反复确定自己的读码框是否正确这可是致命的问题?无论pPICZ还是pPICZα都有TGA终止密码子但
是pPICZ系列没有ATG起始密码子有人认为酵母启动子与外源基因的ATG之间的距离越短对于表达的该基因越有利?如果不希望有c-myc和His-tag可以在基因片段末尾加入终止密码子?Pichia的密码子与酿酒酵母的相似有关基因表达偏好密码子的问题有人认为没有必要更换有人认为一定要换个人认为以产量为主要目的的可以考虑更换基因密码子而如果片段过长就比较麻烦不过有许多真核保守蛋白其实是和酵母密码子相似的?克隆菌株需要有recAendA试剂盒带有的TOP10挺好用的其它像是DH5α都行但是要注意带有筛选抗生素Zeocin的培养基要用低盐培养基NaCl减半这主要是因为怕影响到抗生素作用Zeocin平板要避光保存?测序引物可以用α-factor信号引物也可以用5AOX1引物?如果需要高量表达可以考虑做克隆的时候串联基因片段进行表达另外也可以在转化酵母的时候重复转化。?目的基因中最好不要含有pro-glu-ser-thr这样的序列因为这个序列是激活蛋白水解酶的作用底物会影响表达另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x这样的序列x任何氨基酸因为这些序列容易受到容酶体的切割而且目的蛋白末端最好是alaaspvalser这样的氨基酸。除此之外许多高AT含量的基因通常会由于提前终止而不能有效转录也需要多加注意。第二步就是将线性化的DNA转化入Pichia酵母中。XiangYangEasySelect试剂盒准备了三种菌株X33GS115和KM71H。我倾向于选择X33因为这个菌株转化率和表达量相对而言较高如果你有电转仪
electroporator可以尝试一下。如果没有的话EasySelect也准备了化学转化试剂——EasyCompTransformation但是由于转化率的缘故我建议使用电转仪。
leslie在得到了正确的序列之后就可以准备转化毕赤酵母了试剂盒携带有的是X-33GS115和KM71H这三种毕赤酵母另外常用的还有SMD1168每种酵母的特点有些不尽相同Manual上写的很清楚其中X-33由于是野生型因此耐受性比较好如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌而GS115与X33一样都是属于MUT表现型也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长但是据说会对外源基因表达有影响KM71是MUT-型
酵母在甲醇培养基中生长缓慢但是也有利于翻译后加工比如形成二硫键糖基化等等另外SMD1168则是基因组中的Pep4基因发生突变造成蛋白水解酶活性的丧失可以保护表达产物免受降解促进表达量的提高。一般来说如果是胞内表达应尽量用Mut 细胞这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量相对较多约占Pp总分泌蛋白量的30-90如人乙酰胆碱酯酶B变异链的含量占到90使下游纯化更易进行。而对于分泌蛋白的表达无论是甲醇利用慢Mut-还是甲醇利用快Mut的细胞都可应用如在人血清白蛋白HSA为分泌型蛋白的表达中就看不出两种类型的细胞之间有什么明显差别。所以一般手册都会建议同时在这几种菌株中进行转化这主要是因为不同的基因在不同的酵母菌中可能表达量截然不同因此在最开始的时候建议多用几种酵母菌实验。另外有个保存问题原始酵母菌一定要保存好因为酵母在传代多次后会影响其转化率和表达量所以一方面分多管分装保存于-80?另一方面如果出现了转化或者表达的问题在其它方面都没有出错的前提下可以考虑重新取出新菌液每次都要涂平板挑菌。在准备酵母菌的同时也需要准备质粒由于酵母菌转化对转化质粒的要求较高量也较大5-10ug因此许多时候都会用PEG大提质粒或者用大提试剂盒总而言之要准备好足够量的质粒并且不要忘记也要同时准备空载体以做对照。
在转化前质粒需要进行线性化这主要是为了增加重组率EasySelect试剂盒表达量高的一个重要原因也就在于其原理是将目的片段整合到载体上大大的增加了目的片段的表达。线性化位点个人认为也会影响到表达量对于基因片段不大的蛋白可以考虑用几个线性化位点同时进行转化筛选但是如果片段大就有可能供选择的机会少而且也有可能遇上没有合适的线性化位点的情况这个时候也不是说不能进行表达但是准备的质粒就要增加10倍另外也可以进行部分酶切即先进行预实验掐定时间和酶量保证被切开的质粒有部分是在线性化位点切开而基因片段保存完好。在线性化之后的质粒就可以酒精沉淀回收了——中间步骤需要使酶失活说明书建议是热失活或者EDTA个人认为前者比较好主要是担心EDTA对于转化的影响另外这三种酶失
活的温度都是65?/20min。沉淀回收之后是离心10分钟用80的酒精洗涤后风干这一步需要多加注意保证风干完全因为有实验证明残留的酒精对于转化的影响颇大。接下来就是酵母转化了这是令许多人头疼的一步也是影响实验决定表达的关键步骤。转化方法有不少例如电转化学转化原生质体转化其方法的难易程度和转化率高低呈反向递减的也就是说电转最容易转化率较高但要求有电转仪而原生质体最麻烦而且效果不好比较传统因此不建议使用EasySelect说明书上这么建议并且也详细说明了电转化学转化EasyComp和LiCl方法的过程可以按部就班。需要注意的是电转过程?最好每次都从平板上挑酵母菌用培养过的酵母放置时间不要超过一个星期?扩大培养的浓度一定要控制好个人认为不需要OD600达到1.3-1.51.0-1.3的就好这个时候的酵母比较新鲜转化率比较高?整个感受态制作过程中一定要在冰上操作离心最好也用冷冻离心机这是影响转化的关键——为了进一步保证这一点无菌水可以是冰水混合物另外山梨醇和电转杯都要预冷?电转仪需要预热所以准备感受态的时候就可以把电转仪打开了电转后山梨醇的加入要快曾有人做实验证明晚一秒就会降低转化的数量级虽然不一定可信但是我个人也认为这个过程要快电转后可以看看时间如果时间过短比如〈4就可能说明杂质较多会影响转化率?转化后温育是个增加同源重组增加存活率的过程需要注意不要感染了大肠杆菌再加入培养基30?摇一段时间可以取部分涂板不同浓度抗生素或者也有人将菌短暂离心弃去上清剩余全部涂板以保证转化率。化学转化如果没有电转仪LiCl转化是一种可供选择的方法转化率是102到103cfu/ug。主要过程为取过夜活化培养的菌液按11000接种于15ml 新鲜的YPD液体培养基30?培养至OD600达到0.8-1.04?4500rpm离心5分钟用8ml 冰预冷的无菌水洗涤菌体倾除洗涤液用1mL4?4500rpm离心5分钟沉淀用50μl冰预冷的100mmol/LLiCl悬浮最后定容至80-90ml。LiCl转化取适量单链鲑精
DNA2mg/mL煮沸5min立即置于冰上备用取上述制备好的感受态细胞12000rpm离心15s吸弃LiCl溶液按顺序依次加入50PEG240ml1mmol/LLiCl36ml单链鲑精DNA25ml
线性化质粒DNA10ml约10mg用吸头反复吹打使细胞沉淀与加入的溶液混匀30?静置温育30min42?热击20-25min4500rpm离心10min吸弃转化液细胞沉淀加1mlYPD 培养基于30?200rpm培养2-4hr取转化混合液100ml涂布含100??g/mLZeocinTM的YPDS平板30?培养2-3天。第三步————————挑克隆筛选XiangYang在protocol中用了许多篇幅来指导这一步包括如何去通过平板筛选观测生长速率来确定Mut表现型等。这个过程需要3到5天而我一般只用用了4个小时进行PCRAOX引物筛选。leslie完成转化后就是克隆鉴定的过程了包括高拷贝筛选PCR 鉴定和表型鉴定的过程其中我做的比较多的是PCR鉴定因为比较快具体过程protocol上说的很清楚其实也很简单就是冻融破菌进行菌
落PCR但是其中许多具体细节问题也挺让人头痛的第一就是破壁的问题许多人用PCR方法进行鉴定都无法得到结果甚至在表达出了以后还是无法得到这张鉴定图片主要原因之一就是无法正常释放酵母基因组一般通过培养菌然后进行沸水和-20?冷冻循环过程裂解细胞在目的蛋白片段比较合适的范围以内是可以得到好的结果的但是有时候片段过长模壁就会阻碍扩增所以我们实验室会用蜗牛酶很便宜的酶来的来帮助溶菌我看许多实验室也会这么做不过加入的时间不同而已其次也有奢侈的用试剂盒的。第二就是是模板量个人建议模板真的不要加太多了按照说明书的上的
5ul我觉得还是多了而且建议总体积不用这么大当然加入模板的量也与自己培养菌的浓度以及用来冻融的菌数量有关。其次是假阳性和假阴性结果在Mut-和Mut情况是不一样的如果用的是5AOX引物KM71H会出现3.6kb的片段而Mut则会出现AOX1基因原本长度的片段——大约长2.2kb因此如果的基因片段长度相似要注意区分。建议PCR过程中使用多对引物进行反应包括自己基因的α-factor的5AOX 的都可以反正各种对照多了有利于比较——当然前提是你不能晕了头。掉了毛的鸵鸟巴斯德毕赤酵母包含醇氧化酶-1AOX1基因的启动子的转录终止子5’AOX1和
3’AOX1他们被多克隆位点分开外源基因可在此插入此外载体中还包含组氨酸脱氢
酶基因HIS4选择标记HIS4区的整合方式为位点特异性单交换引起的基因插入整合后使组氨酸缺陷型宿主his4恢复野生型.HIS4区或AOX1区位点的整合都使转化子具有HIS4基因因而可利用表型差异进行筛选酵母GS115具有组氨醇脱氢酶缺陷型基因his4可接受含HIS4的载体而具有HIS表型以筛选转化子.及3’AOX1区当整合型载体转化受体菌感受态细胞时他的5’AOX1和3’AOX1能与染色体上的同源基因重组从而使整个载体和外源基因插入到受体菌染色体上在加入甲醇作为唯一碳源的培养基中外源基因在5’AOX1启动子的控制下表达.在载体中引入Tn903Kanr基因抗G418有助于筛选高拷贝转化子转化子的拷贝数与抗G418的能力有关通过筛选抗G418能力强的酵母即可获得高拷贝转化子.外源基因是以同源重组的方式插入到酵母菌的染色体中因此不易丢失多次传代后酵母仍能稳定表达外源蛋白具有良好的遗传稳定性.第四步————————表达XiangYang将你的克隆在YPD培养基中培育到OD600值达到6.0就可以离心收菌。用表达培养基比如BMMY重悬沉淀在30??C培育过夜。leslie筛选鉴定出自己的重组子可以说什么都不能证明还是要看这一步的酵母表达有许多人在酵母表达上花费了大量的时间——不同于大肠杆菌的两天出结果一次毕赤酵母的表达就需要起码一周的时间筛选了上百上千的克隆但是仍然是竹篮打水一场空我个人建议如果在筛选完3批以上就可以放弃这一批转化的酵母菌另外调整进行重新转化。另外刚开始的时候可以用小量表达可以用5ml生长慢型生长快型阴性对照空质粒阳性对照可以是曾经表达成功的重组子和没有进行转化的酵母菌的单克隆BMGY中培养到OD值2-6离心收菌如果怕污染或者麻烦可以放置酵母菌一段时间一半为20-30分钟让菌沉淀下来小心倾倒去上清培养基获得菌转入BMMY中诱导表达这些步骤都需要在超净工作台里进行如果要区分是否染菌可以取一些到显微镜下观察或者闻气味酸甜的是酵母观颜色乳白色的是酵母。除此之外如果是小量表达有可能会在没有达到4天的时间培养基就干了所以可以适当补充一些以及在摇床里放置盛有无菌水的深口瓶来保持摇床里湿度。诱导物甲醇注意要在
超净台中打开可以分装到灭过菌的瓶子中——当然甲醇是不能灭菌的而且也要注意在用酒精灯过甲醇瓶口的时候要小心如果真的引起爆炸那可就损失大了。另外如果觉得每天添加甲醇麻烦也
有人用一次性注射器透过纱布添加甲醇这个方法可能会造成染菌慎选。说到纱布就想到了通气性问题酵母在无氧和有氧的情况下都可以存活但是在甲醇诱导的情况下毕赤酵母用的是醇氧化酶自然氧气量对于这一基因的表达影响重大但是由于害怕感染大肠杆菌纱布裹的也不能太少最好专辟出一个摇床进行三十度酵母表达这样可以考虑将纱布减少到3—5层同时需要注意的是摇瓶内菌液体积不要超过10-30。每天取样出来进行SDS-PAGE电泳鉴定能这样最好不过每天做胶跑胶染色真的很麻烦可以汇集一批同时跑不过样品一定要煮过冻存而且每次取样不要反复冻融最好分装保存——因为蛋白经煮沸变性会不稳定容易降解。另外为了防止蛋白在分泌出来的过程就降解了特别是小分子蛋白也可以通过调节培养基pH值抑制蛋白水解酶的活性这一方面说明书讲解得详细还可以加入酪蛋白氨基酸等保护物质竞争性抑制蛋白水解酶的活性来防止表达产物降解。如果使用的是分泌型培养基按道理收集培养基上清就可以进行下一步分析了但是由于培养基中的蛋白浓度PAGE胶一般是检测不出来的——除非你的表达蛋白量非常大。所以需要进行浓缩方法有TCA法硫酸氨盐析PEG沉淀透析超滤等等当然最简单的就是煮沸蒸发水分浓缩了。另外跑胶的时候同时对照酵母胞内蛋白以防没有分泌出来。SDS-PAGE的配置参见分子克隆注意你的蛋白大小与胶的浓度的对应性如果小到20kD以下可以考虑用tricine胶不过是个需要全盘重新准备的过程要考虑清楚。如果选用的载体是带有信号肽的虽说是分泌表达好纯化但实际上毕赤酵母本身还是有本底表达的而且有时候会造成假阳性所以最后表达过程需要用Westernblot或者Elasa通常都是用WB具体的细节可见WesternBlotting前传想成为高手吗系列文章另外要提一句的是如果本身蛋白没有合适抗体如果是利用从大肠表达出来的蛋白做出的抗体也有可能与用真核系统
表达出来的蛋白无法发生免疫作用可以选用anti-myc或者anti-his的前提当然是你的蛋白没有提前终止。其它在表达中可能出现的情况包括表达量低没有分泌表达针对pPICZa系列头两天蛋白量较大无法重复表达出来的蛋白偏大等等需要分各个方面分析原因比如蛋白明明加上了信号肽但是就是无法分泌出来这可能是蛋白结构在通过细胞膜的时候受到了阻碍可能需要重新转化更换线性化位点或者更换菌株如果蛋白表达第一天较高但是之后越来越少这很有可能是蛋白降解了或者产生了竞争表达毕赤酵母无法重复的问题比较严重许多情况下在第一次获得了高量表达之后就再怎么也重复不了这个结果遇到这种情况真是令人非常痛苦可是除了重新摸索条件还能怎么样呢而表达出来的蛋白分子量偏大则是个正常现象除了糖基化以外还有其它原因比如二聚体这些需要进行WB或进一步实验验证。第五步————————发酵和产物纯化XiangYang我用的是HisTraPColumnsGEHealthcare经过简单的纯化之后我可以得到90的目的蛋白。我的目的蛋白是一个大小为45kDa可以通过二硫键形成反向平行二聚体antiparallelhomodimer的糖蛋白经过纯化我通过一个细胞增殖实验cellproliferationassay检测了其活性结果表明表达出来的蛋白在体外有完全的活性。并且我也在体外利用受体分析了蛋白结合活性与对照通过大肠杆菌和Bacular细胞未带tag的蛋白相比his-tag有一点副作用。伊可丽由于在摇瓶培养中巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的水平往往不能准确地反映罐发酵中的表达情况使之成为令人头痛的问题。主要原因是在摇瓶培养中培养液的pH值无法控制培养物通气不充分及无法控制添加碳源的最适速率。但是为了避免对每一个表达菌株进行繁琐的发酵罐培养条件的实验仍需摸索表达菌株的摇瓶培养条件使其产物的表达量与预期的发酵罐培养
结果相近。总而言之EasySelect系统是一个便于操作的酵母表达系统我已经使用这一
系统表达过15个类似物了每一个我都获得了超过1mg/1升培养液的纯化蛋白。
毕赤酵母表达系统研究进展 作者：齐连权， 陈薇， 来大志， 于长明， 王海涛 作者单位：军事医学科学院微生物学流行病学研究所,北京,100071 刊名： 中国生物工程杂志 英文刊名：JOURNAL OF CHINESE BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2002,22(6) 被引用次数：11次 参考文献(21条) 1.Trinh L;Noronha S B;Fannon M Recovery of mouse endostatin producedby Pichia pastoris using expanded bed adsorption[外文期刊] 2000(04) 2.查看详情 3.Barr KA;Hopkins S A;Sreekrishna K Protocol for efficient secretion of HSA developed from Pichia pastoris 1992 4.Cereghino J L;Cregg J M Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 2000(1) 5.Kjeldsen T;Pettersson A F;Hach M Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(29) 6.Bewley M C;Tam B M;Grewal J X ray crystallography and massspectroscopy reveal that the N lobe of human transferrin expressed in Pichia pastorisis folded correctly but is glycosylated on serine 32 [外文期刊] 1999(08) 7.Kalidas C;Joshi L;Batt C Characterization of glycosylated variantsof beta lactoglobulin expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(03) 8.Briand L;Perez V;Huet J C Optimization of the production ofa honeybee odorant binding protein by Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 9.Rydberg E H;Sidhu G;Vo H C Cloning mutagenesis and structural analysis of human pancreatic alpha amylase expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 10.Guo R T;Chou L J;Chen Y C Expression in Pichia pastoris andcharacterization by circular dichroism and NMR of rhodostomin[外文期刊] 2001(04) 11.Zani M;Brillard Bourdet M;Lazure C Purification and characterization of active recombinant rat kallikrein rK9[外文期刊] 2001(02) 12.ChirulovaV;Cregg J M;Meagher M M Recombinant protein production in an alcohol oxidase defective strain of Pichia pastoris in fed batch fermentations[外文期刊] 1997 13.Hasslacher M;Schall M;Hayn M High level intracellular expression of hydroxynitrile lyase from the tropical rubber tree Hevea brasiliensis in microbial hosts[外文期刊] 1997(1) 14.Takahashi K;Takai T;Yasuhara T Effects of site directed mutagenesis in the cysteine residues and the N glycosylation motif in recombinant Der f 1on secretion and protease activity[外文期刊] 2001(04) 15.Boado R J;Ji A;Pardridge W M Cloning and expression in Pichia pastoris of a genetically engineered single chain antibody against the rat transferrin receptor[外文期刊] 2000(06)
毕赤酵母表达实验手册 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。 与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制
xx酵母表达实验手册 （作参考） 部分试剂中英文名称： 小牛肠碱性磷酸酶（CIP）、AOX1（alcohol oxidase，醇氧化酶） 10*YNB（含有硫酸铵、无氨基酸的 13.4%酵母基础氮源培养基） 500*B（ 0.02%生物素Biotin）、100*H（ 0.4%Histidine组氨酸） 10*D（20%Dextrose葡萄糖）、10*M（5%Methanol甲醇） 10*GY（10%Glycerol甘油）、100*AA（ 0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸）、1M磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH 6.0） Sorbitol (山梨醇)、磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer） YEPDM（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基） Minimal Glycerol Medium（最小甘油培养基） YPD培养基的配制： 每（L）液体预混合物（50g/L）终浓度酵母提取物10g250g1%蛋白栋 20g500g2%葡萄糖20g500g2%※注：
配制YPD培养基时，20%（10×）葡萄糖溶液最好采用单独过滤除菌或高压灭菌（在灭菌后再加入到其他各种成分），以免在高压灭菌时培养基变黑并妨碍酵母菌的最佳生长。 ※极限培养基{合成葡萄糖（SD）培养基} 每（L）液体预混合物（50g/L）终浓度YNB-AA/AS 1.7g68g 0.17%（NH 4） 2SO 45g200g 0.5%葡萄糖20g800g2%注： 这种极限培养基可以培养没有特殊营养要求的酵母菌，但更多时候这种培养基是作为一种待添加其他成分的极限培养基（见下文提到的CM省却成分培养基）。 完全极限（CM）省却成分培养基（每L中含）： 省却成分粉剂 1.3g(见表 13.1.1) YNB-AA/AS 1.7g （NH 4）
Pichia酵母表达系统使用心得 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 甲醇酵母部分优点： 1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达； 2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，表达产物可以达到每升数克的水平； 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系 统简单，非常适合大规模工业化生产； 4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化； 5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源，生产成本低。 产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步——构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的
毕赤酵母表达实验手册 作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。 同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。 甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主
毕赤酵母是甲醇营养型，甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛和过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在过氧化物酶体里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 毕赤酵母含有两种醇氧化物酶，AOX1 AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1 基因产物。甲醇可紧密调节、诱导 AOX1 基因的高水平表达，为Mut+菌株，可占可溶性蛋白的 30%以上。AOX2 基因与 AOX1 基因有 97%的同源性，但在甲醇中带 AOX2 基因的菌株比带 AOX1 基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离 Muts 菌株。 毕赤酵母表达外源蛋白：分泌型和胞内表达。利用含有α因子序列的分泌型载体即可。 翻译后修饰：酿酒酵母与毕赤酵母大多数为 N-连接糖基化高甘露糖型，毕赤酵母中蛋白转录后所增加的寡糖链长度（平均每个支链 8-14 个甘露糖残基）比酿酒酵母中的（50-150 个甘露糖残基）短得多。 菌株：GS115 （ Mut+， Muts）和 KM71（Muts） 分泌型载体: pPICZα A,B,and C (5’AOX1启动子，紧密型调节，甲醇诱导表达，α分泌信号介导的分泌表达，Zeocin抗性基因，C端含有6XHis标签) 胞内表达型载体： pPICZ A,B,and C，
一：分子克隆 1.设计引物 分泌型载体图谱： 见酵母表达说明书（p13-pPICZ A，p14-pPICZ B,p15-pPICZ C） 2.PCR扩增基因 PCR反应体系（50μl） 模板DNA 1μl Forward Primer（10μM）1μl Reverse Primer（10μM）1μl dNTP Mixture(各2mM): 4μl 5×PrimerSTAR buffer（Mg2+ plus）10μl PrimerSTAR DNA Polymerase 0.5μl ddH O up to 50μl 2 PCR 反应流程 预变性98℃ 2min 变性98℃ 10sec 退火56℃ 10sec 30个循环 延伸72℃ 30sec 完全延伸72℃ 10min 保存4℃ 3.双酶切及其回收 双酶切反应体系（40μl） DNA(空载体或目的基因) 30μl BamHⅠ 1.5μl XholⅠ 1.5μl 10×Buffer K 4.0μl 4.酶连接 首先利用1%的琼脂糖电泳将双酶切后的PCR产物和载体进行分离,并通过胶回收试剂盒回收，按照目的基因和空载体的碱基摩尔比在1:3--1:9之间，一共吸取目的基因和空载体的总体积为5μl，在加入等量的5μl DNA快速连接试剂盒SolutionⅠ，16℃连接4-6h。 转化到克隆型感受态（DH5α和Top10），使用低盐LB培养基，加入25 μg/ml
毕赤酵母发酵手册 总览 简介： 毕赤酵母和酿酒酵母很相似，都非常适合发酵生长。毕赤酵母在有可能提高总体的蛋白质产量的发酵中能够达到非常高的细胞浓度， 我们建议只有那些有过发酵经验或者能得到有经验的人的指导的人参与发酵。因为发酵的类型很多，所以我们很难为您的个人案例提高详细的过程。下面所给出的指导是基于Mut+和Mut s两种基因型的毕赤酵母菌株在15L的台式玻璃发酵罐中发酵而成。请在您的发酵开始前先阅读操作员手册。下面所给出的表就 发酵参数： 在整个发酵过程中监测和调控下列参数非常重要。下面的表格描述了这些参
设备推荐： 下面是所推荐设备的清单： ·发酵罐的夹套需要在发酵过程中给酵母菌降温，尤其是在甲醇流加过程中。你需要一个固定的来源来提供冷却水（5-10℃）。这可能意味着你需要一个冷冻装置来保持水的冷却。 ·一个泡沫探针就像消泡剂一样不可或缺。 ·一个氧气的来源——空气（不锈钢的发酵罐需要1-2vvm）或者纯氧（玻璃发酵罐需要0.1-0.3vvm）。 ·添加甘油和甲醇的补料泵。 ·pH的自动控制。 培养基的准备： 你需要准确配置下列溶液： ·发酵所需的基本盐类（第11页） ·PTM1补充盐类（第11页） ·75ml的50％的甘油每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甘油。 ·740ml的100％的甲醇每升初始发酵液，12ml的PTM1补充盐每升甲醇。毕赤酵母生长的测定： 在不同的时间点通过测OD600的吸光值和湿细胞的重量来检测毕赤酵母的生长。培养的代谢速率通过通过观察溶氧浓度对应于有效碳源来测定。
溶氧的测定： 简介： 溶解氧的浓度时指氧气在培养基中的相关比例，溶氧100％是指培养基中氧达到饱和。毕赤酵母的生长需要消耗氧气，减少溶解氧的满度。毕赤酵母在生长时会消耗氧气，减少溶氧的程度。然而，因为代谢甲醇的最初阶段需要氧气，所以将溶氧浓度维持在一个适当的水平（＞20％）来确保毕赤酵母在甲醇上的生长就至关重要。准确测定和监测培养中的溶氧浓度将会为您提供关于培养状态和健康程度之类的重要信息。因此，精确校正您的发酵设备非常重要，请查阅您的操作手册。 溶氧浓度的维持： 1、很难依靠发酵罐的氧气转换速率（OTR）将溶氧浓度维持在20％，特别是在 小型的玻璃罐中。在玻璃发酵罐中，通气一般约为0.1-0.3vvm（1L发酵液每分钟1L氧气）来提供氧气使DO保持在20％。氧气消耗的变化依赖于所添加的甲醇的总量和蛋白质的表达。 2、在通气为0.1-0.3vvm时，氧气可达到足够的水平，这在许多玻璃发酵罐中可 以通过通入无菌空气来实现。在不锈钢发酵罐中，压力可增加OTR（与K L a 有关）。 3、如果一个发酵罐不能提供足够水平的氧气，甲醇的添加需要因此适当降低。 请注意降低甲醇的总量可能导致蛋白质表达水平的降低。 4、为了使蛋白质表达水平达到最大，发酵时间应被分割来以较低的流加速度添 加相似水平的甲醇。对许多重组蛋白质来说，可以观察到甲醇消耗的总量和蛋白质产生的总量有直接的关系。 DO测量的用处： 在毕赤酵母生长阶段，消耗氧气而使DO浓度维持在较低水平。请注意不管是在甘油或甲醇中生长，都要消耗氧气。DO浓度可用来衡量代谢速率和碳源是否受抑制，代谢速率则是培养健康程度的一个指标。如果你希望能够完全的诱导AOX1启动子，确定碳源是否受抑制就非常重要。例如：DO浓度的改变可让你确定是否在添加甲醇前所有的甘油都已耗尽，其次还可以确定甲醇流加的速率是否超过消耗的速率。过多的甲醇（＞1-2％vvm）可能会产生毒害。 DO的调控： 如果碳源受到抑制，关闭碳源的添加将会导致培养理工甲醇的速率降低，DO值会上升。终止碳源的添加，观察在碳源的流加关闭后需要多长时间来使DO值上升10％。如果延迟时间很短（＜1min），说明碳源受抑制。
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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。 表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分 制作者：陈苗商汉桥
CHO细胞表达系统与酵母细胞表达系统比较 CHO细胞表达系统与毕赤酵母表达系统是当前发展前景看好的两个表达系统，为了能够更加直观地对两个表达系统有一定的认识，特意在此篇中对两个表达系统作一定的比较，从而能够更进一步的对两个表达系统有更深的了解 1．CHO细胞表达系统 （1）优点 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM 中生长良好。与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点： (1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子； (2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力； (3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定； (4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化； (5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。 （2）存在的问题 在过去的几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大进展，但是利用CHO细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求，目前上游工作中主要存在以下问题： ①构建的重组CHO细胞生产效率低，产物浓度亦低； ②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化； ③重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达，而对高教表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较少； ④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。 2．毕赤酵母细胞表达系统 （1）特点 自1987年Gregg等首次在毕赤酵母中表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)到1995年，已有四十多种外源蛋白在毕赤酵母宿主菌中获得表达。而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种，且一年比一年多，与其它表达系统相比，毕赤酵母表达系统具有以下优势： 1）含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达； 2）表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。毕赤酵母中，报道的最高表达量为破伤风毒素C为12g/l，一般大于1g/l。绝大多数外源基因比在细菌、酿酒酵母、动物细胞中表达水平高。一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列，使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化； 3）发酵工艺成熟，易放大。已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达100g/l 以上，表达重组蛋白时，已成功放大到10000升； 4）培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲
毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒 用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白 综述： 基本特征： 作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。 与酿酒酵母相似技术： 许多技术可以通用： 互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。 毕赤酵母是甲醇营养型酵母： 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 两种醇氧化酶蛋白： 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码 的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带 的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型： 缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。 蛋白胞内及分泌表达： 外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分
作者：非成败 作品编号：92032155GZ5702241547853215475102 时间：2020.12.13 毕赤酵母表达系统 Mut+和Muts 毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶——AOX1及AOX2，细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物，甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长(去抑制)时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。在YPD(酵母膏、蛋白胨、葡萄糖)培养基中，不论是Mut+还是Muts其在对数期增殖一倍的时间大约为2h。Mut+和Muts菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率是一样的，存在甲醇的情况下，Mut+在对数期增殖一倍的时间大约为4至6个小时，Muts在对数期增殖一倍的时间大约为18个小时。 菌株GS115、X-33、KM71和SMD1168的区别 GS115、KM71和SMD1168等是用于表达外源蛋白的毕赤酵母受体菌，与酿酒酵母相比，毕赤酵母不会使蛋白过糖基化，糖基化后有利于蛋白的溶解或形成正确的折叠结构。GS115、KM71、SMD1168在组氨酸脱氢酶位点(His4)有突变，是组氨酸缺陷型，如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主菌的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子。这些受体菌自发突变为组氨酸野生型的概率一般低于10-8。GS115表型为Mut+，重组表达载体转化GS115后，长出的转化子可能是Mut+，也可能是Muts(载体取代AXO1基因)，可以在MM和MD培养基上鉴定表型。SMD1168和GS115类似，但SMD1168基因组中的Pep4基因发生突变，是蛋白酶缺陷型，可降低蛋白酶对外源蛋白的降解作用。 其中X-33由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而X33与GS115一样都是属于MUT＋表现型，也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有影响， KM71的亲本菌在精氨酸琥珀酸裂解酶基因(arg4)有突变，在不含精氨酸的培养基中不能生长。用野生型ARG4基因(约2kb)插入到克隆的野生型AOX1基因的BamHI(AOX1基因15/16密码子)及SalI(AOX1基因227/228密码子)位点，取代了AOX1基因16-227密码子，此结构转化至KM71亲本菌(arg4his4)中，分离产生KM71 MutsArg+His-菌株，Arg+转化子遗传分析显示野生型AOX1被aox1::ARG4结构所取代，所以KM71所有转化子都是Muts 表型。AOX1位点没有被完全缺失，理论上可用你的目的结构通过基因取代方法替换
毕赤酵母表达经验总结 甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，生物通编者特地收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。 甲基酵母部分优点与其他真核表达系统比较与原核表达系统比较 1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达优点-+ 2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，可以达到每升数克表达产物的水平++++ 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产。+++= 4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化。=+ 5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以甲醇等工业产物替代葡萄糖作为碳源，生产成本低++++ + 表示优胜于；- 表示不如；= 表示差不多 EasySelect Pichia Expression System 产品性能： 优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化 缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题 全面产品报告及心得体会： 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。 毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以增加表达，并且在表达后α-factor 可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。 第一步——构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。 红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用 抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的时间了。 基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等情况后，当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上，我的表达蛋白有些恐怖，有100KD，本来当然应该放在大肠杆菌中表达，但是为了分泌表达（其实后来发现大肠杆菌pET系列分泌表达系列也不错）和糖基化修饰（主要是这个方面，因为我的蛋白是人源的，表达出来用于酵母双杂，因此需要有完备的糖基化修饰）。这样我的DNA片段由于较长，所以在做克隆的时候也要非常小心，需要注意的是： ①酶切位点不能出现在目的DNA片段中——如果片段长无法避免，可以采用平末端连接； ②虽然α-factor可以自动切除，但是在设计表达的时候，如果在N端不能出现任何多余的aa（比如药物蛋白表达），需要特别留意（说明书上有详细说明：P13）； ③有三种不同的读码框（对于pPICZα系列来说就是对上α-factor序列），在设计克隆的时候要反复确
文章编号:100128751(2002)0620246205 巴斯德毕赤酵母表达系统 唐元家 余柏松 综述(中国医药集团四川抗菌素工业研究所, 成都610051) 摘要: 巴斯德毕赤酵母表达系统在DNA 重组技术中得到越来越广泛的应用。该酵母具有独特的生物学特性,作为真核表达系统,具有严格调控外源蛋白的表达,加工修饰表达产物,表达量高,营养要求低等优点;在该表达系统中,主要有3种表达宿主菌,其载体包括整合型载体和自我复制型游离载体,其转化和表达比大肠埃希氏菌系统复杂;巴斯德毕赤酵母中表达产物可分泌至胞外,从而获得较高表达量和利于表达产物的分离纯化。 关键词: 巴斯德毕赤酵母; 外源蛋白; 表达中图分类号: Q816 文献标识码: A 收稿日期:2001209227 修订日期:2002206215 作者简介:唐元家,男,生于1975年,在读硕士研究生,主要从事基因工程药物的研究。 余柏松,男,生于1957年,硕士,研究员,主要从事生物药物的研究及开发。 基因工程技术的发展为生物体生产外源蛋白展示 了广阔的前景。到目前为止,已发展了多种蛋白质表达系统,比如大肠埃希氏菌表达系统,酵母表达系统,高等真核细胞表达系统等。长期以来,人们用大肠埃希氏菌作为宿主表达了多种蛋白。这是因为大肠埃希氏菌具有若干优点,如遗传背景和生化特性清楚,容易操作,生长迅速,营养要求简单等。但这一系统本身也存在若干缺陷:(1)缺少真核生物的蛋白翻译后的修饰和加工,如剪切、糖基化、形成二硫键等;(2)表达的蛋白多形成不溶性包含体,需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性;(3)背景蛋白很多,纯化麻烦;(4)表达量一般不是很高。从1979年开始,为了克服大肠埃希氏菌表达系统的缺点,发展了酵母表达系统。最先使用的是酿酒酵母,它具有繁殖速度快,能高密度发酵,可以进行蛋白质翻译后的修饰和加工等优点。1981 年Hitzeman 等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功〔1〕 。 此后用该系统还表达了其它多种原核和真核蛋白,但酿酒酵母系统也具有局限性,如缺乏强有力的启动子, 分泌效率差,表达菌株不够稳定,表达质粒易于丢失等。有鉴于此,人们发展了新一代的酵母表达系统———巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris )表达系统,即甲醇酵母表达系统。 1 巴斯德毕赤酵母表达系统的优点 巴斯德毕赤酵母表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统,有许多其它蛋白表达系 统所不具备的优点。(1)具有强有力的乙醇氧化酶(AOX1)基因启动子,可严格调控外源蛋白的表达;(2) 作为真核表达系统,可对表达的蛋白进行加工折叠和 翻译后修饰,。比如,用原核表达系统表达人组织型基质金属蛋白酶抑制剂(TI MP ),虽然获得了大量重组蛋白,但是由于重组蛋白形成包含体,难以使TI MP 分子内的6对二硫键正确折叠配对,始终未能得到有活性的全长分子。李克勤等用巴斯德毕赤酵母表达系统获得了分泌型前正 确折叠的TI MP 21,重组蛋白的表达量达40mg/L 〔2〕 ;(3)营养要求低,生长快,培养基廉价,与昆虫、哺乳动物等高等真核细胞相比,巴斯德毕赤酵母易于进行操作和培养。巴斯德毕赤酵母对需氧生长有强的偏好,这一生理学特性使得它既能高密度发酵生长,亦有利于工业放大生产;(4)表达量高。酿酒酵母中表皮生长因子(EG F )的表达量为714mg/L ,而在巴斯德毕赤酵母中的表达量为450mg/L ,表达量提高约60倍。许多蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达量可达到g/L 以上水平,如 破伤风毒素C 片段表达量达12g/L 〔3〕 ,Heva brasiliensis 羟腈裂合酶的表达水平高达22g/L 〔4〕 ;(5)在巴斯德毕 赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内,又可分泌到胞 外。由于巴斯德毕赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少和培养基中不含其他的蛋白质,这样分泌的外源蛋白占了培养液中总蛋白的绝大部分,因此十分有利于外源蛋白的分离和纯化,如表达的重组水蛭素 (HIR ),仅经过二步层析纯化,纯度高达97%以上〔5〕 ,表达的人重组白细胞介素经过疏水层析、离子交换和 凝胶过滤三步纯度即可达到99%〔6〕 ;(6)外源基因能通过质粒整合到巴斯德毕赤酵母基因组上,这样得到